综述：原位单粒子冷冻电镜技术：原理与应用

《Current Opinion in Structural Biology》：In situ single-particle Cryo-EM methods: Principle and applications

　　

张星|黄国强|隋森芳

中国北京清华大学生命科学学院生物结构前沿研究中心，膜生物学国家重点实验室

摘要

冷冻电子显微镜（cryo-EM）正从在体外确定孤立蛋白质的结构，转变为直接在体内观察大分子的结构。传统的体内方法主要依赖于冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography）结合亚层图像平均（subtomogram averaging），但由于复杂的工作流程、处理过程中的累积误差以及数据吞吐量低，这些方法的分辨率往往受到限制。新兴的体内单粒子冷冻电子显微镜技术通过收集高剂量的、未倾斜的细胞层图像来克服这些限制。利用高分辨率模板进行粒子识别和精修，这些方法显著提高了数据吞吐量和可实现的分辨率。本综述系统地概述了体内单粒子方法的原则、工作流程和优势，强调了它们的关键应用，并讨论了未来的发展前景。

引言

冷冻电子显微镜（cryo-EM）正在经历一个关键性的转变，从确定孤立的大分子结构发展到在天然细胞环境中观察其结构[1,2]。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合亚层图像平均（STA）一直是利用冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削制备的细胞样本进行体内结构分析的主要方法。尽管cryo-ET-STA提供了对复杂生物环境前所未有的三维可视化，但可实现的分辨率常常受到复杂工作流程导致的累积误差以及数据收集效率低下的限制[3, 4, 5]。这一困境促使人们开发了替代方法。最近，诸如体内单粒子分析（isSPA）[6,7]、2D模板匹配（2DTM）[8]和诱饵重建（baited reconstruction）[9]等方法被开发出来，以将传统的单粒子分析（SPA）应用于体内研究。此外，TYGRESS [10]、hStA [11]和STAgSPA [12]等组合策略也被引入，以整合STA和SPA的互补优势。总体而言，这些方法利用了高剂量单粒子图像的高质量信号，标志着向高分辨率体内结构分析的范式转变。本综述旨在对这些关键方法进行比较综合，重点介绍它们的框架、优势、应用和面临的挑战。

章节摘录

冷冻电子断层扫描和亚层图像平均

冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结合亚层图像平均（STA）是解析天然细胞环境中大分子结构的主要工作流程。该流程首先使用冷冻FIB铣削制备的细胞层获取倾斜图像系列[13]。通常，样品在透射电子显微镜（TEM）中以2–3°的角度增量从-60°倾斜到+60°，并在每个倾斜角度下捕获图像。这些图像随后被对齐并重建为三维图像

混合方法：引入单剂量高分辨率图像

为了解决cryo-ET-STA流程中的瓶颈，提出了一类称为“混合方法”的创新技术。该技术的概念是在传统的倾斜图像采集方案中引入一张额外的、高剂量且未倾斜的图像。这张图像作为保留高分辨率信息的“特权通道”。在这种策略中，首先使用STA获得断层图中粒子的精确三维坐标和初始方向

体内单粒子方法

体内单粒子方法，如isSPA [6,7]和2DTM [8,9]，旨在直接将SPA应用于体内样本（图1d）。其核心创新在于完全避免对细胞层进行倾斜图像采集。相反，收集一张未倾斜的高剂量显微图像。使用已知的原子模型（通常通过X射线晶体学、冷冻电子显微镜或人工智能预测获得）生成覆盖所有欧拉角方向的2D投影库。这些方法代表了向高分辨率体内结构分析的范式转变

组合方法：亚层图像平均引导的单粒子分析

为了将体内单粒子方法的高分辨率能力与传统冷冻电子断层扫描（cryo-ET-STA）的无偏发现能力无缝结合，张等人提出了一种组合策略STAgSPA [12]。该流程分为两部分（图2）：首先，进行标准的冷冻电子断层扫描和亚层图像平均，以确定目标蛋白质或复合物在其细胞环境中的三维分布和二级结构分辨率图；其次，收集高剂量的未倾斜图像

当前挑战与未来展望

虽然体内单粒子方法为在天然细胞环境中实现接近原子级别的结构生物学研究提供了有希望的途径，但其更广泛的应用仍受到检测阈值的限制，目前该阈值仅适用于兆道尔顿级别的复合物，使得大多数较小且功能关键的蛋白质无法被研究。改进样品制备技术对于克服这一限制至关重要。开发高质量、机械稳定性更高的样品是必要的[40, 41, 42]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们对于因篇幅限制而未引用某些科学家的工作表示歉意。本工作得到了国家自然科学基金（编号32241030，资助对象为S.-F.S.）的支持。