利用表面等离子体共振显微技术（SPRm）实时观察抗菌脂质体与活表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的相互作用

《Biosensors and Bioelectronics: X》：Accessing real-time interaction between antimicrobial liposomes and live Staphylococcus epidermidis using surface plasmon resonance microscopy

　　

摘要 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis, SE）是一种革兰氏阳性菌，是医疗保健相关感染（Healthcare-Associated Infections, HAIs）的主要病原体，这主要归因于其在医疗器械上形成生物被膜（biofilms）的能力以及对多种抗生素的耐药性。胆固醇亚油酸酯（Cholesteryl Linoleate, CL）是一种由上皮细胞分泌的脂质，已被证明对SE具有抗菌作用，但其与细菌相互作用的机制仍不清楚。在本研究中，研究人员开发了一种表面等离子体共振显微技术（Surface Plasmon Resonance Microscopy, SPRm）方案，用于实时观察在磷脂（Phospholipid, PL）中配制的CL脂质体（CL-PL liposomes）与活的稳定期SE细胞之间的相互作用。缓冲液对照实验表明，在整个SPRm操作过程中，细菌均保持存活。研究结果证明，CL能直接结合到SE的表面，并且CL-PL与SE的结合是浓度依赖性的，其结合程度远高于仅含PL的脂质体。结合过程并非均匀，而是在不同的SE细胞区域间存在差异，一些区域显示强结合，而另一些则结合较弱，这符合对稳定期细菌存在异质性种群的预期。这项工作支持进一步探索CL及类似脂质用于治疗由SE和其他与HAIs相关的病原体引起的抗生素耐药性感染，并提出了一种能够区分活细菌种群内异质性的、研究抗菌活性的新方法。

研究背景与动机

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis, SE）是皮肤和黏膜表面的常见共生菌，但也是导致医疗相关感染（HAIs）的重要病原体，特别是在与医疗器械（如导管）相关的血流感染中占约30%。其核心威胁源于两大因素：一是能在塑料医疗器械表面形成坚固的生物被膜（biofilms），二是常表现出显著的抗生素耐药性，这使得传统治疗方法效果有限。因此，开发对抗SE感染的新策略至关重要。利用宿主的天然防御机制是潜在方向之一。先前研究发现，上皮细胞分泌的脂质，包括胆固醇酯（cholesteryl esters），具有抗菌活性，其中胆固醇亚油酸酯（Cholesteryl Linoleate, CL）已被证实可抑制SE生长。然而，CL如何与活SE相互作用的细节仍不清楚。为了深入探究其作用机制，研究人员需要一种能够在单细胞水平、实时、无标记地观察分子相互作用的工具。表面等离子体共振技术（Surface Plasmon Resonance, SPR）是研究分子相互作用的强大光学技术，但传统SPR平均整个样品的信号，缺乏空间分辨率。表面等离子体共振显微技术（Surface Plasmon Resonance Microscopy, SPRm）将SPR与显微成像结合，可实现对特定结合位点的可视化，检测样品异质性，为研究抗菌剂与活细菌的相互作用提供了理想平台。

研究目的

本研究旨在利用SPRm，在单细胞水平探索CL与活SE之间的实时相互作用，以阐明其结合动力学、浓度依赖性和空间异质性，为开发基于CL的新型抗菌疗法提供理论基础和技术支持。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键实验技术：

1. 1.
   细菌固定与表征：对金SPRm传感芯片进行双层修饰（1-十二硫醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷），以实现SE的稳定固定。通过扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和光学显微镜对固定化细菌的形态、密度和高度进行了表征，以确保其在SPRm检测深度内。
2. 2.
   细菌活力验证：采用含三苯基四氮唑氯化物（tetrazolium chloride）的琼脂培养基，在SPRm流程前后评估固定化SE的代谢活性，证实细菌在整个缓冲液流程中保持存活。
3. 3.
   脂质体制备：采用干脂质膜水化技术制备了仅含磷脂（PL）的脂质体以及含有CL的磷脂脂质体（CL-PL），并通过动态光散射和高效液相色谱（HPLC）对其大小、zeta电位和CL包封率进行了表征。
4. 4.
   SPRm实时监测：将固定有SE的传感芯片安装于SPRm系统，在流动池中依次注入不同浓度的PL或CL-PL脂质体样品。系统记录并分析由细菌-脂质体相互作用引起反射光强度变化的实时图像和传感图（sensorgrams）。
5. 5.
   数据量化与统计分析：从SPRm图像序列中提取感兴趣区域（Regions of Interest, ROIs）的信号响应单元。通过小提琴图（violin plots）可视化结合活性的分布和变异性，并使用独立样本t检验和单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学显著性检验。部分数据还应用1:1动力学结合模型进行拟合，以获取结合速率常数（k_a）、解离速率常数（k_d）和平衡解离常数（K_D）。

研究结果

3.1. 固定、表征与活力

通过双层化学修饰成功实现了SE在传感芯片上的稳定固定。SEM和AFM图像显示细菌在芯片表面形成约70%汇合度的单层，其平均高度为639 ± 62 nm，确保了其大部分体积位于SPRm高度敏感的倏逝场（evanescent field）检测深度内。活力测试证实，经过完整的SPRm流程后，细菌仍保持代谢活性，为后续实时相互作用研究奠定了基础。

3.2. SPRm监测脂质体与活SE的相互作用

通过SPRm实时监测了PL和CL-PL脂质体与固定化SE的相互作用。研究发现：

• •
  浓度依赖性结合：CL-PL脂质体与SE的结合呈现出明显的浓度依赖性，而仅含PL的脂质体结合信号非常微弱。这表明结合作用主要源于CL成分。
• •
  空间异质性：CL-PL的结合信号在SE沉积区域内部呈现不均匀分布。在细菌密度较低的内部区域（ROIs i, ii）观察到显著的结合/解离动力学曲线，而在边界高密度堆积区域（ROIs iii, iv）信号变化极小，这可能是由于多层细菌阻碍了SPRm敏感场的穿透。
• •
  统计学显著性：量化分析表明，细菌覆盖区域对CL-PL的响应显著高于背景区域，且CL-PL处理组与缓冲液或PL处理组之间存在统计学显著差异。小提琴图进一步揭示了细菌群体内部对CL-PL响应的广泛分布，凸显了种群异质性。
• •
  可重复性与顺序影响：在另一项注射顺序相反的独立实验中，尽管总体信号强度较低（可能由于细菌覆盖率较低），但最高浓度的CL-PL（CL-PL3）仍能引起细菌区域与背景区域的显著差异，且细菌区域信号分布更广，再次证实了CL-PL的特异性结合和群体异质性。

3.3. 动力学分析

对传感图进行1:1 Langmuir结合模型拟合，以探究相互作用的动力学参数。结果显示：

• •
  细菌特异性结合：绝大多数有效的动力学拟合区域都位于细菌沉积区域内，而PL注射几乎未产生有效的拟合区域，证实了观察到的结合是CL驱动的、细菌特异性的。
• •
  动力学参数与异质性：提取的结合速率常数（k_a）、解离速率常数（k_d）和平衡解离常数（K_D）均在微摩尔（μM）量级，表明这是一种相对较弱的相互作用（相较于纳摩尔级别的抗体-抗原结合）。散点图显示这些动力学参数在有效ROIs间分布广泛，揭示了结合事件在空间上的显著异质性。a), dissociation rate constant (k_d), and equilibrium dissociation constant (K_D) are fitted with Gaussian distributions to determine mean values and 95% confident intervals (CI).">

讨论与结论

讨论总结

本研究首次将SPRm应用于研究抗菌脂质体与活SE的实时相互作用。与传统的、只能提供平均信号的SPR光谱技术相比，SPRm的成像能力使得能够在空间上分辨样品不同区域的结合/解离动力学，从而区分出明确覆盖细菌的区域与背景区域，并监测细菌群体内的异质性。结果证实了CL-PL脂质体特异性地在SE表面积累，且结合具有浓度依赖性。信号在细菌沉积区域内存在巨大差异，反映了相互作用的异质性，这与SE处于稳定期生长阶段（以细胞代谢活性和基因表达的异质性为特征）的特性相符。这种在群体水平上捕捉异质性的能力，对于研究抗菌药物耐药性等机制尤为重要。该研究建立的协议（包括细菌固定、活力验证和SPRm分析）为未来在单细胞水平上研究抗菌剂与病原体的相互作用提供了有力工具。未来工作可将SPRm与AFM等表面表征技术结合，以进一步剖析细菌表面的形态变化；或整合电化学检测通道，监测过程中产生的活性分子；利用基因修饰的细菌，有助于深入阐明抗菌药物和宿主防御分子的作用机制。

研究结论

本研究首次建立了利用表面等离子体共振显微技术（SPRm）研究抗菌脂质体与活表皮葡萄球菌（SE）实时相互作用的方案。SPRm的成像能力实现了对样品跨空间相互作用的结合/解离动力学的分辨检测，从而可以监测明确覆盖细菌区域与背景区域之间的差异以及细菌群体内的异质性。研究人员成功证明了CL-PL脂质体特异性地在SE表面积累。在细菌沉积区域也观察到了巨大的信号差异，表明相互作用的异质性，这是传统技术无法研究的。此外，成功开发了一种涉及将SPRm传感芯片置于含四氮唑盐琼脂上的新方案，以确保SPRm过程本身不会对固定化细菌的活力产生负面影响。对于未来的工作，SPRm系统可以与原子力显微镜（AFM）等表面表征技术结合，以进一步解析细菌表面的形态变化。该系统本身可以通过额外的检测通道进行升级，例如对过程中产生的活性分子进行电化学检测。此外，使用基因修饰细菌可能有助于抗菌药物和宿主防御分子的机制研究。总体而言，这项工作提出了一种能够区分活细菌群体内异质性的、研究抗菌活性的新方法。