《Forensic Science International: Genetics》：A Triplex RPA-LFA Assay for the Simultaneous Detection of Forensically Important Necrophagous Insects in Complex DNA Mixtures
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杨凤琴|唐轩|文丹|叶成新|王浩|张向燕|尚彦杰|张长全|郭亚东中南大学基础医学院法医学系，中国湖南长沙410013摘要准确鉴定食腐昆虫的物种在法医调查中至关重要。为克服复杂的形态学鉴定方法（尤其是对幼虫阶段）的局限性以及耗时的DNA测序方法，我们开发了一种三重组酶聚合酶扩增结合
杨凤琴|唐轩|文丹|叶成新|王浩|张向燕|尚彦杰|张长全|郭亚东
中南大学基础医学院法医学系，中国湖南长沙410013
摘要
准确鉴定食腐昆虫的物种在法医调查中至关重要。为克服复杂的形态学鉴定方法（尤其是对幼虫阶段）的局限性以及耗时的DNA测序方法，我们开发了一种三重组酶聚合酶扩增结合侧向流动分析（RPA-LFA）的技术。该技术针对三种常见的法医重要昆虫：Chrysomya megacephala、Lucilia sericata和Sarcophaga peregrina。我们全面评估了该技术的特异性、灵敏度和混合DNA检测能力。结果表明其具有极高的特异性；特异性测试线（T线）通过不同的位置准确区分了目标物种，且没有与其他四种常见食腐昆虫发生交叉反应。此外，灵敏度分析显示检测限低，范围从62 pg到250 pg。此外，该技术还能在复杂的混合DNA样本中准确识别目标物种。总之，所开发的三重组酶RPA-LFA系统能够快速、直观地鉴定法医昆虫物种，为法医现场调查提供了一种高效可靠的新型工具。
引言
准确鉴定犯罪现场发现的食腐昆虫物种是估算死亡时间（PMI）的首要步骤[1]。目前的鉴定方法主要包括形态学分类、分子生物学技术以及物理化学特性（如光谱数据和角质烃（CHCs）的综合分析，并结合多变量统计或机器学习[2]、[3]、[4]。然而，形态学鉴定严重依赖于专业的分类学知识，对于缺乏明显诊断特征的幼虫来说变得越来越困难。尽管像DNA测序这样的分子方法可以克服幼虫鉴定的难题，但它们耗时、操作复杂且依赖于实验室设备。此外，基于光谱和CHC数据的机器学习模型的新兴方法仍需在可重复性、标准化和法律可接受性方面进行验证，且尚未在实际应用中得到报道。因此，现有方法都不适合快速现场应用。因此，开发一种快速、可视化且兼容多种物种的分子即时检测（POCT）方法对于提高法医昆虫证据的现场应用价值至关重要。
重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种等温核酸扩增技术。它在25–42°C的温度范围内运行，并能在37°C下5–20分钟内产生可检测信号[5]。该技术克服了传统核酸扩增的局限性，后者依赖于复杂的热循环和实验室条件，使其适合现场使用。当与侧向流动分析（LFAs）技术结合时，RPA可以实现可视化结果和现场直接解读[6]。RPA和LFA的结合（RPA-LFA）被认为是一种理想的POCT工具，已广泛应用于临床病原体检测、食品安全和环境监测[7]、[8]、[9]。在法医昆虫学领域，我们的团队之前率先将这项技术用于快速鉴定单一食腐昆虫物种，并成功实现了高灵敏度和特异性的Chrysomya megacephala Fabricius（Calliphoridae）的鉴定[10]。
在法医现场调查中，一个证据样本通常包含多种食腐蝇类的混合物[1]。依赖单重检测方法需要针对每个目标进行单独的反应并使用多条测试条。这种方法降低了检测效率，增加了成本，并消耗了有限的样本，阻碍了快速现场筛查。因此，开发多重RPA-LFA检测方法已成为重要的研究重点。目前，多重RPA-LFA系统已在食品安全等领域得到成功应用，能够同时可视化检测并快速解读多达三个目标（例如沙门氏菌及其主要血清型[11]、[12]。在法医昆虫学领域，这项技术尚未得到广泛应用，探索其用于多重物种鉴定的潜力是一个有前景的方向。
为满足这一实际需求并基于我们之前的发现，我们的团队开发了一种多重RPA-LFA检测方法，以提高现场快速鉴定食腐昆虫的效率。在这项研究中，我们设计了针对三种物种的特异性引物：C. megacephala的内转录间隔区1（ITS1）、Lucilia sericata的CAD（Meigen，Calliphoridae）和Sarcophaga peregrina的内转录间隔区2（ITS2，Robineau-Desvoidy，Sarcophagidae）。我们成功地在单个反应管中同时扩增了这三个目标，并在单个LFA条上实现了它们的可视化区分。这种方法为法医现场调查提供了一种低成本、快速且可视化的工具，及时提供物种信息以支持后续的死亡时间估算和刑事调查。
章节片段
样本采集和DNA提取
样本采集、物种鉴定和DNA提取的协议与我们之前研究[10]的第2.1节和表2中的描述相同，此处不再详细说明。昆虫DNA的提取按照Stable Pure Universal Genomic DNA Extraction Kit（AG21009，Accurate Biotechnology Co., Ltd.）的说明进行。
多重RPA引物的设计和筛选
为了同时鉴定这三个目标物种，我们获得了不同物种的序列
样本选择
根据初步数据[10]，选择C. megacephala和L. sericata（在法医案件中最常见的物种）以及S. peregrina（南方地区的主要物种）作为开发三重组酶RPA-LFA检测的主要目标。此外，还收集了C. vicina、C. rufifacies、S. crassipalpis和M. scalaris的DNA样本以评估检测的特异性。
引物和探针的初步筛选
目标序列的GenBank登录号列在表1中。引物
讨论
在法医实践中，C. megacephala、L. sericata和S. peregrina是中国乃至全球最常见的且具有法医意义的蝇类。这些物种分布广泛，经常共同栖息在同一具尸体上[16]、[17]、[18]、[19]。因此，本研究专注于开发针对这三种昆虫的快速物种鉴定方法。
成功建立这种三重组酶RPA-LFA检测方法的核心在于引物和探针的双特异性设计。
结论
总之，本研究建立了一种用于快速鉴定三种具有法医意义的食腐蝇类（C. megacephala、L. sericata和S. peregrina）的三重组酶RPA-LFA检测方法。通过靶向ITS1、CAD和ITS2区域，该检测方法表现出优异的灵敏度和特异性。它成功克服了形态学鉴定和Sanger测序的局限性，特别是在分析降解或混合的昆虫证据时。
伦理声明
由于本研究的对象是无脊椎动物，因此不需要正式的伦理审查和动物伦理批准。所有样本的收集均符合当地法律法规，未涉及任何濒危或受保护的物种。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（编号82572150、82402196）和公安部法医学研究中心的开放研究项目（编号2025CSEEKFKT02）的支持。
CRediT作者贡献声明
郭亚东：监督、项目管理、资金获取。张长全：监督、数据管理。杨凤琴：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学设计、数据分析、数据管理。文丹：项目管理、方法学设计。唐轩：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学设计、调查、数据分析、数据管理。尚彦杰：方法学设计、调查、数据管理。张向燕：
致谢
我们感谢北京市公安局、长沙市公安局和湖南省湘雅法医服务中心提供的食腐昆虫样本。
所有作者都参与了这项研究。杨凤琴和唐轩负责实验设计、数据管理、数据分析及初稿撰写。其他作者帮助提高了文章的质量。郭亚东对文章进行了修订和监督。最终的手稿
