通过全基因组代谢建模技术改造的大肠杆菌提高了L-岩藻糖的产量

《PLOS One》：Enhanced production of l-fuculose by Escherichia coli engineered via genome-scale metabolic modeling

　　摘要：L-岩藻糖是一种罕见的脱氧酮己糖，是L-岩藻糖的结构异构体，具有美白、保湿和抗衰老的功效。由于其结构相似性，L-岩藻糖也被认为可能带来潜在的健康益处。然而，L-岩藻糖在自然界中仅以微量存在，因此从天然来源中提取几乎是不可能的；到目前为止，它主要通过酶促转化来合成。然而，这种方法存在重大限制：底物（L-岩藻糖）和参与的酶（L-岩藻糖异构酶）成本较高；由于化学平衡的存在，酶促反应无法实现完全转化；并且从含有L-岩藻糖和L-岩藻糖的反应混合物中纯化L-岩藻糖的方法效率低下且不经济。微生物细胞工厂已被探索作为L-岩藻糖生物合成的替代途径，但其生产水平仍然非常低，限制了其工业应用。在本研究中，通过重新定向L-岩藻糖的代谢途径，我们在大肠杆菌中构建了一个微生物细胞工厂。通过过表达fucA，使乳酸醛和二羟基丙酮磷酸进行醛缩合生成L-岩藻糖-1-磷酸，随后通过糖磷酸酶将其去磷酸化得到L-岩藻糖。为了防止底物和产物被引入竞争性途径，删除了fucI、fucK、tpiA、fucO和aldA基因。最终的工程菌株产生了50.25±4.30 mg/L的L-岩藻糖，比以往通过微生物生物合成的水平提高了32.4倍。这项研究为L-岩藻糖的工业生产奠定了基础，后者在化妆品、功能性食品和制药领域具有潜在的应用价值。

引言：L-岩藻糖是一种属于脱氧酮己糖家族的稀有糖类，是L-岩藻糖的结构异构体，后者是黏蛋白的组成部分[1,2]。L-岩藻糖具有多种促进健康的特性，包括美白、保湿和抗衰老效果[3–5]。鉴于它们的结构相似性，预计L-岩藻糖也具有类似的分子功能[3]。L-岩藻糖在肠道微生物群的L-岩藻糖代谢途径中起着重要作用[6–8]。除了在微生物能量生产中的作用外，它还参与生理过程，如黏蛋白结合、定植、鞭毛代谢和碳水化合物利用[9]。例如，L-岩藻糖-1-磷酸可以激活参与核糖代谢的基因表达，从而支持微生物的生长和活性[10]。这些观察表明L-岩藻糖具有潜在的健康益处，并可能作为调节肠道微生物生理的信号分子。尽管具有这些有前景的特性，但由于其生产的挑战，L-岩藻糖的研究和应用受到了阻碍。L-岩藻糖在自然界中仅以微量存在，从天然来源中提取几乎是不可能的[3]。迄今为止，大多数L-岩藻糖的生产策略依赖于使用L-岩藻糖异构酶（FucI）的酶促转化[3,11,12]。然而，这种方法有显著的缺点：底物（L-岩藻糖）和异构酶成本昂贵；反应受化学平衡的限制，无法实现L-岩藻糖向L-岩藻糖的完全转化（平衡时L-岩藻糖的比例约为62.8%，L-岩藻糖为28.2%）；并且从反应混合物中分离和纯化L-岩藻糖的过程劳动强度大且不经济。另一种方法是重新定向L-岩藻糖的代谢途径进行生物合成。在这个途径中，乳酸醛（LAD）和二羟基丙酮磷酸（DHAP）可以通过L-岩藻糖-1-磷酸醛缩酶（FucA）缩合生成L-岩藻糖-1-磷酸，然后通过糖磷酸酶去磷酸化得到L-岩藻糖。酵母曾被用作宿主，葡萄糖和LAD与FucA和FucI结合使用来生产L-岩藻糖[1]。然而，这种方法仅产生了微量的L-岩藻糖（1.55 mg/L），而L-岩藻糖（7.75 mg/L）的共生产进一步复杂化了下游纯化过程。为了克服这些限制，在当前研究中，我们在最常用的工业微生物之一大肠杆菌中构建了一个微生物细胞工厂，通过重新定向L-岩藻糖的代谢途径来生产L-岩藻糖。具体来说，通过过表达fucA增强了L-岩藻糖-1-磷酸的合成，随后通过糖磷酸酶将其去磷酸化生成L-岩藻糖。通过删除fucI、fucK、tpiA、fucO和aldA基因消除了竞争性代谢途径。这项研究建立了一种新的代谢工程策略，实现了L-岩藻糖的高效和经济性生物合成，为其在化妆品、功能性食品和制药领域的应用奠定了基础。

材料与方法：
- 基因组规模代谢模型（GEM）分析：使用大肠杆菌模拟L-岩藻糖-1-磷酸的生产。GEM分析使用了核心的大肠杆菌代谢模型来模拟生长[13]。该模型包括以下反应以促进L-岩藻糖的生产：L-岩藻糖转运、L-岩藻糖生产、L-岩藻糖磷酸酶、L-岩藻糖激酶、L-岩藻糖-1-磷酸醛缩酶、1,2-PDO氧化还原酶和1,2-PDO转运。分析使用MATLAB（版本R2019b）和Cobra Toolbox（版本2.37.3）[14]。

- 突变体构建：为了从MG1655菌株的基因组中选择性地去除目标基因，进行了单步基因敲除[15]。本研究中使用的引物在S1表中有说明。除了与卡那霉素抗性 cassette质粒pKD4同源的20 bp退火区域外，还包含了目标基因两侧序列的50 bp。纯化的聚合酶链反应（PCR）产物被电穿孔进入已经转化了λ Red重组酶表达载体pKD46的MG1655菌株中，该载体具有热不稳定性起始点。为了促进电穿孔片段的重组，在30°C下用50 mM阿拉伯糖处理MG1655细胞以诱导λ Red重组酶的表达。将PCR片段转化到含有pKD46的MG1655后，细胞在37°C下的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。在37°C下培养卡那霉素抗性转化体以诱导热不稳定的pKD46质粒的丢失。通过PCR检测确认pKD46质粒的丢失。最终敲除的菌株通过PCR检测目标基因的缺失和卡那霉素 cassette的存在。

- pCDF-fucA质粒的构建：使用引物对fucA F/fucA R通过PCR扩增fucA片段。扩增的PCR片段设计在两端有15个碱基对的同源性序列。使用NdeI/XhoI限制性内切酶将pCDF Duet-1质粒线性化。然后使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech，Mountain View，CA，美国）将PCR片段与质粒DNA融合，生成pCDF–fucA。具体来说，In-Fusion克隆反应使用了200 ng PCR片段、150 ng线性化的质粒DNA、2.0 μL 5× In-Fusion HD酶预混液和双蒸水（ddH2O），最终体积为10 μL。反应混合物在50°C的水浴中孵育15分钟，然后置于冰上以转化感受态的DH5α大肠杆菌细胞。使用引物对pCDF V-F/V-R对pCDF–fucA质粒进行菌落PCR检测，随后进行测序。

- 培养条件：工程化的大肠杆菌菌株在含有17 mL LB培养基（添加了10 g/L葡萄糖、5 mM LAD和50 μg/mL链霉素）的50-mL带挡板烧瓶中培养。培养在30°C下，以180 rpm的速度摇动。使用0.2 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷诱导基因表达。

- 细胞外代谢物分析：使用Agilent 1100 HPLC系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）定量细胞外代谢物，包括葡萄糖、LAD、1,2-丙二醇（1,2-PDO）和乙酸，该系统配备了折射率检测器和Aminex HPX-87H有机酸柱（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）。色谱分离在65°C下进行，流动相为0.01 N H?SO?，流速为0.6 mL/min。d-葡萄糖、LAD、乙酸和1,2-PDO的保留时间分别为8.8、12.9、14.8和17.1分钟。定量使用从真实分析标准品生成的校准曲线。

- L-岩藻糖的鉴定和定量：为了鉴定和定量L-岩藻糖，使用气相色谱-质谱（GC/MS）分析经过衍生化步骤（如甲氧基化和硅烷化）后的L-岩藻糖标准品和工程化大肠杆菌培养物的上清液。对于甲氧基化，向干燥的代谢物样品中加入20 μL盐酸甲氧胺溶液（40 mg/mL的吡啶溶液），然后在30°C下孵育90分钟。随后通过加入50 μL N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺进行硅烷化，然后在37°C下孵育30分钟。在Agilent 7890A气相色谱仪上连接到5975C四极杆质谱仪（Agilent Technologies）上进行代谢物分析。衍生化样品的1.0-μL体积以不分流模式注入RTX-5Sil MS柱（30 m × 0.25 mm内径；0.25 μm膜厚度；Restek，PA，美国）。烤箱温度程序为：初始保持50°C 1分钟，以20°C/min的速度升温至330°C，最终保持330°C 5分钟。质量谱在85–550 m/z范围内采集，电子撞击电离能量为70 eV。

结果与讨论：
- 大肠杆菌生产L-岩藻糖的计算机模拟（GEM）分析：GEM分析用于预测使用LAD和葡萄糖作为底物时大肠杆菌生物合成的最佳通量分布。在有氧条件下，计算机模型预测大肠杆菌会同时利用LAD和葡萄糖通过FucA活性生成L-岩藻糖-1-磷酸，随后通过内在的糖磷酸酶去磷酸化得到L-岩藻糖（图1A）。模拟进一步表明，需要等于或高于LAD浓度的葡萄糖才能维持L-岩藻糖的生物合成（表S2），并且增加氧气供应会促进生物量形成和L-岩藻糖的生产（图1B）。相比之下，在无氧条件下，所有LAD将通过FucO活性转化为1,2-PDO，导致没有通量向L-岩藻糖的生产（表S2-S3）。这些结果表明，充足的氧气供应对于高效生产L-岩藻糖是必不可少的。

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- 图1. 大肠杆菌生产L-岩藻糖的计算机基因组规模代谢模型（GEM）。(A) LAD和DHAP利用的简化代谢途径，导致L-岩藻糖的生物合成。显示了竞争性途径和目标基因的删除（fucI、fucK、fucO、aldA、tpiA）。(B) 基于GEM分析的氧气吸收率、L-岩藻糖合成和生长率之间的关系。

GEM分析还识别了一些可能干扰L-岩藻糖生物合成的竞争性代谢途径。虽然LAD可以通过FucA转化为L-岩藻糖-1-磷酸，但它也可以通过FucO转化为1,2-PDO或通过AldA转化为乳酸。另一种底物DHAP可以通过TpiA转化为甘油醛-3-磷酸（G3P）并进入糖酵解途径。此外，合成的L-岩藻糖本身可以通过FucI异构化为L-岩藻糖或通过FucK重新磷酸化为L-岩藻糖-1-磷酸。尽管先前的研究表明内在的糖磷酸酶能够将L-岩藻糖-1-磷酸去磷酸化为L-岩藻糖，但低磷酸酶活性可能导致其通过反向FucA反应重新转化为LAD和DHAP[1]。总体而言，这些结果突显了限制LAD和DHAP高效转化为L-岩藻糖的潜在代谢瓶颈。

- 大肠杆菌的菌株工程和L-岩藻糖生产：基于上述GEM分析，引入了基因删除以减少竞争性途径并保留L-岩藻糖作为最终产物。首先，删除了编码将L-岩藻糖转化为其异构体（L-岩藻糖）的酶的fucI基因，从而生成两种糖的混合物。其次，删除了编码将L-岩藻糖磷酸化为L-岩藻糖-1-磷酸并 thereby 使其保留在最终产物中的fucK基因。此外，在T7启动子控制下过表达fucA，以催化LAD和DHAP的醛缩合生成L-岩藻糖-1-磷酸。通过IPTG诱导后，通过SDS-PAGE分析确认了fucA的过表达（图S1），显示出预期的分子量条带。所得菌株命名为Fuc 1（ΔfucI ΔfucK，fucA过表达），并在葡萄糖-LAD培养基中培养96小时。在发酵过程中，葡萄糖被稳步消耗，细胞密度在24小时时增加然后进入静止期，乙酸在24小时前开始积累并逐渐稳定（图2A）。LAD在最初的12小时内迅速消耗，而1,2-PDO从12小时开始积累，其浓度逐渐增加直到发酵结束。12小时后检测到L-岩藻糖的产生，并在整个发酵过程中逐渐增加，达到38.92±5.19 mg/L（图3A）。对培养上清液的GC/MS分析确认了L-岩藻糖的存在（图3B，C）。经过基因工程改造以生产L-岩藻糖的大肠杆菌菌株的发酵特性。(A) Fuc 1 (ΔfucI ΔfucK; fucA::T7)。(B) Fuc 2 (ΔfucI ΔfucK ΔtpiA; fucA::T7)。(C) Fuc 3 (ΔfucI ΔfucK ΔtpiA ΔfucO; fucA::T7)。(D) Fuc 4 (ΔfucI ΔfucK ΔtpiA ΔfucO ΔaldA; fucA::T7)。对于每个菌株，左侧面板显示了细胞生长（OD600）、葡萄糖消耗和乙酸生产情况，右侧面板显示了1,2-丙二醇（1,2-PDO）的消耗情况以及LAD的消耗情况。误差条表示基于三次独立实验的标准偏差。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0349374.g002
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图3. 发酵过程中L-岩藻糖的产生及通过质谱法确认。(A) 经过基因工程改造的大肠杆菌菌株（Fuc 1–4）产生的L-岩藻糖。数据以平均值±标准偏差的形式呈现。(B) 经过基因工程改造的菌株产生的L-岩藻糖的质谱图。(C) 分析用L-岩藻糖标准品的质谱图。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0349374.g003

为了增加细胞内DHAP的可用性，除了删除fucI和fucK基因外，还删除了tpiA基因，该基因编码一种将DHAP转化为G3P以进入糖酵解过程的酶。所得菌株被命名为Fuc 2（ΔfucI ΔfucK ΔtpiA，fucA过表达），并在与Fuc 1相同的条件下培养。与Fuc 1相比，Fuc 2的生长显著减缓，葡萄糖在96小时内仅被逐渐消耗，同时生物量形成和乙酸产量也较低（图2B）。LAD的消耗也被延迟，需要长达48小时才能完全消耗掉，而转化为1,2-PDO的过程在整个发酵过程中持续进行。L-岩藻糖的产量在发酵过程中逐渐增加（图3B），但最终浓度低于Fuc 1，达到32.15±3.62毫克/升，产率为4.96±0.94%。tpiA基因的删除可能导致DHAP积累并产生毒性，从而抑制细胞生长[16,17]。与这一观察结果一致，Fuc 2中观察到的严重生长缺陷可能是由于细胞内DHAP水平升高所致。尽管预期tpiA的删除会增强L-岩藻糖的生成途径，但实际上L-岩藻糖的产量反而降低，这表明DHAP的积累产生的毒性效应超过了增加底物可用性的潜在益处。为了进一步减少LAD向副产物的转化，还删除了fucO和aldA基因。fucO基因编码一种将LAD转化为1,2-PDO的氧化还原酶，而aldA基因编码一种将LAD转化为乳酸的醛脱氢酶。所得菌株分别被命名为Fuc 3（ΔfucI ΔfucK ΔtpiA ΔfucO，fucA过表达）和Fuc 4（ΔfucI ΔfucK ΔtpiA ΔfucO ΔaldA，fucA过表达）。Fuc 3和Fuc 4的生长和葡萄糖消耗模式与Fuc 2相似，但LAD的消耗进一步延迟，完全消耗需要72小时（图2）。尽管如此，大部分LAD仍然转化为1,2-PDO。与使用Fuc 1和Fuc 2相比，L-岩藻糖的产量显著提高（图3A）。Fuc 3产生的L-岩藻糖为45.30±7.37毫克/升（产率：6.11±0.99%），Fuc 4产生的 L-岩藻糖为50.25±4.30毫克/升（产率：6.78±0.58%）。与之前研究中使用的酿酒酵母（仅产生1.55毫克/升L-岩藻糖[1]）相比，Fuc 4菌株的产量提高了30多倍，这表明大肠杆菌作为L-岩藻糖生物合成的宿主具有巨大潜力。尽管删除aldA的目的是为了阻止LAD转化为乳酸，但本研究中并未直接测量乳酸的含量。因此，aldA基因删除对减少乳酸形成的作用仍有待进一步验证。这些结果表明，删除fucO和aldA在一定程度上减少了LAD的代谢，延长了底物的可用时间，从而提高了L-岩藻糖的产量。大多数LAD仍然转化为1,2-PDO（图2），这表明除fucO编码的氧化还原酶外，其他氧化还原酶也可能参与了这一转化过程。此外，发酵过程中观察到的乙酸积累可能反映了大肠杆菌在高碳流条件下的过载代谢，这可能会导致碳从目标产物中转移，从而降低L-岩藻糖的生产效率[18]。总体而言，实际产量仍低于理论最大值的7%，表明FucA的活性不足以及糖磷酸酶的去磷酸化效率有限，是关键的代谢瓶颈。如果L-岩藻糖-1-磷酸不能迅速去磷酸化，它可能通过反向FucA反应重新转化为LAD和DHAP，进一步限制了净L-岩藻糖的产量。综上所述，需要进一步优化——例如提高FucA和糖磷酸酶的活性，并鉴定参与LAD向1,2-PDO转化的其他酶——以实现更高的大肠杆菌L-岩藻糖产量。虽然本研究是在摇瓶培养中进行的，但未来涉及生物反应器规模发酵的研究对于验证所提出策略的可扩展性和工业应用性非常重要。

结论
在这项研究中，通过整合GEM分析、有针对性的基因删除和途径优化，建立了大肠杆菌中L-岩藻糖生物合成的代谢工程策略。GEM分析表明LAD、DHAP和L-岩藻糖的代谢流存在竞争，从而限制了理论产量；这一结果指导了工程菌株的合理设计。依次删除fucI、fucK、tpiA、fucO和aldA基因，并同时过表达fucA基因，实现了从LAD和葡萄糖直接合成L-岩藻糖。最终得到的Fuc 4菌株产生了50.25±4.30毫克/升的L-岩藻糖，相当于理论最大值的6.78%，比我们之前的微生物平台提高了30多倍。尽管取得了这些进展，但仍存在几个瓶颈，例如LAD向1,2-PDO的转化、DHAP的毒性以及FucA和糖磷酸酶的活性有限。通过酶工程和消除其他竞争途径来克服这些挑战对于进一步提升产量至关重要。总体而言，这项工作证明了利用微生物细胞工厂进行稀有糖类生物合成的可行性，并为未来实现L-岩藻糖的工业生产奠定了基础，使其成为化妆品、食品和药品的功能性成分。

致谢
我们衷心感谢绿色生物科学技术研究所绿色生物研究设施中心在代谢物分析方面提供的宝贵帮助。
参考文献