综述：近期在整合冷冻电镜（cryoEM）与电子传输技术（ET）方面的进展，有助于可视化细胞器之间的分子相互作用与动态关系

《Current Opinion in Structural Biology》：Recent advances in integrative cryoEM/ET toward visualizing the molecular sociology of cellular organelles

　　徐静伟
中国浙江省杭州市西湖生命科学与生物医学实验室，310024

冷冻电子显微镜和断层扫描技术（cryoEM/ET）的发展使我们能够在接近天然状态的情况下以分子分辨率观察细胞超微结构。通过连接细胞生物学和结构生物学之间的分辨率，原位cryoEM/ET揭示了大分子复合物及其在完整细胞和细胞器内的空间组织的前所未有的分子细节。除了结构确定之外，新兴的图像处理流程结合了亚层析平均与上下文相关的定量和多模态分析，以揭示分子在细胞空间中的协调方式——这可以被称为细胞的“分子社会学”。在这里，我们回顾了特定细胞器的最新进展，强调了关键的概念趋势，并讨论了整合性原位结构生物学的当前局限性和未来前景。

**引言**
冷冻电子断层扫描（cryoET）是一种成像技术，可以描述玻璃化样本在其接近天然状态下的细胞结构。除了在纳米尺度上可视化细胞区室外，还可以通过亚体积平均进一步表征大分子复合物的分子特征。通过将分割与原位分子细节以及细胞和颗粒特征（如膜、颗粒方向和坐标[1,2]）的定量分析相结合，cryoET可以提供嵌入其天然细胞环境中的大分子复合物的快照，这也被称为细胞的“分子社会学”[3]。

生物样本（例如细菌、哺乳动物细胞、组织）通常对电子束不透明，因此在进行原位cryoET成像之前必须对其进行稀释，这通常是通过冷冻聚焦离子束（FIB）铣削来实现的[4]。虽然最初仅限于单个细胞，但使用高压冷冻和连续提取技术的样本制备方面的进步使得在接近天然状态的多细胞样本中可视化细胞环境成为可能[5, 6?, 7?]。重要的是，硬件、数据收集和图像处理方面的突破[8, 9, 10, 11, 12, 13]使得cryoET以及单粒子分析冷冻电子显微镜（以下简称“SPA cryoEM”）能够提供各种细胞器内大分子复合物的前所未有的原位分子细节[14?, 15, 16, 17??, 18?]。通过将这些数据与其他方法（如光学显微镜、体积成像、多组学、计算模拟）相结合，我们开始更全面地了解不同分子如何在细胞器内参与特定功能，这是“视觉蛋白质组学”的主要目标。

**重点介绍**
本综述重点关注细胞SPA cryoEM和cryoET的一些最新进展。特别关注使用结合不同成像和组学模式以及分子模拟的整合方法对大分子复合物进行分子表征和上下文分析。这些多模态流程可以提供跨尺度的深入分子见解，从而弥合分子结构、功能和细胞活动之间的差距。

**细胞核**
真核细胞将其基因组包裹在双层膜结构中，形成一个细胞核以将其与细胞质隔开。cryoET研究展示了核孔复合体（NPC）的分子结构，提供了大分子复合物跨核孔转运的快照，并开始描绘细胞核内染色质的天然结构（图1）。

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**图1.** 综合cryoEM/ET展示了多种核蛋白复合物的分子结构。
(a) 人类核孔复合体支架的兆道尔顿原子模型揭示了不同核孔蛋白如何组装成不对称复合体[24]。请注意，该模型是通过结合原位cryoEM与交联质谱和基于人工智能的建模构建的。
(b) NPC的构象是动态的，在HIV衣壳进入时会裂开[30]。
(c) 核小体在细胞核边缘形成更高层次的结构（异染色质）[33]。
(d) 原位cryoEM和SPA cryoEM共同阐明了人类精子无膜核区室中蛋白酶体复合体的可辨识分子结构[37]。

**大分子跨核膜的运输**
大分子跨核膜的运输由NPC介导。这个兆道尔顿复合体嵌入核膜中，包含超过1000个约30种不同的核孔蛋白[19,20]。广泛的cryoEM和SPA cryoEM研究阐明了不同物种中NPC的分子结构，揭示了一个保守的NPC核心支架及其组成变化[21, 22, 23]。值得注意的是，通过结合原位cryoEM与交联质谱和基于人工智能的建模，构建了人类NPC支架的70-MD原子模型[24]（图1a）。该模型揭示了不同核孔蛋白如何空间排列以形成嵌入核膜中的不对称结构。有趣的是，NPC的不对称性与小GTP酶Ran的不同核苷酸状态有关，因为核内较高的RanGTP浓度促进了外围核孔蛋白与NPC的结合[25]。

从NPC核心延伸出八个灵活的支柱，形成核篮。虽然核篮对于选择性核质运输至关重要，但其结构尚未得到充分表征。通过对进化上不同的物种进行的大规模cryoET分析，开始可视化核篮的结构[26]。这些篮状结构通过结合整合建模和实验数据建模，表明篮状结构的远端部分可能在mRNA胞质输出前发挥对接作用。

**核孔复合体**
NPC的构象高度动态，其直径在不同条件下会发生变化。对指数生长的酵母细胞的原位分析发现，耗尽能量或高渗冲击时NPC会收缩[27]。类似的研究也发现Dictystelium discoideum的NPC在渗透压应力下可以收缩或扩张以适应核大小的变化[28]。此外，当超大分子通过NPC时（如在病毒衣壳进入核时观察到），会发生显著的重组织[29,30]。对于HIV-1，多模态成像显示HIV-1衣壳通过NPC的转运是病毒复制早期的限速步骤，伴随着结合的胞质环磷脂A的解离[30]。值得注意的是，HIV衣壳通过NPC时，NPC甚至会裂开，从而促进锥形病毒衣壳进入细胞核（图1b）。

在细胞核中，基因组通过包裹组蛋白形成核小体，进一步折叠成更高层次的结构（染色质）。尽管对核小体有大量的体外研究，但细胞核内染色质的三维拓扑结构仍然难以捉摸。原位表征的一个主要瓶颈是细胞核的高度拥挤。对高压冷冻重组染色质凝集体进行cryoET分析的进步揭示了单个核小体复合体之间的异质相互作用网络[31]。通过结合上下文分析和分子模拟，揭示了不同核小体之间的连接长度如何影响染色质凝集体的性质。重要的是，原位染色质与体外凝集体之间的比较表明，高核小体密度的天然核域与体外25-bp染色质凝集体具有相似的组织结构[32]。此外，在不同人类T细胞的原位cryoEM成像中发现了可辨识的异染色质分子结构[33?, 34, 35]。值得注意的是，对静息T细胞的cryoEM成像显示了核小体堆叠如何形成延长但非纤维状的结构[33]（图1c）。

**其他细胞器**
除了核小体外，其他几个细胞器也开始在原位进行表征。例如，使用分离的有丝分裂染色体探索了着丝粒的染色质结构[36]。此外，通过多模态方法全面解析了人类精子细胞中核蛋白酶体的结构[37]（图1d）。借助SPA cryoEM确定的高分辨率结构，原子模型识别出睾丸特异性的剪接变异，表明cryoEM可以提供关于原代细胞和组织特异性分子机制的见解。

**线粒体呼吸链和ATP合酶**
线粒体利用氧化磷酸化在其内膜上产生质子梯度以生成ATP。这些过程中的关键复合体——呼吸链（超）复合体和ATP合酶——已在体外使用SPA cryoEM进行了详细研究[38, 39, 40, 41, 42]。原位SPA cryoEM确定了分离的猪线粒体中呼吸体的高分辨率结构[43]。利用SPA cryoEM数据集，识别出不同的超复合体组织，并显示出它们对局部膜曲率的显著影响。与此一致的是，来自绿藻Chlamydomonas reinhardtii的线粒体的原位cryoEM可视化了嵴膜平坦区域上的呼吸体[17]（图2a）。令人惊讶的是，亚层析平均显示了呼吸体的独特化学计量比。通过SPA cryoEM确定的原子模型，在天然呼吸体中观察到了额外的载体细胞色素c密度，支持了一种模型，即载体在线粒体内膜和膜间隙之间自由扩散以进行电子转移。

**微管基细胞器**
微管是主要的细胞骨架成分之一，参与广泛的细胞活动。因此，它们高度保守，最近的多尺度成像方法甚至在已知与真核生物亲缘关系最接近的Asgard古菌中识别出了形成微管的微管形成管蛋白异二聚体，这些异二聚体具有不同的原纤维（pf）数量和多样的接触特征[48,49]。在大多数真核生物中，微管通常与其他蛋白质结合形成更高层次的结构，如中心体，这是中心体和纤毛的构建块。典型的中心体是由九个微管三联体组成的对称阵列，从近端逐渐过渡到远端成为微管二联体[50]。中心体微管结构由不同的中心体模块空间装饰[51]，包括车轮状、针头状、A-C连接器和内部支架。

一对中心体（一个母中心体和一个子中心体）招募周围物质形成中心体的复杂结构，中心体作为一个保守的微管组织中心[52]。与典型中心体不同，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的中心体组成相对简单。对C. elegans胚胎中心体的原位可视化揭示了母中心体（二联体）和子中心体（单体）之间的不同分子特征（图3a），以及周围物质中的相互连接的纤维网络[53]。值得注意的是，中心体中的微管（13 pf）与周围物质（11 pf）具有不同的原纤维数量，这可能是由于γ-微管蛋白环复合体的存在。

**结论**
除了核小体外，其他几个细胞器也开始在原位进行表征。例如，使用分离的有丝分裂染色体探索了着丝粒的染色质结构[36]。此外，通过多模态方法全面解析了人类精子细胞中核蛋白酶体的结构[37]（图1d）。借助SPA cryoEM确定的高分辨率结构，原子模型识别出睾丸特异性的剪接变异，表明cryoEM可以提供关于原代细胞和组织特异性分子机制的见解。尽管使用扩展显微镜（ExM）对基体的组成进行了广泛研究[51,54, 55, 56]，但其详细的分子结构仍不清楚。一项结合了冷冻电镜（cryoEM）和单粒子分析（SPA cryoEM）的研究报告指出，来自纤毛虫Tetrahymena thermophila的A-C连接蛋白通过与其他结构组件的广泛相互作用网络将所有微管三联体整合在一起[57]。值得注意的是，A-C连接蛋白在中心粒中的结构多种多样，其空间分布与其他中心粒模块的存在高度相关（图3b）。在中心粒的远端区域，一项综合性的ExM和cryoEM研究揭示了腔内环蛋白C2CD3作为连接中心粒腔、远端微管帽和附属结构的枢纽[58]。在处于不同纤毛生成阶段的小鼠室管膜细胞的原位观察中也得到了类似的结果（图3b），这为亚纳米分辨率下的基底体提供了可辨别的分子见解[59]。基底体的远端构建了纤毛轴丝，由九对微管双联体围绕中央的两根单微管组成。大量的结构研究描述了不同进化物种中纤毛的分子组织[60, 61, 62, 63, 64]。值得注意的是，通过整合SPA cryoEM、cryoET和蛋白质组学技术，确定了牛精子中96纳米重复微管双联体的高分辨率结构[65]（图3c）。全面的结构分析显示，精子中的微管双联体具有更复杂的结构，而其他运动性纤毛细胞中的微管双联体在不同组织中相对保守。此外，对纤毛末端的原位观察揭示了轴丝组装的严格调控机制[66]。

除了上述细胞器外，SPA cryoEM和cryoET研究还揭示了其他细胞器及细胞质内大分子复合物的详细分子信息。核糖体是细胞质中最丰富的复合物之一，并已在不同物种中进行了广泛的原位研究[28,67, 68, 69, 70]。基于这些研究，它也成为评估原位结构生物学算法和样品制备工作流程性能的参考结构。其中一个高分辨率原位结构生物学的里程碑例子是肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）中结合抗生素氯霉素的核糖体结构（3.0 ?）[14]（图4a）。全面分类分析表明，氯霉素处理导致处于翻译延伸状态的核糖体比例增加，这可能会在多聚核糖体内引发碰撞。在同一系统中的进展显著展示了如何通过亚层平均结合严格分类来解析其细胞环境中的多种功能状态[71]。除了cryoET之外，对冷冻FIB铣削层的原位SPA cryoEM也成为分析原位核糖体状态的另一种方法，并且还被用于在其天然环境中高分辨率解析其他大分子[15,67]。对人类细胞层中核糖体的原位SPA cryoEM不仅揭示了核糖体翻译的分子动态，还发现了通常在分离样本中不丰富的其他相关蛋白质[16]。

除了核糖体之外，多尺度成像方法还扩展了我们对其他细胞器中大分子组成和功能的认识，例如细胞质中的TRiC复合体[72]（图4b）、突触囊泡中的V-ATP酶[73]、硅藻中的蛋白核壳[74,75]、细胞质和核中的类似病毒的颗粒[76]（图4c），以及酵母配子发生过程中的代谢酶丝[77]。值得注意的是，对C. reinhardtii的大规模数据集进行深入的cryoET分析，在亚纳米分辨率下表征了不同的分子复合物[78]。这一注释详尽的资源已向社区开放，正在促进方法的发展，并必将激发更多的生物学发现。

通过弥合细胞生物学和结构生物学之间的差距，原位cryoET使我们能够直接在其天然细胞或细胞器环境中可视化大分子复合物。迄今为止，cryoET的显著进展证明了它是一种强大的视觉蛋白质组学工具。然而，原位cryoET仍受到某些挑战的限制，特别是冷冻FIB铣削制备层片的通量以及亚层平均的分辨率限制。为了解决这些限制，已经开发了几种方法来简化工作流程（例如连续提取[6]）和高分辨率亚层平均流程（例如Warp-Relion-M [11]）。虽然本综述主要关注描述典型细胞器的最新进展，但cryoET最近也被应用于表征细胞蛋白质凝聚体的分子结构[79,80]（图4d），并且作为一种无标记技术，在阐明这些无膜细胞器的天然结构方面具有巨大潜力。将cryoET与其他方法（例如SPA cryoEM、蛋白质组学、先进的光学显微镜）结合使用，将创建一个多尺度框架，以全面表征大分子复合物，将结构机制与细胞功能联系起来，从而提供前所未有的细胞分子社会学的见解。随着自动化和工作流程的持续进步，我们相信原位cryoET将越来越多地应用于阐明从特化细胞到多种组织中的复杂生理环境中的分子结构。