通过化学工程方法制备的PNA介导的锁式探针组装和滚环扩增技术，实现单核苷酸多态性的精确检测

《Analytica Chimica Acta》：Precision Discrimination of Single Nucleotide Polymorphisms via Chemically Engineered PNA-Mediated Padlock Probe Assembly and Rolling Circle Amplification

　　

杨昭|吴书瑶|袁晓军|赵超

中国浙江省宁波市宁波大学科学技术学院农业种质资源挖掘与环境调控关键实验室，邮编315300

摘要

在基因组DNA中高灵敏度和特异性地检测单核苷酸多态性（SNPs）对于疾病诊断和个性化医学具有重要意义。本文开发了一种荧光方法，在生理条件下通过结合肽核酸（PNA）导向的锁链探针组装技术和滚环扩增（RCA）技术，实现对混合序列KRAS双链DNA（dsDNA）中SNPs的高选择性检测。该方法的核心是利用吖啶连接的环戊烷PNA（Acr-PNA_cyp4）选择性地打开dsDNA，随后进行锁链探针的杂交和RCA扩增。通过PNA分子信标（PNA MB）探针检测RCA扩增产物。利用PNA介导的链入侵（PMSI）和连接反应的高特异性以及RCA技术的强大扩增能力，该方法能够在低至0.66 fM的浓度下准确检测目标dsDNA，从而有效区分不同类型的突变。此外，该方法已成功应用于结肠癌细胞中KRAS突变的检测，证实了其在生物样本中的实用价值。该方法不需要复杂的热循环设备，强调了其在临床环境和资源有限条件下检测低丰度疾病相关突变的潜力。

引言

能够进行稳健和精确核酸鉴定的分析策略是现代分子诊断的基石[1]。通过确定导致基因组变异的单核苷酸多态性（SNPs），基因分型方法有助于开发个性化的治疗干预措施，并评估个体对各种病理的易感性或抵抗力[1]，[2]，[3]。这种诊断信息通常是通过定性和定量评估已建立的遗传变异获得的。新兴证据表明，罕见的、与肿瘤相关的SNP变异作为关键生物标志物，能够实现恶性肿瘤的早期识别和长期监测[4]，[5]，[6]。因此，开发具有卓越灵敏度和选择性的SNP分析平台对于提高早期诊断准确性、实施预防策略和优化临床预后评估至关重要[7]。

在过去的几十年中，已经建立了一系列用于敏感和特异性检测SNPs的技术，如PCR扩增、下一代测序、DNA微阵列和荧光原位杂交（FISH）[8]，[9]，[10]，[11]，[12]。尽管这些方法有效，但它们常常受到高设备成本和耗时实验流程的限制。这一限制主要源于大多数序列特异性识别策略依赖于互补单链DNA（ssDNA）的选择性杂交，而这一过程通常需要先将双链DNA（dsDNA）热变性[1]。因此，开发能够在生理条件下介导局部链入侵或解旋dsDNA的试剂具有显著简化分析工作流程的潜力，尤其是在基础设施有限的环境中提供更高效和便捷的诊断解决方案。

肽核酸（PNA）是DNA和RNA的人工结构类似物，在通过沃森-克里克碱基配对促进序列特异性识别方面发挥了关键作用[13]。越来越多的证据表明，多种化学改性的PNA能够以高序列特异性和亲和力结合双链DNA（dsDNA）[14]。值得注意的例子包括含有二氨基嘌呤-硫尿嘧啶碱基对的伪互补PNA[15]；链长度为15到20个核苷酸的手性γ-PNA[16]；C末端带有吖啶基团的γ-PNA[17]；含有G-Clamp核苷酸类似物的γ-PNA[18]；基于吡咯烷的PNA（acpcPNA）[19]；以及与核定位肽SV40结合的PNA[20]。在一个特别重要的进展中，Smolina及其同事最近报道了一种基于FISH的策略，可以在单核苷酸分辨率下实时检测人类基因组DNA中的单拷贝序列[21]。该方法使用一对富含嘧啶的双PNA（称为PNA开件）诱导dsDNA的局部链入侵，随后进行锁链探针的杂交和滚环扩增（RCA）。该技术的显著优势之一是它适用于未变性的DNA，特别适合涉及DNA、RNA和蛋白质的共定位研究。然而，目前这种方法的实施主要限于富含嘌呤或嘧啶的目标区域，因为混合序列PNA通常缺乏在生理条件下有效入侵双链DNA所需的动力。

为了克服这一根本限制，使PNA能够在非变性条件下入侵混合序列dsDNA并保持目标特异性，本研究首次提出了一种基于PNA介导的链入侵（PMSI）的荧光检测方法，用于检测嵌入混合序列环境中的dsDNA目标中的SNPs，特别是KRAS基因中的SNPs。该方法使用吖啶连接的环戊烷PNA（Acr-PNA_cyp4，图S1）来促进局部链入侵，从而暴露出可与锁链探针杂交的单链区域。随后的连接和RCA生成扩增产物，然后通过PNA分子信标（PNA MB）探针进行可视化（示意图1）。

我们之前的研究表明，将环戊烷基团引入PNA骨架显著提高了与互补DNA形成的双链结构的稳定性。此外，观测到引入的环戊烷单元数量与所得PNA-DNA杂交物的热稳定性之间存在直接关系[22]。在本研究中，我们首次证明含有四个环戊烷修饰的Acr-PNA_cyp4能够通过直接的沃森-克里克碱基配对特异性地入侵来自KRAS基因的混合序列双链DNA。这一入侵过程在生理温度条件下高效进行，并在30分钟内完成。此外，我们确定基于PNA的分子信标（PNA MB）在降低背景信号干扰和减少假阳性结果的风险方面优于传统的基于DNA的分子信标（DNA MB）[23]。重要的是，PNA MB设计中采用的双端标记不会影响其与目标序列的杂交动力学，从而保持并提高了整个检测的灵敏度。

作为RAS家族中的基本原癌基因，KRAS基因编码一种小型GTP酶蛋白，该蛋白调控包括增殖、分化、抗凋亡和血管生成在内的基本细胞过程[24]，[25]。在人类恶性肿瘤中，KRAS是最常发生突变的癌基因之一，在多种癌症类型中突变率显著升高，尤其是在大约90%的胰腺腺癌、30-40%的结肠直肠肿瘤、17%的子宫内膜癌和15-20%的肺癌中[26]，[27]。值得注意的是，大约97%的KRAS突变集中在编码位点12和13，其中G12D、G12V和G13D是最常见的变异类型[28]。这些突变损害了KRAS蛋白的固有GTP水解活性，导致其通过持续结合GTP而持续激活。因此，下游信号级联反应持续活跃，促进不受控制的细胞增殖和迁移，最终推动肿瘤进展[29]，[30]。从临床角度来看，结肠直肠癌患者中KRAS的突变状态已被验证为预测其对西妥昔单抗（一种针对表皮生长因子受体EGFR的治疗性单克隆抗体）反应的有效生物标志物[31]。因此，确定KRAS的突变状态是识别可能从抗EGFR靶向治疗中受益的结肠直肠癌患者的必要前提。

在这项研究中，以KRAS基因突变为例，我们评估了该检测方法在低丰度SNP检测中的性能，以及在同一密码子中检测多个SNPs的能力。此外，我们还探讨了将我们的检测方法与PCR扩增结合用于SNP检测的可行性，以展示其在临床应用中的潜力。我们相信这种通用且高保真的SNP检测系统将在分子诊断和临床研究中具有广泛的应用前景。

部分摘要

材料与试剂

所有Fmoc保护的PNA单体均购自PANAGENE公司（韩国大田）。环戊烷修饰的PNA单体（T_cyp）是根据已建立的合成方案制备的[32]。用于PNA合成的试剂来自Macklin Biochemical Technology有限公司（中国上海）。本研究中使用的所有DNA寡核苷酸均由Sangon Biotech有限公司（中国上海）定制合成。目标dsDNA的详细序列如下：

吖啶连接环戊烷-PNA对dsDNA的链入侵

我们之前已经证明，将环戊烷基团引入PNA骨架（如图1A所示）显著提高了PNA-DNA双链结构的稳定性。此外，环戊烷基团的数量增加与所得双链结构的熱稳定性提高相关[22]。统计分析表明，每个引入PNA链的环戊烷基团大约使熔解温度升高5°C。

结论

总之，本研究报道了一种基于荧光的分析平台，用于在生理相关条件下通过吖啶连接的环戊烷PNA探针序列选择性识别KRAS dsDNA中的SNPs。这种探针设计能够靶向入侵嵌入混合序列环境中的双螺旋DNA区域。通过协同结合PNA的固有序列选择性和链置换能力...

CRediT作者贡献声明

赵超：概念构思、正式分析、资金获取、方法学设计、项目管理、资源协调、软件使用、监督、数据可视化、撰写及审稿编辑。杨昭：数据整理、正式分析、实验设计、方法学实施、初稿撰写。吴书瑶：数据整理、正式分析、实验设计、方法学应用。袁晓军：实验实施、方法学验证

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的报告。

数据可用性

数据将应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的报告。

致谢

本研究得到了宁波市自然科学基金（项目编号：2025J144）和宁波大学的资助。