米曲霉（Aspergillus oryzae）内源性组成型启动子的挖掘与特性分析

《Food Bioscience》：Mining and Characterization of Endogenous Constitutive Promoters in Aspergillus oryzae

　　

黄莎|罗来茂|周静英|涂瑞|何清华|李彦平

国家食品科学与资源重点实验室，中国江西省南昌市南京东路235号，330047

摘要

米曲霉作为一种高效且安全的重组蛋白生产平台，具有巨大的潜力，但其进一步发展受到可用强组成型启动子稀缺的阻碍。由于其多核丝状真菌的特性，米曲霉通过同源重组进行基因敲除的效率较低。为了解决这个问题，引入了CRISPR-Cas9基因编辑系统来提高米曲霉的编辑效率。首先，通过体外转录获得了针对wA基因的sgRNA，并确认其能够激活Cas9蛋白的切割活性。随后，将sgRNA表达盒和Cas9编码基因克隆到pF332载体中。转化到米曲霉后，获得了白色菌落的转化体，从而建立了该菌株的初步基因编辑系统。基于转录组分析和数据挖掘，筛选出了十个候选组成型启动子。将基因编辑质粒与携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的启动子测试质粒共转化，得到了在wA位点具有特异性整合的转化体。通过荧光显微镜观察和定量荧光强度分析，鉴定出一个具有强转录活性的启动子，并将其用于RML脂肪酶基因的高水平表达。

引言

米曲霉是一种广泛用于工业生产的真核生物。它属于曲霉属，广泛分布于含有丰富有机物的土壤、发酵食品和腐烂植物中（Jin等人，2022年）。几千年来，它一直被用于传统发酵领域，主要用于生产发酵豆类、酱油和清酒等食品（Kusumoto等人，2021年；Nishida，2021年；Sheng等人，2025年；Zhao等人，2024年）。尽管米曲霉与黄曲霉的基因组相似度为99.5%，但它不产生黄曲霉素，并且获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的安全认证，这使其在许多领域得到广泛应用（Daba等人，2021年；Han等人，2024年）。米曲霉的基因组包含与生物质降解、转录调控和细胞信号传导相关的多种基因。特别是在与分泌通道和分泌蛋白相关的基因方面表现出色，有助于外源蛋白的正确折叠和分泌（Zhao等人，2012年）。因此，米曲霉具有较高的分泌能力和优异的安全性，使其成为外源蛋白表达的理想宿主菌株。它在现代工业生产中越来越受到关注。

米曲霉在蛋白质分泌方面表现出色，能够产生高产量的蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和脯氨酰肽酶（Gao等人，2023年）。然而，其外源蛋白的表达仍面临许多挑战。目前，用于调节米曲霉中外源基因表达的启动子有限，主要集中在少数几个组成型和诱导型启动子上。这些启动子的调控强度单一，难以满足复杂代谢工程的需求。启动子是基因表达调控的核心元素，位于基因转录起始位点上游，负责RNA聚合酶的识别和结合，从而启动基因转录（Feklistov，2013年）。在丝状真菌中，选择合适的启动子对于高效和可控的异源蛋白基因表达至关重要。因此，挖掘和研究新的启动子资源以有效调节米曲霉中的异源蛋白表达已成为当前研究的重要方向。传统上，米曲霉中的靶向基因敲入主要依赖于基于同源重组（HR）的系统。这些系统通常需要使用缺乏非同源末端连接（NHEJ）能力的宿主。然而，这种方法由于需要准备宿主和转化模板，耗时且劳动强度大（Todokoro等人，2024年）。米曲霉的菌丝和分生孢子通常是多核的（Goda等人，2024年；Ishi等人，2005年）。在基因编辑过程中，即使目标基因在一个核中被成功编辑，其他未编辑的核仍可能存在。这导致基因编辑事件在表型上难以观察，或者需要额外的筛选来分离纯合子。这种复杂性阻碍了整个细胞群体基因组的有效和同步修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现彻底改变了米曲霉中低同源重组效率的问题。CRISPR/Cas9系统可以在特定的基因组位点精确诱导双链断裂（Averina等人，2024年；Li等人，2023年）。随后，细胞通过NHEJ或HR途径修复这些断裂。通过同时递送Cas9核酸酶和具有同源臂的修复模板，可以显著提高靶向基因敲入的效率（Todokoro等人，2024年）。

Rhizomucor miehei脂肪酶（RML）是一种具有重要工业应用潜力的脂肪酶。由于其独特的催化特性，在食品加工、制药生产和洗涤剂生产等多个领域显示出广阔的应用前景（Alag?z等人，2021年）。然而，野生型R. miehei菌株在RML的生产方面存在一些问题，如酶产量低和酶稳定性差，难以满足工业生产的高效率要求。为了克服这些缺陷，我们选择利用米曲霉的强蛋白质合成和分泌能力来生产RML，并探索强启动子以共同调节米曲霉中RML的表达，从而构建高产RML的工程菌株。通过优化表达系统和启动子，有望提高RML的产量和稳定性，从而促进其在工业领域的广泛应用。

本研究系统地解决了将米曲霉发展为异源蛋白生产细胞工厂的关键瓶颈：缺乏强组成型启动子以及由于其多核特性导致的同源重组效率低的问题。为此，首先在该菌株中建立了高效的CRISPR-Cas9基因编辑平台。通过转录组分析和生物信息学数据挖掘，筛选出了十个候选组成型启动子。为了高通量和可视化地评估它们的活性，构建了一个报告系统：将编辑质粒和携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的启动子测试质粒共转化到米曲霉中，成功生成了在wA位点具有eGFP报告基因特异性整合的工程菌株。通过荧光显微镜观察和定量荧光强度分析，鉴定出了具有最强转录活性的启动子。最终，将选定的高活性启动子应用于驱动RML脂肪酶基因的表达，实现了该酶的有效分泌生产。这项工作不仅为米曲霉提供了关键的基因编辑工具和一组强组成型启动子资源，还建立了一个集成的“编辑-筛选-表达”平台，为在该宿主中高效生产多种重组蛋白奠定了坚实的技术基础。

章节片段

菌株和培养条件

米曲霉 H4菌株是由我们的实验室在九曲发现的，H4-ΔpyrG是米曲霉 H4的自发突变菌株，能够在含有5-FOA和尿嘧啶的平板上生长。它们在wort琼脂培养基（250克wort提取物，2个蛋清，15克琼脂粉，加水至Baume 6.5）上培养。米曲霉 H4基础培养基包含2克/升MgSO₄·7H₂O、2克/升K₂SO₄、2克/升(NH₄)₂SO₄、5克/升色氨酸和0.6毫升/升微量元素溶液。

优化米曲霉 H4原生质体的制备条件

Tween 80是一种非离子表面活性剂，化学名称为聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，广泛用作化妆品、药品和食品中的乳化剂（Nielsen等人，2016年）。研究发现，在黑曲霉培养过程中添加Tween 80可以使得菌丝分布更加均匀，减少菌丝的缠结和聚集（Nguyen & Ranamukhaarachchi，2020年）。为了缓解米曲霉菌丝的缠结和聚集，

结论

在这项研究中，我们开发了一种针对米曲霉的CRISPR/Cas9基因编辑系统，目标基因是wA，并使用pyrG作为营养筛选标记。这种方法使阳性纯合体的转化效率提高了90%。通过自我测试转录组和公共转录组数据的分析，我们鉴定出了10个能够调节米曲霉中关键代谢途径的启动子。此外，我们还成功鉴定出六个具有更高活性的组成型启动子

CRediT作者贡献声明

何清华：正式分析。李彦平：资源获取和资金申请。周静英：实验研究。涂瑞：软件开发。黄莎：写作——审稿与编辑，初稿撰写，验证，方法学设计，数据管理。罗来茂：实验研究，概念构思

作者声明他们没有已知的会影响到本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

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资金来源

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