嗜铬细胞瘤和副神经节瘤内含有具有肿瘤发生潜能的SOX2+干细胞

《Endocrine-Related Cancer》：Phaeochromocytomas and paragangliomas harbour tumour-initiating SOX2+ stem cells

　　雅斯敏·肯克姆 | 马克·奎因 | 本斯·科韦尔 | 爱丽丝·桑坦布罗吉奥 | 詹姆斯·考夫曼-库克 | 奥利维亚·谢尔温 | 劳拉·D·斯克里巴 | 迪米特里亚·布雷姆普 | 米里亚姆·瓦斯克斯·塞戈维亚诺 | 迪伦·卡梅伦 | 伊洛娜·伯杰 | 温·吴 | 非永·野中 | 玛丽莉·特奥多罗普卢 | 克里斯蒂娜·潘波罗拉基 | 保罗·V·卡罗尔 | 路易丝·伊扎特 | J·保罗·查普尔 | 斯蒂芬·R·伯恩斯坦 | 尼科尔·贝克曼 | 辛西娅·L·安德尼奥杜
伦敦国王学院颅面与再生生物学中心，英国伦敦

嗜铬细胞瘤（PCCs）和副神经节瘤（PGLs）是罕见的神经内分泌肿瘤，分别起源于神经嵴（NC）衍生的肾上腺髓质和副神经节。大约10-15%的PCCs患者和35-40%的PGLs患者会发展成转移性疾病，导致报道的中位总生存期为7年。由于对肿瘤发生机制的理解不足，预后标志物的开发和个人化治疗策略的制定受到了阻碍。在其他器官中，具有干细胞特性的细胞是肿瘤发生和维持的基础，因为它们能够自我更新并产生分化细胞。我们最近发现，在人类肾上腺中，一群具有支持作用的细胞实际上是SOX2+的肾上腺髓质干细胞，这些细胞在神经嵴迁移过程中被指定。在这项研究中，我们旨在确定PCCs和PGLs中的SOX2+细胞是否可以表现为肿瘤起始干细胞。通过表达和转录组学研究，我们证明了在各种PCCs和PGLs中都存在SOX2/SOX2表达细胞，无论肿瘤的侵袭性、位置或致病突变如何。计算机分析显示这些双阳性细胞在肿瘤中共同表达SOX2和嗜铬细胞标志物，并且这些细胞具有活跃的增殖能力。在干细胞促进培养基中体外分离这些细胞，并将其移植到鸡的绒毛尿囊膜上，结果显示它们具有在卵内扩张和转移的潜力。

**引言**
嗜铬细胞瘤（PCCs）和副神经节瘤（PGLs）统称为PPGLs，分别是肾上腺内的和肾上腺外的神经内分泌肿瘤，由分泌肾上腺素和去甲肾上腺素的嗜铬细胞组成。它们起源于交感神经系统和副交感神经系统的神经嵴细胞。根据世界卫生组织2022年第五版标准，所有PPGLs都具有转移潜力。由于可用的治疗方法有限，转移性PPGLs患者的平均生存期约为7年。由于对肿瘤发生机制的了解不足，预后标志物的开发和个人化治疗策略的实施受到了阻碍。在其他器官中，具有干细胞特性的细胞是由于其自我更新能力和产生分化细胞的能力而成为肿瘤起源的基础。我们最近发现，在人类肾上腺中，一类支持性的细胞实际上是SOX2+的肾上腺髓质干细胞，这些干细胞在神经嵴迁移过程中被指定。在这项研究中，我们试图确定PCCs和PGLs中的SOX2+细胞是否可以表现为肿瘤起始干细胞。通过表达和转录组学研究，我们证明了在各种PCCs和PGLs中都存在SOX2/SOX2表达细胞，无论肿瘤的侵袭性、位置或致病突变如何。计算机分析显示这些双阳性细胞在肿瘤中共同表达SOX2和嗜铬细胞标志物，并且这些细胞具有活跃的增殖能力。在干细胞促进培养基中体外分离这些细胞，并将其移植到鸡的绒毛尿囊膜上，结果显示它们具有在卵内扩张和转移的潜力。

**嗜铬细胞瘤（PCCs）和副神经节瘤（PGLs）**
嗜铬细胞瘤（PCCs）和副神经节瘤（PGLs）统称为PPGLs，分别是肾上腺内和肾上腺外的神经内分泌肿瘤，由分泌肾上腺素和去甲肾上腺素的嗜铬细胞组成。它们起源于交感神经系统和副交感神经系统的神经嵴细胞。根据世界卫生组织2022年第五版标准，所有PPGLs都具有转移潜力。由于可用的治疗方法有限，转移性PPGLs患者的平均生存期约为7年。即使被归类为良性的PPGLs也与高发病率和死亡率相关，这是由于与过量产生和分泌儿茶酚胺相关的并发症，包括高血压、心律失常和中风。PPGLs与人肿瘤中最高的遗传性有关，大约40%的PPGLs携带至少一个易感基因的种系突变或缺失，这些基因包括VHL、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SDHAF2、RET、NF1、TMEM127、MAX、H3F3A和HIF2A。最常见的遗传性PPGLs原因是编码线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）酶复合体亚基的基因的种系致病变异：SDHA、SDHB、SDHC和SDHD。SDHB突变型PPGLs患者的发病率和死亡率更高。在42%的转移性PPGLs中检测到了致病性种系SDHB变异（在儿童转移性PPGLs中达到80%），但在成人患者的多变量分析中，这些变异并未作为总生存率的预后因素。在SDHB突变型PPGLs中，TERT或ATRX的次要驱动事件与转移性疾病有关。超过70%的病例中存在种系和体细胞驱动基因事件，这使得PPGLs可以分为三个组：组1（假性缺氧）、组2（激酶信号通路）和组3（WNT信号通路）。尽管我们对PPGLs的遗传学有深入的了解，但目前尚不清楚PPGLs的确切起源细胞类型，这严重限制了体内实验模型的建立和靶向治疗的发展。虽然有人提出这些肿瘤可能存在癌干细胞（CSC）或肿瘤起始细胞（TIC），但尚未得到证实。先前的研究报告称，在通过肿瘤微阵列免疫染色分析的12%的PPGLs中检测到了与多种组织干细胞相关的转录因子SOX2的表达。然而，该研究并未提供支持这些肿瘤中干细胞功能的数据。我们最近在正常小鼠的肾上腺髓质中发现了一群出生后的SOX2+干细胞，这些干细胞来源于胚胎发育过程中的迁移神经嵴细胞，并在副神经节和肾上腺髓质中定植。这项研究表明，SOX2+肾上腺髓质干细胞在小鼠的一生中不断生成新的嗜铬细胞，并作为独立的细胞群从神经嵴衍生的前体细胞中分化而来。在正常人类肾上腺中也确认了这些细胞的存在，结合PPGLs位于神经嵴丰富的部位，这提示神经嵴衍生的SOX2+细胞可能作为PPGLs的干细胞。在这项研究中，我们旨在确定PPGLs中的SOX2+细胞是否可以表现为CSC和这些肿瘤的候选起源细胞。

**材料与方法**
所有动物研究均符合1986年《动物（科学程序）法案》的规定，获得了内政部许可证P8D5E2773（适用于鸡），以及伦敦国王学院“哺乳动物肾上腺干细胞的功能和调控”项目的生物安全批准。胎儿肾上腺样本来自人类发育生物资源（HDBR），项目编号200587。PPGL肿瘤研究在伦敦国王学院进行，并得到了康沃尔和普利茅斯健康研究机构的批准，研究标题为“癌症中的遗传和表观遗传标记研究”，IRAS项目编号216133，REC参考编号17/SW/0018。福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的肿瘤和肾上腺组织样本由德累斯顿BioBank的肿瘤和正常组织库（TNTB）制备，样本来源于德累斯顿大学医院的病理学档案（EK 59032007）。患者样本来自欧洲肾上腺肿瘤研究网络（ENS@T）的生物样本注册库和存储库（EK 407122010）、前瞻性单胺生成肿瘤研究（PMT研究；EK 189062010）和/或PROSPHEO（NCT03344016；EK 210052017），所有这些项目都在德累斯顿卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院获得了伦理批准。所有患者都提供了知情同意书。额外的FFPE肿瘤样本来自玛丽女王大学，研究标题为“内分泌肿瘤的遗传学”（剑桥郡研究伦理委员会参考编号MREC 06/Q0104/133）。正常的人类肾上腺组织样本来自维尔茨堡大学医院。正常肾上腺是在肿瘤切除术中获得的，并经组织学验证为正常。所有样本均获得了患者的知情同意。

**绒毛尿囊膜（CAM）实验**
从Medeggs有限公司购买了受精的Shaver Brown鸡蛋。第0天是指将鸡蛋放入37.8°C/60%湿度的鸡蛋孵化器中。四天后，使用弯曲的弹簧剪刀在鸡蛋上切开口，暴露出CAM。切口被密封，鸡蛋继续在孵化器中培养至第10天，然后从鸡蛋中分离出干细胞并接种到CAM上。将25 μL的单细胞悬浮液（100,000个细胞）滴入直径6毫米的硅胶环中。鸡蛋被密封后放回孵化器中，直至受精后14天采集。小鸡按照预定程序被处死。切除的CAM和解剖出的小鸡肺部在PBS中清洗并固定。

**肾上腺髓质和PPGL来源干细胞的原代培养**
PPGL肿瘤和肾上腺使用以下酶消化溶液进行分离：50 μg/mL DNAse I（CAT#D5025，Merck，英国）、10 mg/mL Collagenase II（CAT#LS004177，Worthington，美国）、2.5 μg/mL Fungizone（CAT#15290026，Gibco，英国）和0.1X trypsin–EDTA（CAT#59418C，Merck，英国），所有这些成分都溶解在1X Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）（CAT#14025050，Gibco，英国）中。样本在37°C下依次孵育并手动研磨，直至获得单细胞悬浮液。然后用富含血清的基础培养基（DMEM/F-12（CAT#31330-038，Gibco，英国）+ 5% FBS（CAT#F0804，Merck，英国）+ 50 μL/mL penicillin–streptomycin（CAT#15070063，Gibco，英国）灭活消化酶。细胞悬浮液离心后，沉淀物重新悬浮并在干细胞促进培养基中接种：基础培养基+ 20 ng/mL bFGF（CAT#234-FSE，R&D Systems，英国）+ 50 μg/mL cholera toxin（CAT#C8052，Merck，英国）。对于免疫染色，细胞被接种在涂有0.1%明胶的玻璃盖玻片上（明胶溶解在PBS中）。对于CAM实验，干细胞菌落在干细胞促进培养基中扩增。移植当天，细胞用trypsin处理，并用荧光素二乙酸酯的绿色荧光衍生物（CMFDA）进行细胞内标记（CellTracker染料，CAT#C7025，Thermo Fisher Scientific，美国），按照制造商的说明进行标注。标记后的细胞重新悬浮在干细胞促进培养基中，作为单细胞悬浮液用于接种到CAM上。

**组织处理用于免疫荧光和免疫组织化学**
用于石蜡包埋的切除组织/CAM在室温下用10%中性缓冲福尔马林（NBF）（CAT#HT501128，Merck，英国）固定过夜。第二天，样品用乙醇系列逐步脱水。石蜡包埋的样本切成5 μm厚度。小鸡的肺部在4°C下用4% PFA固定过夜。样品用水洗后放入含有30%蔗糖/PBS的低温保护溶液中过夜。样品在光学切割温度化合物（CAT#361603E，VWR，美国）中包埋，迅速冷冻后切成15 μm厚度。

**免疫荧光和免疫组织化学**
石蜡切片用Neoclear脱蜡，然后逐渐用不同浓度的乙醇重新水化。抗原回收在NXGEN脱蜡室（CAT#DC2012-220V，Menarini Diagnostics，意大利）中进行，温度为110°C，使用Dako Target Retrieval Solution（pH 9.0，CAT#S236784-2，Agilent Technologies，美国）处理3分钟。免疫组织化学使用ImPRESS Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit Anti-Rabbit IgG（CAT#MP-7601-50，Vector Laboratories，美国）进行，按照供应商的说明进行，使用兔抗SOX2抗体（CAT#ab92494，Abcam，英国，1:500）。细胞核用Vector Haematoxylin QS（CAT#H-3404-100，Vector Laboratories，美国）复染，然后将切片安装在VectaMount Permanent Mounting Medium（CAT#H-5000-60，Vector Laboratories，美国）中。

**免疫荧光染色**
切片在室温下用10%驴血清/阻断缓冲液（0.15%甘油，2 mg/mL BSA，0.1% Triton X-100）封闭1小时。然后在4°C下用1%驴血清/阻断缓冲液稀释的一抗（鼠抗HNA（CAT#MAB4383，Merck，英国，1:300）孵育过夜。接着用PBS + 0.1% Triton X-100清洗三次后，切片用二抗（山羊抗小鼠594（CAT#ab150116，Abcam，英国，1:500）和DAPI（CAT#ab228549，Abcam，英国，1:5,000）孵育。

**冷冻切片**
冷冻切片用Neoclear脱蜡，然后用逐渐减少浓度的乙醇重新水化。抗原恢复在NXGEN脱蜡室（CAT#DC2012-220V，Menarini Diagnostics，意大利）中进行，温度为110°C，使用Dako Target Retrieval Solution（pH 9.0，CAT#S236784-2，Agilent Technologies，美国）处理3分钟。

**RNAscope mRNA原位杂交**
RNAscope检测使用RNAscope? 2.5 HD Detection Reagents-RED试剂盒（CAT#322360，ACD Bio，美国）和Hs-MKI67检测探针（CAT#591771，ACD Bio，美国）进行，按照制造商的说明进行。切片用Hematoxylin QS（CAT#H-3404-100，Vector Laboratories，美国）复染，然后用VectaMount Permanent Mounting Medium（CAT#H-5000-60，Vector Laboratories，美国）安装。

**成像**
免疫组织化学或RNAscope mRNA原位杂交后的染色切片使用Nanozoomer-XR数字切片扫描仪（Hamamatsu）进行扫描。高倍图像使用Olympus BX34F明场显微镜获得。细胞培养图像使用Olympus Phase Contrast显微镜获得。免疫荧光成像使用Zeiss LSM980共聚焦显微镜（Zeiss Plan – Apochromat 20×/0.8干物镜）进行。Z堆栈以0.75 μm的步长获取。图像文件使用Fiji和Nanozoomer Digital Pathology视图进行处理。图像在Adobe Photoshop版本26.6.0中创建。

**计算研究**
PPGL肿瘤样本直接从Guy’s和St Thomas’ NHS Foundation Trust（GSTFT）的手术室获得。患者通过GSTFT的内分泌学和临床遗传学部门加入本研究。所有参与研究的患者均提供了书面知情同意书，允许获取肿瘤组织和临床数据。切除术后，肿瘤样本立即由专家临床病理学家进行了检查和解剖。确认为PPGL肿瘤的样本被转移到我们的实验室，要么被迅速冷冻并储存在-80°C，要么被进行单细胞悬浮液的分离，以便立即进行scRNA测序。单细胞分离是通过使用10 μL/mL的DNAse I（CAT#D5025，Merck，英国）、20 μL/mL的FBS（CAT #10270106，Thermo Fisher Scientific，美国）、10 mg/mL的Collagenase II（CAT#LS004177，Worthington，美国）、1 mg/mL的Dispase-II（CAT#SCM133，Merck，英国）和40 U/mL的RNaseOUT（CAT#10777019，Thermo Fisher Scientific，美国）在1 mL的1X Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）（CAT#14025050，Gibco，英国）中进行的。样本依次在37°C下孵育，并在整个过程中间歇性地进行机械分离和 vortexing。然后样本通过40 μm过滤器（CAT#UY-06336-63，Cole-Parmer，美国）并离心。去除酶分离液后，沉淀物用HBSS和5% FBS（CAT#10270106，Thermo Fisher Scientific，美国）洗涤并最终重新悬浮。使用0.4%的Trypan Blue Solution（CAT#15250061，Thermo Fisher Scientific，美国）在显微镜下检查单细胞悬浮液中的细胞数量和活力。冷冻样本按照10X协议进行核提取。样本在整个过程中保持在4°C。3-50 mg的冷冻PPGL肿瘤组织被转移到预冷的样本分离管中（CAT#2000564，10X Genomics，美国），加入200 μL的裂解缓冲液（Lysis Reagent（CAT#200558，10X Genomics，美国）、还原剂B（CAT#200087，10X Genomics，美国）和表面活性剂A（CAT#2000559，10X Genomics，美国）。样本进行机械分离，然后加入300 μL的裂解缓冲液。样本在冰上孵育8分钟。分离后的组织通过预冷的Nuclei Isolation Column（CAT#2000562，10X Genomics，美国）离心。流出的物质进行 vortexing和离心，沉淀物用500 μL的Debris Removal Buffer（CAT#200560，10X Genomics，美国）重新悬浮。样本离心并去除上清液，然后沉淀物在1 mL的Wash and Resuspension Buffer（1X PBS，10% BSA和RNase inhibitor（CAT#2000565，10X Genomics，美国）中重新悬浮。根据碎片情况重复此过程，最终沉淀物在50-500 μL的Wash and Resuspension Buffer中重新悬浮。然后使用0.4%的Trypan Blue Solution检查悬浮液中的细胞数量、活力、碎片和聚集情况。使用Chromium iX仪器和3′ v3.1基因表达分析试剂（10X Genomics，美国）处理单细胞/核，以生成用于细胞条形编码的GEMs（gel bead-in-emulsion）。每个样本上加载8,000-10,000个细胞。从多聚腺苷酸化的mRNA生成全长度cDNA并扩增。从扩增的cDNA准备双重索引的测序文库，并在Agilent TapeStation 4200上使用High Sensitivity D5000 ScreenTape（Agilent Technologies，美国）进行最终文库评估。然后在NextSeq 2000（Illumina，美国）上进行测序，每个细胞的深度大约为20,000个读段。

### 本研究收集样本的预处理
样本使用CellRanger 9.0.1（10X Genomics，美国）和默认设置对齐到GRCh38参考基因组，这意味着单细胞和单核样本也包括了内含子读段。

### 其他公开可用的样本
SDHB PPGL单核RNA-seq样本可以从Flynn等人的相应Figshare获取（10）。Figshare文件夹包含了CellRanger输出矩阵，其中原始_feature_barcode矩阵被用作输入。相应样本的患者元数据也从Flynn等人的补充材料中获取。健康肾上腺髓质样本的其他数据集也从Flynn等人的Figshare中获取，尽管这些数据最初来自Zethoven等人（15）。从其他出版物中获取的样本的数据集标识符保持不变。

### 质量控制（QC）和进一步处理
为了区分真正的细胞和无细胞的液滴，我们首先过滤掉了UMI少于800的条形码。使用Scanpy（16）的calculate_qc_metrics函数和‘RPS’、‘RPL’或‘MT-’标志确定了核糖体和线粒体计数的百分比。然后使用Scanpy中的中位数±X * 中位数绝对偏差过滤器进行QC，其中X的值分别针对不同的指标从4到5不等。具体包括线粒体计数百分比（最大值=25%，X=5）、核糖体计数百分比（最大值=30%，X=5）、前20个基因中的计数百分比（X=5）、log1p总计数（X=4）和检测到的log1p基因（X=4）。接下来，使用Scanpy中实现的scrublet算法和默认设置识别并移除了重复样本（16）。

### 数据集整合
为了联合分析所有转录组数据集中的单细胞/核，我们使用了scVI变分自动编码器框架（17）。具体来说，我们将每个患者ID（每个数据集一个）设置为batch_key，并将线粒体计数百分比（pct_mito）和核糖体计数百分比（pct_ribo）设置为连续协变量。模型设置了两个隐藏层和一个30维的潜在空间。模型的生成端被指定为负二项分布。然后使用30维的潜在空间进行最近邻识别、Leiden聚类（分辨率=0.4，风味=‘igraph’）和UMAP可视化，所有这些都使用Scanpy实现（16）。

### 细胞类型注释
使用之前关于PPGLs的研究中建立的标记（10, 15）对Leiden聚类的细胞进行注释：Chromaffin_cells：HAND2、SLC18A1、TH、PHOX2A；Cortex_cells：CYP11B1、STAR；Sustentacular_cells：SOX10、CDH19、S100B、SOX2；T_cells：CD4、TRBC1、TRBC2；Macrophages：CSF1R、CD163、C1QA；Mast_cells：TPSAB1、TPSB2；B_cells：JCHAIN、CD79A、CD79B；Endothelial_cells：ROBO4、FLT1；Fibroblasts：COL1A1、COL1A2、PDGFRB。在初步的过度聚类后，合并了具有相同广泛身份的簇。

### 伪批量差异表达分析
为了进行差异表达分析，使用decoupleR包（18）从每个样本中的每种细胞类型生成伪批量样本（当细胞类型超过30个时）。在DE分析中，只保留了至少有3个伪批量样本的细胞类型。然后我们使用Limma-voom工作流程（19）寻找细胞类型特异性标记，模型为‘～ cell_type’，并比较所有细胞类型对之间的差异。如果标记在所有比较中都显著，则将其分配。我们应用类似的工作流程来寻找转移和SOX2状态中的差异表达基因，模型为‘～ 0 + cell_type + cell_type: Metastasis’和‘～ 0 + cell_type + cell_type: Chrom_SOX2_status’。

### 配体-受体相互作用预测
使用LIANA+（20）进行配体-受体相互作用预测。选择这种方法是因为它允许使用一系列配体-受体算法以及一个集成的配体-受体相互作用数据库。在这里，使用了五种算法（CellPhoneDB（1000次排列）、Connectome、log2FC、NATMI和SingleCellSignalR），并在aggregate_rank函数中使用合并版本的数据库（在LIANA+中称为‘consensus’）。

### LIANA+信号点图
使用LIANA+包内的原生绘图功能，通过命令li.pl.dotplot可视化顶级配体-受体相互作用，参数包括：colour = ‘magnitude_rank’、size = ‘specificity_rank’、inverse_size = true、inverseColour = true、top_n = 20、orderby_ascending = true。我们按特异性对以chromaffin细胞为来源的相互作用进行了排序。这些通过‘orderby’、‘target_labels’和‘source_labels’参数进行控制。

### 热图绘图
在使用decoupleR对数据集进行伪批量处理后，根据每百万计数的结果andanData对象生成热图，并使用Scanpy的sc.pl.heatmap函数生成热图，参数包括log = false、standard_scale = ‘var’。

### UMAP绘图
使用Scanpy的sc.pl.umap函数绘制UMAP，参数sort_order = true以防止表达量少的细胞被大量不表达的细胞掩盖。

### 顶级TFs和信号基因的注释
从‘https://humantfs.ccbr.utoronto.ca/download/v_1.01/TF_names_v_1.01.txt’获取了所有人类TF的列表，并使用LIANA的‘consensus’数据库检索与细胞-细胞信号相关的基因名称（数据库中的配体或受体）。

### 代码和数据的可访问性
我们的代码和处理后的数据可以在https://github.com/Andoniadou-Lab/SOX2_PPGL上找到。我们提供了一个Jupyter Notebook，其中包含了用于处理CellRanger输出的所有Python代码。此外，我们提供了一个R脚本，用于使用Limma-voom进行差异基因表达分析。最后，我们提供了带有细胞类型注释的AnnData对象作为资源，以便其他人可以复制我们的工作。Cell Ranger输出文件（原始和过滤后的计数矩阵）已存储在Figshare上，DOI为10.6084/m9.figshare.29447750。

### 生成多西环素诱导的SOX2过表达的稳定PC12细胞系
**克隆**
使用PB-TO-hNGN2质粒（CAT#172115，Addgene，美国）作为骨架，生成了(PB)TetO-SOX2_2xNLS-eGFP载体。将hNGN2 cassette替换为小鼠Sox2（#20326，Addgene，美国），并将mTagBFP2替换为2xNLS-eGFP报告基因（由F. Riccio捐赠）。根据制造商的说明，使用Q5? High-Fidelity 2X Master Mix（New England Biolabs，M0492S，美国）和以下引物扩增Sox2和2xNLS-eGFP：
- Sox2正向引物：CGTACCACTTCCTACCCTCGTAAAGGATCCGCCGCCACCATGTATAACATGATGGAGACGGAG
- Sox2反向引物：GGGTGGGCGATCGATTCGCGAGTTTAAACTCACATGTGCGACAGGGG
- 2xNLS-eGFP正向引物：GTCAAACTCGACGGCGGTTCTGGAGGTCCTGCTGCAAAGCGCGTT
- 2xNLS-eGFP反向引物：AACTAGAAGGCACAGAATTCTTAGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
使用BamHI、PmeI、NotI和PpuMI（New England Biolabs，美国）切割PB-TO-hNGN2骨架，以便插入Sox2和2xNLS-eGFP片段。PCR产物和切割后的骨架通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用Monarch DNA Gel Extraction Kit（New England Biolabs，T1120S）切割和纯化适当的条带。根据制造商的说明，使用HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs，E2621S）组装这四个片段。将组装好的质粒转化到NEB? 10-beta Competent E. coli（High Efficiency；New England Biolabs，C3019H）中。筛选阳性克隆，并通过Sanger测序验证最终构建。

**转染和细胞系生成**
为了生成一个SOX2过表达的稳定PC12细胞系，使用Lipofectamine 3000（CAT# L3000001，Thermo Fisher Scientific，美国）将（PB）TetO-SOX2_2xNLS-eGFP和PiggyBac转座质粒一起转染到PC12细胞（CAT# CRL-1721，ATCC，美国）中，遵循制造商的协议。转染后48小时，用puromycin（3 μg/mL）选择细胞3周。在下游实验前48小时，用多西环素（2 μg/mL）诱导以确认稳定整合。

### 流式细胞仪细胞周期分析
为了进行细胞周期分析，将细胞在PBS中稀释成单细胞，离心后固定在冰上的4% PFA中15分钟。经过2次PBS洗涤后，将沉淀物重新悬浮在1 mg/mL的DAPI中（稀释在PBS中，CAT# D9542，Merck，英国）中30分钟。然后将细胞重新悬浮在5 mM EDTA、5% FBS的1x PBS中，进行细胞周期分析。数据在BD LSRFortessa? Cell Analyzer上收集，并使用FlowJo进行分析。 gating基于相应的未处理细胞对照。

### RNA提取和qPCR
使用Monarch? Total RNA Miniprep kit（CAT# T2010S，New England Biolabs，美国）根据制造商的说明从收获的细胞中提取总RNA，包括DNase I处理。使用NanoDrop? One仪器（Thermo Fisher Scientific，美国）确定RNA浓度和质量。然后按照制造商的推荐使用QuantiTect Reverse Transcription kit（CAT#205314，Qiagen，德国）将RNA转换为cDNA。接下来，在CFX Connect平台上使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（CAT#1725121，Bio-Rad，美国）进行RT-qPCR，重复三次。

### Sox2引物
- Sox2正向引物：AACGGCAGCTACAGCATGATGC
- Sox2反向引物：CGAGCTGGTCATGGAGTTGTAC

### 结果
无论突变和肿瘤位置如何，SOX2+细胞均存在于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中。为了确定PPGL肿瘤中存在潜在的干细胞，我们专注于SOX2，我们之前已经确定它是肾上腺髓质谱系的干细胞/前体细胞的标志物（14）。扩展了之前关于PPGLs中干细胞标志物的报告（13），我们测试了来自不同肿瘤位置、突变和恶性状态的19个PPGLs的FFPE切片中的SOX2表达。这个队列包括12个肾上腺PCCs和7个肾上腺外PGLs，其中两个位于颈动脉体，三个位于腹部，两个位于胸部。15个患者中有germline突变，涉及NF1、SDHC、RET和SDHB，而三个患者有RET和VHL的体细胞突变。五个肿瘤是转移性的（即原发性肿瘤后来发生了转移），其中三个含有SDHB突变。肿瘤数据见表1。使用针对SOX2的抗体进行免疫染色，在所有测试的肿瘤中都发现了阳性细胞（图1B、C、D、E、F、G、H，A为阴性对照）。不同肿瘤位置之间存在异质性。SOX2阳性细胞的比例从0.93%到8.31%不等，平均每个细胞核的SOX2+比例为4.54%（见文章末尾的补充材料部分）。这些数据证实，无论肿瘤类型、转移状态或突变状态如何，PPGLs中都存在SOX2+细胞，正如在这个小型肿瘤队列中观察到的那样。表1. SOX2表达分析肿瘤队列信息。肿瘤ID、肿瘤类型、肿瘤状态、转移情况、已识别的变异、确认的种系突变、确认的体细胞突变：PCC1（嗜铬细胞瘤，原发性，无NF1变异）；PCC2（嗜铬细胞瘤，原发性，无NF1变异）；PCC3（嗜铬细胞瘤，原发性，无NF1变异）；PCC4（嗜铬细胞瘤，原发性，无SDHC变异）；PCC5（嗜铬细胞瘤，原发性，无变异）；PCC6（嗜铬细胞瘤，原发性，无RET变异）；PCC7（嗜铬细胞瘤，原发性，RET变异未知）；PGL8（颈动脉体副神经节瘤，原发性，无变异）；PCC9（嗜铬细胞瘤，原发性，无VHL变异）；PCC10（嗜铬细胞瘤，原发性，无变异）；PCC11（嗜铬细胞瘤，原发性，无变异）；PGL12（纵隔副神经节瘤，原发性，SDHB c.136C>T）；PGL13（腹膜后副神经节瘤，原发性，SDHB外显子1缺失）；PGL14（颈动脉体副神经节瘤，原发性，SDHB无变异）；PGL15（腹主动脉旁副神经节瘤，原发性，SDHB c.268C>T，p.Arg90*）；PGL16（腹主动脉旁副神经节瘤，原发性，SDHB c.338G>A，p.Cys113Tyr）；PGL17（纵隔副神经节瘤，原发性，SDHB c.79C>T，p.Arg27*）；PGL18（嗜铬细胞瘤，原发性，无变异）；PGL19（嗜铬细胞瘤，原发性，无变异）。下载：高分辨率图像（1MB）；下载：全尺寸图像。

图1. 使用针对SOX2的抗体对嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PPGLs）的FFPE切片进行免疫组化染色。在所有面板中，SOX2阳性的细胞呈棕色，用苏木精复染。(A) 未加一抗的负对照染色。(B) 具有NF1突变的非转移性嗜铬细胞瘤PCC1至PCC3。(C) 具有SDHC突变的非转移性嗜铬细胞瘤PCC4。(D) 具有RET突变的非转移性嗜铬细胞瘤PCC5至PCC7。(E) 具有VHL突变的恶性副神经节瘤PGL8和非恶性嗜铬细胞瘤PCC9。(F) 具有SDHB突变的非恶性副神经节瘤PGL12至PGL14和恶性副神经节瘤PGL15至PGL17。(G) 无已知突变的非恶性嗜铬细胞瘤PCC10和PCC11。(H) 无已知突变的恶性嗜铬细胞瘤PCC18和PCC19。比例尺：50 μm。

通过对PPGLs进行单细胞分析，发现了另一个表达SOX2的嗜铬细胞群体。为了研究肿瘤细胞群的分子谱型，我们利用了已发表的单核数据集（10），包括九个PPGLs（PGL20、PGL21至PGL29）和一个PCC（PCC22）。此外，我们对三个新鲜肿瘤样本（PCC30、PGL31和PGL32）进行了单细胞分析，并对另外四个冷冻样本（PGL33至PGL36）进行了单核分析。在新样本中，有两个是转移性的（PGL32和PGL33），三个具有SDHB的种系突变，两个具有SDHD的种系突变（其中一个为转移性）。所有用于转录组分析的肿瘤数据均列于表2中。为了进行比较，我们还纳入了两个已发表的正常肾上腺组织的单核数据集（Healthy1和Healthy2）（15）。

表2. 用于转录组分析的肿瘤元数据。
| 来源 | 原始出版物中的肿瘤ID | 本出版物中的肿瘤ID | 肿瘤类型 | 单细胞或单核 | 肿瘤状态 | 转移情况 | 转移部位 | 识别出的变异 |
| ---- | -------------- | ------------ | -------- | -------- | ------- | --------- | -------- | -------- |
| Flynn等人（10）E019-P1 | PGL20 | 腹部副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.418G>T | 是 |
| Flynn等人（10）E123-M1 | PGL21 | 腹部副神经节瘤 | SN | 转移性 | 是 | 骨 | SDHB c.380T>G | 否 |
| Flynn等人（10）E140-P1 | PCC22 | 嗜铬细胞瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.380T>G | 是 |
| Flynn等人（10）E143-M1 | PGL23 | 腹部副神经节瘤 | SN | 转移性 | 是 | 腹部 | SDHB c.268C>T | 是 |
| Flynn等人（10）E146-P1 | PGL24 | 腹部副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.136C>T | 是 |
| Flynn等人（10）E156-P1 | PGL25 | 膀胱副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.526G>T | 是 |
| Flynn等人（10）E166-M1 | PGL26 | 腹部副神经节瘤 | SN | 转移性 | 是 | 腹部 | SDHB c.72+1G>T | 是 |
| Flynn等人（10）E171-M1 | PGL27 | 腹部副神经节瘤 | SN | 转移性 | 胸壁 – 第5-9肋骨 | SDHB c.736A>T | 否 |
| Flynn等人（10）E197-M1 | PGL28 | 腹部副神经节瘤 | SN | 转移性 | 胸腔纵隔淋巴结 | SDHB c.1_72del | 是 |
| Flynn等人（10）E225-P1 | PGL29 | 腹部副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.190del | G | 是 |
| 本出版物 | NAPCC30 | 嗜铬细胞瘤 | SC | 原发性 | 否 | NAN | 否 | 是 |
| 本出版物 | NAPGL31 | 腹部副神经节瘤 | SC | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.268C>T p(Arg90Ter) | 是 |
| 本出版物 | NAPGL32 | 腹部副神经节瘤 | SC | 原发性 | 否 | 骨骼 | 否 | 是 |
| 本出版物 | NAPGL33 | 颈动脉体副神经节瘤 | SN | 原发性 | 是 | 肺 | SDHD c.337_340del p.(Asp113 fs) | 是 |
| 本出版物 | NAPGL34 | 腹部副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHB c.268C>T p.(Arg90*) | 是 |
| 本出版物 | NAPGL35 | 盆腔副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHD外显子1缺失 | 是 |
| 本出版物 | NAPGL36 | 颈动脉体副神经节瘤 | SN | 原发性 | 否 | NAS | SDHD c.242C>T, p.(P81L) | 是 |
| Zethoven等人（15）E240 | Healthy 1 | NAS | NN | NN | 否 | NAN | 是 |
| Zethoven等人（15）E243 | Healthy 2 | NAS | NN | NN | 否 | NAN | 是 |

我们的分析识别出九个细胞簇，包括B细胞、嗜铬细胞、皮质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、基质细胞和T细胞（图2A）。样本在两个健康样本和17个肿瘤之间的分布显示，皮质细胞簇几乎完全来自健康肾上腺对照组，其他所有簇中都有这两个组的代表。从小鼠数据中已知的关键细胞群体标记物绘制在图2B中；对于嗜铬细胞，包括HAND2、SLC18A1、TH和PHOX2A；对于基质细胞群体，包括SOX10、CDH19、S100B和SOX2。定义每个细胞群体的标记物列在补充表2中。主要的基质细胞标记物还包括先前未描述的PTPRZ1、KIRREL3、NKAIN3和CHST9（图2C）。在每个数据集中，所有簇的比例显示出基质细胞的比例存在差异，在PGL36中该簇的比例较高（31%）（图2D）。将转移性疾病患者的嗜铬细胞簇（7个肿瘤）与分析时未转移的肿瘤（10个肿瘤）进行比较，发现了一些可能与转移相关的因素。主要的候选转移基因包括GLCE和NELL1（两者都与肿瘤基质有关）；C17orf97（LIAT1）；GHR（编码生长激素受体，已知在癌症转移和化疗抗性中起作用）；MND1（参与细胞周期调控和DNA修复，是多种癌症的预后标志物）；CREB5（被认为促进结直肠癌和胶质瘤的侵袭和转移）。EZH2（一种促进癌症进展的组蛋白甲基转移酶）和PIMREG（通过NF-κΒ促进侵袭性和多种肿瘤的预后）也属于这一组（图2E）。EZH2、MND1和PIMREG已通过bulk RNA-seq独立确定为与SDHx肿瘤的转移相关（15）。

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图2. 对PPGLs的单细胞分析显示肿瘤嗜铬细胞中SOX2的表达。(A) 整合数据集的UMAP图，每种细胞类型（左）和患者组（右 – 健康 vs 肿瘤）分别着色。(B) 与识别出的细胞群体相关的关键标记物的点图。(C) 按统计显著性从上到下排序的基质细胞中顶级标记基因的热图。颜色对应于基因范围的 minimum-maximum 标准化值。(D) 每个测序样本中细胞类型比例的堆叠条形图。(E) 比较转移性（左）和非转移性（右）样本中嗜铬肿瘤细胞中顶级标记基因的热图。基因按统计显著性从上到下排序，上调基因在上，下调基因在下。颜色对应于基因范围的 minimum-maximum 标准化值。(F) 所有肿瘤细胞中SOX2表达的UMAP图，点按其表达值排序。(G) UMAP显示SOX2（蓝色）、MKI67（循环细胞，黄色）和双阳性细胞（红色）。如果细胞至少有一个转录本，则被分类为阳性。(H) 每个样本中SOX2+细胞比例的条形图。Y轴的距离采用log10刻度，为了视觉效果，SOX2+比例为0%的数据集在Y = 0.0001处绘制。X轴添加了抖动以减少重叠观察。(I) 热图显示在高SOX2+细胞比例的肿瘤中区分嗜铬肿瘤细胞和低SOX2+细胞比例的肿瘤中的顶级转录因子编码基因，以1%为切割点（见H）。基因按统计显著性从上到下排序。颜色对应于基因范围的 minimum-maximum 标准化值。(J) 热图显示与信号传导相关的基因，区分高SOX2+细胞比例的肿瘤中的嗜铬肿瘤细胞和低SOX2+细胞比例的肿瘤中的嗜铬肿瘤细胞，以1%为切割点（见H）。基因按统计显著性从上到下排序。颜色对应于基因范围的 minimum-maximum 标准化值。(K) LIANA+点的热图显示前20个相互作用，其中嗜铬细胞是来源，并按特异性排名排序。颜色对应于大小，同时点的大小随特异性排名增加而增大。

仅对肿瘤样本进行的基因表达分析确认了基质细胞簇中SOX2的最高表达（图2F）。出乎意料的是，嗜铬细胞簇中也广泛表达了SOX2。将SOX2表达（蓝色）与MKI67（标记循环细胞的黄色）结合起来显示，双阳性细胞（红色）位于嗜铬细胞簇中（图2G，左）。这证实了一群表达SOX2但具有嗜铬细胞特性的循环肿瘤细胞，这与健康对照组中的任何群体都不同（图2G，右）。在健康对照组和17个肿瘤中的15个肿瘤中都检测到了SOX2+细胞（补充图1）。我们预计SOX2转录本的检测比免疫染色检测到的蛋白质更为稀少（34），因此这些检测中两个肿瘤样本中缺乏SOX2表达并不证明肿瘤中没有SOX2+细胞。总体而言，77%的肿瘤中表达SOX2的细胞具有可检测的TH转录本。不同肿瘤中表达SOX2的细胞比例各不相同，其中五个肿瘤的SOX2+细胞比例明显高于健康对照组（图2H）。鉴于样本间表达SOX2的细胞数量变化很大，我们决定比较SOX2+细胞比例较高的嗜铬细胞与SOX2+细胞比例较低或缺失的嗜铬细胞（切割点为1%）。令人欣慰的是，这项分析发现差异表达最显著的转录因子编码基因是SOX2。其他排名靠前的基因包括HOXA7（其蛋白质产物可作为癌基因并促进恶性行为）和原癌基因BRF2（38, 39）（图2I和补充表3列出了所有显著因素的完整列表）。我们之前在小鼠中的研究发现，SOX2+细胞通过分泌WNT6在调节邻近细胞增殖中起主要作用（14）。比较高SOX2比例肿瘤的嗜铬细胞与低/无SOX2+细胞比例的肿瘤的嗜铬细胞，发现与细胞信号传导相关的基因表达存在差异。这些基因包括LGALS3BP（编码参与癌症进展的分泌因子）以及WNT蛋白编码基因WNT3、WNT10A、WNT11和WNT6（41, 42, 43）（图2J和补充表3）。为了进一步研究嗜铬细胞与其他肿瘤生成细胞群的关系，我们进行了配体-受体分析框架（LIANA+）分析（20）。这确定了嗜铬细胞与其他细胞群之间的细胞间通信。有趣的是，从嗜铬细胞预测的最强信号主要是向基质细胞，主要是通过粘附分子ASHG、CNTN1、NCAM1、L1CAM、ALCAM以及NRG3、PTN和APOO。向内皮细胞和成纤维细胞的信号传导是通过DLK1预测的，向巨噬细胞的信号传导是通过NRG1预测的（图2K）。总之，这些基于计算机的数据确定了PPGLs的恶性特征，并支持肿瘤嗜铬细胞异常表达SOX2，并具有与癌症促进一致的分泌特征。

在包括胶质母细胞瘤、小细胞肺癌和鳞状细胞癌在内的多种癌症中，已经证明SOX2的扩增赋予肿瘤细胞增殖优势（44, 45, 46, 47, 48）。为了确定SOX2是否在PPGL细胞中赋予增殖优势，我们生成了一个可通过多西环素可诱导地过表达小鼠Sox2的载体（(PB)TetO-SOX2-2xNLS-eGFP）（补充图2A和B）。这使得能够在多西环素作用下成功整合的PC12大鼠嗜铬细胞系中过表达Sox2（补充图2C）。定量PCR证实了经过多西环素处理的细胞与未经处理的PC12细胞或未转染的PC12细胞相比，Sox2的表达（补充图2D）。没有观察到细胞形态或细胞密度的显著差异（补充图2C）。流式细胞术的DNA含量分析显示，经过多西环素处理的转染细胞（+DOX/GFP+）和未经处理的转染细胞（?DOX/GFP+）的G2/M期细胞比例相似（分别为3.2%和3.6%）。同样，经过多西环素处理的GFP阴性未转染对照细胞（+DOX/GFP?和?DOX/GFP?）的G2/M期细胞比例也相同（1.3%）（补充图2E）。这些数据表明，单独的Sox2过表达不足以促进PPGL细胞的细胞周期进展，支持将其视为干细胞相关的特征，而不是增殖驱动因素。

PPGLs中存在可以在干细胞促进培养基中分离并在体外表达SOX2的细胞。我们之前建立了从小鼠肾上腺髓质中分离干细胞的方案（14）。我们试图确定这些培养条件是否也适用于从人类组织中分离干细胞。使用针对SOX2的抗体对妊娠12、17和19周的胎儿肾上腺髓质进行了免疫染色。在所有条件下都发现了阳性细胞（图3A）。将妊娠19周的肾上腺髓质细胞分离成单细胞悬浮液，并在定义的干细胞促进培养基中培养（14）。24小时后细胞附着，96小时时可见菌落（72小时后可以扩增和传免疫荧光检测显示，在对照胎儿样本中未检测到嗜铬细胞（未显示），但在两个独立的PCC和PGL培养物中检测到了嗜铬细胞，其中一些TH阳性细胞还表达了SOX2（图3C）。分离出的细胞至少能够进行三次传代，并且能够经受一次冻融循环。这些发现证实了PPGL细胞群体具有体外克隆能力，这与干细胞的潜能一致。

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图3. PPGL来源干细胞的体外分离和特性分析。
(A) 免疫组织化学方法证实了在妊娠12周（PCW）、17周和19周的胎儿肾上腺髓质中存在SOX2+细胞。SOX2+细胞呈棕色，组织用Haematoxylin进行对比染色。比例尺：100 μm。
(B) 在妊娠19周时，从胎儿肾上腺髓质中分离出的细胞在特定的干细胞促进培养基下3天后形成了附着性菌落。比例尺：50 μm。从具有良性Phaeochromocytoma PCC30和具有SDHD基因突变的恶性Paraganglioma PGL33中分离出的成人肾上腺髓质细胞在相同的干细胞促进培养基下也形成了附着性菌落。24小时和96小时后观察到的附着性细胞和菌落。比例尺：50 μm。
(C) 使用针对SOX2和TH的抗体进行双免疫荧光染色，证实了在干细胞促进培养基中培养10天后，PCC和PGL附着性菌落中同时表达这两种蛋白的细胞（白色箭头），以及仅表达TH的细胞（黄色箭头）。比例尺：50 μm。

接下来，我们试图确定体外分离出的SOX2+ PPGL细胞是否能够在异种移植实验中再生和转移。分离并扩增的人类SOX2+ PPGL细胞PCC30和PGL33以及对照胎儿肾上腺培养物被分散成单细胞悬浮液，并用CellTracker CMFDA标记，这种标记物在细胞内会转化为绿色荧光染料，从而可以在不转移染料的情况下追踪细胞（图4A）。纯化并标记后的体外分离干细胞以单细胞悬浮液的形式接种到受精的鸡胚绒毛尿囊膜（CAMs）上，每张CAM膜接种100,000个细胞，并培养4天（见图4B示意图）。CAM实验是在体内建立的模型，用于研究肿瘤增殖、血管生成和转移（49, 50, 51, 52, 53, 54）。每种培养物在总共10个鸡胚中进行了移植，分为两个独立实验。PCC30移植了2个鸡胚，PGL33移植了4个鸡胚，胎儿对照组移植了4个鸡胚，这些鸡胚存活下来并进一步进行了分析。对于PGL33，这导致了呈现绿色CMFDA荧光的组织团块的形成（n = 4）（图4C）。而在接种了PCC30的CAMs（n = 2个存活的鸡胚）或对照胎儿肾上腺来源的干细胞（n = 4个存活的鸡胚）中未观察到这种情况。使用针对人类核抗原（HNA）的抗体进行免疫荧光检测和针对SOX2的抗体进行免疫组织化学检测证实，新形成的组织团块中的细胞来源于接种的人类PGL33干细胞，并继续表达SOX2蛋白（图4D）。这些细胞或其后代中有一部分仍保持增殖能力，这通过CAM移植物中的人类特异性MKI67蛋白在原位检测得到证实（图4E），该蛋白标记了处于细胞周期中的细胞。在受精后14天时采集每个鸡胚的肺组织，固定后进行冷冻切片处理，以便通过观察绿色荧光来分析可能的转移情况。在宿主鸡的肺中检测到绿色CMFDA荧光，揭示了异种移植的、带有SDHD突变的PGL33来源干细胞或其衍生物的存在，证实了它们的侵袭和转移潜力（图4F）。使用针对SOX2和TH的抗体对PGL33异种移植的鸡肺进行免疫荧光染色，显示了SOX2+细胞、TH+嗜铬细胞以及罕见的双阳性细胞的存在（图4G）。总之，在异种移植实验中，体外分离出的PPGL干细胞具有肿瘤起始和转移能力。

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图4. SOX2+ PPGL干细胞在体内具有肿瘤诱导和转移能力。
(A) 用CellTracker绿色CMFDA标记物对妊娠19周的胎儿细胞进行单细胞悬浮和标记。比例尺：500 μm。
(B) 人类SOX2+细胞的体外分离和体内移植流程（在BioRender.com上创建的示意图）。
(C) 在培养4天后的PGL33鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）异种移植。溶解后的CAM的明场和紫外荧光图像，可见在血管化的CAM上形成的细胞团块。硅O环清晰可见。红色和黄色框标出了下面放大的区域，显示了该团块。
(D) 在C中，对福尔马林固定的石蜡切片进行免疫染色。使用针对人类核抗原（HNA，红色）的抗体进行免疫荧光检测，确认团块中的细胞为人类细胞。细胞核用DAPI进行对比染色。使用针对SOX2（棕色）的抗体进行免疫组织化学检测，确认存在表达SOX2的细胞。细胞核用Haematoxylin进行对比染色。比例尺：100 μm。
(E) 使用针对人类特异性MKI67探针（红色）在CAM移植物上进行RNAscope mRNA原位杂交。细胞核用Haematoxylin进行对比染色。比例尺：100 μm。箭头指示插图中检测到的MKI67 mRNA转录本。
(F) 在受精后14天的鸡胚肺部进行冷冻切片，其中CAM成功移植了胎儿肾上腺干细胞培养物、从PCC30分离的干细胞培养物或从PGL33分离的干细胞培养物。在PGL33培养物中检测到绿色荧光细胞，证实了转移。细胞核用DAPI进行对比染色。比例尺：100 μm，右侧面板的比例尺为20 μm。
(G) 在受精后14天的鸡肺部冷冻切片上进行免疫荧光染色，包括带有转移的PGL33异种移植，使用针对SOX2（品红色）和TH（绿色）的抗体。细胞核用DAPI进行对比染色。单通道的灰度图像用于清晰显示信号。黄色箭头指示SOX2阳性细胞，绿色箭头指示TH阳性细胞，白色箭头指示SOX2和TH双重阳性细胞。细胞核用DAPI进行对比染色。比例尺：50 μm。XenoT = 异种移植。

讨论
确定肿瘤和癌症中的细胞起源对于开发准确的肿瘤发生实验模型、发现预后标记物和设计靶向疗法至关重要。在各种实体瘤中已经建立了一种观点，即CSCs或TICs直接参与肿瘤的形成和维持（55, 56, 57, 58, 59, 60, 61）。我们最近发现了一种源自神经嵴的产后干细胞群体，该群体表达SOX2。在这里，我们证明了无论肿瘤位置、恶性程度或潜在的遗传改变如何，SOX2+细胞始终存在于PPGLs中。对17个PPGL单细胞RNA测序数据集的计算机分析证实了除两个肿瘤外所有肿瘤中都广泛表达SOX2，并强调了在某些肿瘤亚群中SOX2表达细胞的富集（17个中的5个），并定义了一个与转移潜力相关的稳定分子特征。除了已知的癌症进展促进因子EZH2、MND1和PIMREG（它们之前已被确定为PPGL中的候选转移标记物（15）外，我们报告了与转移行为相关的其他新候选因子。一个特别有前景的候选因子是环腺苷单磷酸（cAMP）反应元件结合蛋白5（CREB5）。在结直肠癌中，CREB5可以通过激活受体酪氨酸激酶MET来促进侵袭和转移，并与多种癌症的不良预后相关，包括肝细胞癌、胶质瘤、乳腺癌和上皮卵巢癌（27, 28）。这些候选因子需要功能验证，以确定真正的转移驱动因素，这将为识别可治疗的目标提供指导。未来包含更大肿瘤队列的研究将更好地揭示这些驱动因素，并有助于预后预测。

干细胞已被证明与癌症复发和转移有关（62, 63），并且在移植时可以再生肿瘤（64）。这项研究提供了有力证据，表明PPGL来源的SOX2+细胞具有肿瘤起始能力，能够在体外自我更新，并在异种移植实验中再生和转移——这些都是CSCs的关键特征（56）。我们在PPGLs中发现了两个不同的SOX2+群体：一个存在于健康对照组中的支持细胞群体，以及一个肿瘤特异性的嗜铬细胞亚群，这与早期的组织学观察结果一致（13）。双阳性细胞（同时表达SOX2和嗜铬细胞标记物）仅存在于肿瘤中，这一点非常有趣；这些细胞可能是肿瘤的独特干细胞，因为它们在正常肾上腺组织中不存在。这些细胞可能是由于嗜铬细胞中的干细胞样转录程序重新激活，或者是支持细胞在保留SOX2表达的同时异常分化而不像正常分化那样下调该基因。目前尚不清楚异种移植中的转移是由SOX2+肿瘤嗜铬细胞还是SOX2+支持干细胞群体引起的，但SOX2本身的表达似乎并不参与这一过程。根据转录组研究，SOX2+支持细胞不太可能是这些肿瘤的起源细胞。然而，我们的数据提出了一个可能性，即PPGLs可能同时包含从周围组织招募的正常支持细胞和来自肿瘤细胞的肿瘤样支持细胞群体，这些群体可能无法通过常规标记物区分。这些群体可能仍以非自主的方式促进肿瘤发生。

支持SOX2+肿瘤嗜铬细胞在肿瘤生长中的直接作用，这些细胞积极增殖，不同于更为静息的SOX2+支持细胞。此外，它们显示了一种独特的转录组特征，其中富含促进肿瘤发生和癌症进展的基因。我们之前的工作表明，肾上腺髓质干细胞分泌的WNT6调节嗜铬细胞的增殖（14）。在当前研究中，SOX2+肿瘤嗜铬细胞表达的几种WNT基因和其他促肿瘤因子表明它们可能通过旁分泌途径促进肿瘤发生，这与其他癌症中的观察结果一致（65, 66, 67, 68, 69, 70, 71）。总体而言，我们的发现表明PPGLs包含具有干细胞特性的细胞，这些细胞可以被分离、扩增和移植，并具有引发肿瘤的能力。这些结果提供了首次功能性证据，表明PPGLs中的SOX2+细胞具有作为肿瘤起源细胞的潜力。

补充材料
本文的在线版本链接为：https://doi.org/10.1530/ERC-25-0242

利益声明
AS目前是Relation Therapeutics公司的员工。IB目前是Novartis公司的员工。其余作者声明没有竞争利益。

资助
本工作得到了医学研究委员会（项目编号APP40962，资助CLA）；Paradifference基金会（资助CLA和RO）；德国研究基金会（DFG，项目编号314061271，TRR 205：“肾上腺：健康与疾病中的中枢枢纽”资助CLA、SRB、CS、NB和MT；项目编号288034826，IRTG 2251：“代谢疾病中的免疫和细胞策略”资助CLA、SRB和CS）；Bernice Bibby研究信托基金（资助RJO和LI）；Guy’s and St. Thomas NHSFT的NIHR生物医学研究中心（资助MQ和GSK）；以及通过DRIVE-Health CDT的Guy’s and St. Thomas NHSFT的NIHR生物医学研究中心（资助DB）的支持。BK和MVS由Wellcome Trust作为Wellcome Trust再生医学高级治疗博士计划的一部分资助（项目编号218461/Z/19/Z）。