六极频率多重检测ICR-FT质谱成像技术，用于高分辨率和高重复率的分子分析

《International Journal of Mass Spectrometry》：Hexapolar Frequency Multiple Detection ICR-FT Mass Spectrometry Imaging for High Resolution and High Repetition Rate Molecular Analysis

　　**弗兰克林·E·利奇 | 唐纳德·F·史密斯**
**乔治亚大学化学系，312 East Campus Rd，雅典，GA 30602**

**摘要**
傅里叶变换质谱技术能够实现对最复杂样品的分子测量。这一成就基于时间域信号的采集，这些信号在转换到频率空间后形成质谱图，从而提供了最高的质量分辨率。由于技术和大规模资金限制，当前的技术水平主要受到最大磁场强度为21 T的超导磁体的限制。为了实现更高质量分辨率和通量的下一代测量，傅里叶变换质谱（FTMS）实验人员必须不断探索新型的质量分析器设计和离子检测方案。本文首次展示了在MALDI质谱成像背景下六极频率倍增（3Ω）技术的应用。这一实验对新兴的质谱技术提出了重大挑战，因为样品的复杂性以及分子靶标在扫描过程中光谱强度的显著变化使得分离和检测变得更加复杂。在14.5 T的磁场下进行的实验表明，可以分辨出标准脂质同位素及其质量干扰，质量分辨率达到127.5万（m/z 400时），质量准确度低于200 ppb。尽管在m/z 900处的质量分辨率降至55万，但这些测量能力仍然适用于大多数脂质MALDI实验。同时，通过对同位素精细结构的更常规观测，进一步增强了仅基于质谱（MS1）的分子鉴定的可靠性。

**引言**
傅里叶变换质谱（FTMS）为气相离子的质量测量提供了最高的仪器性能。该技术依赖于捕获离子与约束磁场（ICR-FTMS）或电动力场（Orbitrap FTMS）的相互作用。在这两种情况下，通过分析离子的捕获运动频率与其质荷比之间的关系（以及特定捕获器设计的额外校正），可以实现质量测量。更多详细信息可见于最近的FTMS相关综述。ICR和轨道阱捕获方式在高频下都能达到最佳性能。对于ICR，提高回旋频率的最直接方法是增强磁场强度；频率与磁场强度呈线性关系。此外，质量准确性和离子容量（即捕获器在峰合并开始前能存储的离子数量）也与磁场强度呈二次方关系。因此，高磁场FT-ICR MS能够提供超高性能的质谱，具有高分辨率、高质量准确性和高灵敏度。目前，最高磁场强度为21 T，仅有两台仪器在该磁场下运行。遗憾的是，更高磁场强度的螺线管磁体的开发进展缓慢，需要采取替代策略来提升测量能力。随着离子频率的增加，达到指定分辨率所需的时间可以缩短。然而，FTMS的扫描时间较长，这限制了通量，特别是在进行质谱成像研究或测量大样本时。因此，FTMS的仪器设计工作主要集中在提升最终性能和实验通量方面。

**为了实现更高性能，必须考虑终端离子捕获器的设计。**典型的现代质谱仪平台通常是混合型的，包含多个质量分析器，用于质量选择、离子激活和/或低分辨率质量分析。在大多数FTMS系统中，只有一个能够捕获离子并测量频率的质量分析器。对于Orbitrap FTMS，自首次展示以来，其设计不断改进，以生成更高频率的分析有用信号；但遗憾的是，捕获器设计高度集成在整体平台中。例如，早期的线性离子阱-Orbitrap混合质谱仪使用D3011单元，而后来的Tribrid系统则采用尺寸更小的D2012单元。根据Orbitrap的基本原理，捕获器直径的减小导致离子经历的电场增强，从而产生更高频率。理想情况下，应采用即插即用的组件设计以实现升级，但根据当前技术发展路径，用户必须购买全新的质谱仪。值得一提的是，目前的两台21 T系统结合了商用Orbitrap前端，可与ICR-FTMS协同工作。

**ICR-FTMS**则提供了修改运行中的质量分析器并开发新型离子捕获器的机会，类似于自己动手（DIY）解决方案。该技术有着丰富的进展历史。本文主要关注提高测量频率的方法。典型的捕获器设计中，两组相对板以90度角排列：一组提供激发信号，增加离子的相干运动半径，使其更接近另一组作为检测电极的板。这种最简单的配置是偶极型的，用于测量离子在径向约束磁场中的基本频率（Ω）。在频率空间中，实验人员可以设计策略来测量频率倍增（如2Ω、3Ω、4Ω等），分别对应四极、六极和八极方案。现有技术包括在10 T下修改Thermo Ultra细胞以实现2Ω检测，以及使用印刷电路板技术实现更高阶的检测。为了在高磁场下实现频率倍增检测，已在21 T下使用4Ω分析器单元进行了完整蛋白质测量的初步演示。虽然这种实现方式可以提高性能，但检测电极面积减小，导致信号幅度降低，且在信号预放大前可能因电容损失而进一步减弱。此外，谐波也会引入数据中，需要深入理解离子轨迹和图像电流检测产生的相关信号。

**傅里叶变换质谱成像（MSI）**是一种无标记的化学和空间信息同时获取方法，可用于复杂表面的分子定位。该方法常用于植物和动物组织研究，通过分子定位提供生物学空间视图。结合基于FTMS的质量分析可提高分子特异性。ICR-FTMS成像提供详细的分子信息，但测量时间较长。如前所述，质量分辨率随磁场强度线性提高，而质量准确性和动态范围则呈二次方关系。因此，高磁场FT-ICR MS成像能更可靠地识别更多物种。此外，由于高分辨率下较短的时域采集时间可提高图像采集速度。基于当前设计和资金限制，21 T仍将是最高可用磁场，仅有一台18 T仪器在运行，少数实验室拥有12-15 T磁场。因此，寻找更经济可行的方法来提升核心实验性能至关重要。此前，已在7 T和9.4 T下使用动态谐振细胞（DHC）和窄孔径检测电极（NADEL）实现了四极检测。此外，还可以采用高级数据处理技术（如最小二乘拟合、LSF）或联合压缩感知和子空间建模来加快MSI实验速度。本文描述了基于Nikolaev的动态谐振细胞（DHC）的六极检测方案在14.5 T下的应用，实现了高场ICR-FTMS成像，能够高特异性地获取分子图像，适用于解剖组织（小鼠大脑）和完整模型生物（斑马鱼）的测量。

**实验方法**
**材料**：化学试剂（UPLC用水、HPLC甲醇和2,5-二羟基苯甲酸）购自Sigma Aldrich（圣路易斯，MO）。
**样品制备**：小鼠大脑（Mus musculus，Jackson Laboratories）和完整成年斑马鱼（Danio rerio，由Greenwood遗传中心提供）在CM1950冷冻切片机（Leica Biosystems，Nussloch，DE）上以-20 °C和14 μm厚度进行冷冻切片。切片解冻后粘贴在ITO涂层载玻片（CG-90IN-S110；Delta Technologies，Loveland）上。

**结果与讨论**
这些测量的核心技术尚未在文献中详细报道，主要见于会议论文和LC-MS分析应用，但未包含仪器细节。本文提供简要概述，期待未来详细的手稿详细描述设计及性能分析。图1展示了沿磁场轴的切片视图。

**结论**
本文首次展示了高场ICR-FTMS与六极图像电流检测结合用于MS成像的应用，适用于神经生物学和毒理学研究中的常见动物模型。这种仪器配置能够标注常规TOF和Orbitrap FTMS能检测到的质量分裂同位素，并接近这些质量干扰所需的质量分辨率。

**作者贡献声明**
唐纳德·F·史密斯：撰写——审阅与编辑、方法学、数据分析、概念化。
弗兰克林·E·利奇三世：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、项目管理、方法学、研究设计、资金获取、数据分析、概念化。

**作者声明**
作者声明没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

**致谢**
部分工作在国家高磁场实验室ICR用户设施完成，该设施得到美国国家科学基金会化学部门（DMR-1644779）和佛罗里达州政府的支持。F.E.L.三世感谢NHMFL ICR用户设施的支持，并感谢与ICR团队的合作机会，特别感谢Chad Weisbrod博士的帮助。