《Chemical Reviews》：Methods to Study the Molecular Mechanism and Drive the Design of Protein Degraders
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小分子降解剂通过劫持泛素-蛋白酶体系统来消除致病蛋白。为了实现细胞活性，蛋白降解剂必须执行一系列连续的步骤，包括细胞渗透、与目标蛋白的二元结合以及与目标蛋白和泛素 E3 连接酶形成三元复合物，随后进行蛋白泛素化，最终导致蛋白降解。监测降解剂作用机制的每个步骤对于确认其真正的细胞活性以及指导合理设计和优化至关重要。在这篇综述中，我们概述了降解剂的工作原理，并概述了研究该机制每个步骤的关键参数和相关方法。我们比较和对比了生物物理和细胞体外测定方法，并提供了一个简洁的框架来优先考虑和将这些方法映射到决策阶段。我们还讨论了影响降解剂细胞性能的主要因素以及指导药物设计的原理。
1. 引言
靶向蛋白降解（TPD）已成为降解与疾病相关蛋白的强大治疗策略。在 TPD 中，小分子用于利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性，例如诱导新底物蛋白的泛素化及其随后的降解。这通常是通过小分子与 E3 连接酶结合，然后招募目标蛋白到 E3 来实现的。这些分子也被称为蛋白降解剂，它们通常是双价的，如蛋白酶解靶向嵌合体（PROTACs）可以分别先与 E3 和目标蛋白结合，然后再作为三元复合物结合（图 1 A）；或者它们倾向于与 E3 或目标蛋白中的一个结合，如所谓的一价“分子胶水”（图 1 B）。此外，最近还探索了具有不同结构和结合特性的降解剂，这些降解剂不通过这两种典型类别发挥作用（图 1 C）。
图 1
图 1. 广泛研究且机制多样的小分子降解剂示例。A. PROTACs：MZ1 和 dBET6，突出显示了目标蛋白结合部分（紫色）、连接区域（蓝色）和 E3 连接酶结合部分（绿色）；B. 一价分子胶水：pomalidomide 和 indisulam；C. 通过非典型机制招募目标蛋白和 E3 连接酶形成三元复合物的降解剂，模糊了 PROTACs 和分子胶水之间的传统界限：分子内双价胶水和模板辅助的共价修饰剂。
直到最近，大多数小分子药物旨在占据蛋白结合位点并通过作为抑制剂、受体拮抗剂或蛋白-蛋白相互作用（PPi）干扰来阻止其功能。需要高水平的药物在细胞内持续存在才能达到并维持所需的药理反应。相比之下，小分子降解剂可以通过仅需要低于化学计量的药物水平相对于其蛋白靶标来提供催化效力。此外，降解剂不需要结合到蛋白的功能位点，因为它们可以结合到目标蛋白的任何位置来发挥其泛素化活性，这提供了处理所谓的“不可成药”靶标的机会。TPD 策略的另一个直接优势是，其作用的下游结果是目标蛋白的实际耗尽，这在表型和机制上更接近于基因敲除或敲低的效果。降解整个蛋白也与阻断单个结合位点有很大不同，并且还可以影响支架功能。由于这些相对于基于占据机制的策略的诱人优势，TPD 已成为一个快速发展的研究领域。自 2001 年首次提出（1），并在 2015 年在细胞和体内实现了突破性发展和验证（5,7–9）以来，已经开发了多种 PROTAC 降解剂，它们通过招募一系列 E3 连接酶来发挥作用（3,10–14），目前主要是 Cullin 2 RING von Hippel-Lindau (CRL2VHL)（15–17）和 Cullin 4 RING cereblon (CRL4CRBN）（18–20），并针对多种致病蛋白，包括但不限于蛋白激酶（21）、核受体（22）、表观遗传调节因子（23）、细胞表面受体（24）、转录因子（25）、抗凋亡蛋白（26）、导致神经退行性疾病的蛋白（27）以及与病毒相关的蛋白（28）。两种 PROTAC 分子 ARV-110 和 ARV-471 在 2019–2021 年进入前列腺癌和乳腺癌临床试验，标志着该领域的一个里程碑（29）。截至 2025 年，目前有超过 50 种降解剂候选药物正在进行针对各种疾病的临床试验，包括 PROTACs 和分子胶水（30,31）。为了指导未来临床中降解剂药物的设计，该领域开发并应用了多种多样且稳健的测定方法，以了解降解剂作用的各个步骤。
在这篇综述中，我们全面概述了用于通过泛素蛋白酶体系统进行靶向蛋白降解的小分子降解剂的关键参数和当前技术，从 TPD 领域的兴起到现在。虽然这些技术中的许多已在之前的综述中有所介绍（32,33），但 TPD 领域的快速指数增长需要对这些迄今已应用的方法进行最新的总结和评估。我们涵盖了与体外和细胞内小分子降解剂研究相关的方法学，以表征细胞渗透性和细胞内可用性、二元结合、三元复合物形成、泛素化和降解。这篇综述不会涉及体内或临床应用的深入讨论，也不会涉及蛋白质组学或计算方法，因为这些主题最近已在其他地方进行了讨论（34－36）。
2. 评估小分子降解剂效力的机制和参数
由于小分子降解剂将 E3 连接酶重定向到新底物蛋白上进行泛素化，因此它们遵循一个催化循环。首先，PROTAC 必须进入细胞，然后分别与 E3 连接酶或新底物蛋白结合，之后再同时结合这两种蛋白以形成关键的三元复合物，从而实现泛素化和降解（图 2）。在 26S 蛋白酶体降解后，降解剂分子可以从其蛋白复合物中释放出来并回收，自由地进入另一个催化循环。
图 2
图 2. 由 PROTAC（上图路径）或分子胶水（下图路径）降解剂介导的靶向蛋白降解的关键步骤示意图。显示了降解剂（黄色，由杂原子着色）、底物（紫色）、E3 连接酶（蓝色和绿色阴影）、E2（红色）、泛素（黄色）和 26S 蛋白酶体（多色）。
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PROTAC 通常比分子胶水更大，许多超过 1000 Da，这给优化其药代动力学特性同时保持出色的体内活性带来了挑战。特别是被称为“超出规则 5”（bRo5）的 PROTACs，可以通过许多描述符来设计和表征，这些描述符与降解剂的大小、亲脂性、电离性和变色性有关，所有这些因素都决定了分子在体内给药时的进入能力和适当分布（表 1）。
表 1. 支持有效降解剂细胞渗透性的化学设计的参数和值
| 参数 | 描述 | 对降解剂性能的影响 |
|------|------|--------|
| MW | 分子量 | <950 Da （参考文献 (38)）；<1000 Da （参考文献 (39)） |
| nC | 碳原子数 | |
| LogPC | 计算出的亲脂性分配系数 | 1–7 （参考文献 (38)）；<5 （参考文献 (54)） |
| LogDL | 离子化合物的亲脂性分布系数 | 0–6 （参考文献 (38) |
| BR | logP/BRD | |
| logD | 实验性的“生物学相关 logP/logD” | 2 至 5 （参考文献 (43) |
| LogST | 热力学溶解度 | >200 μM （48） |
| pKa | 酸碱离解常数 | |
| nAr | 芳香族基团数 | <5 （参考文献 (38) |
| CHI | 色谱疏水性指数 | |
| ElogP/E | logP/E | |
| LogD | 色谱 logD | 4.4–6.8 （参考文献 (55)）；≤7 （参考文献 (39) |
| HBD | 氢键供体数 | ≤2 （参考文献 (38) |
| HBAN | 氢键受体数 | |
| TPSA | 总极性表面积 | ≤200 ?2 （参考文献 (38) |
| EPSA | 实验极性表面积 | ≤170 ?2 （参考文献 (39) |
| Δlog kWI | AM | 固定化人工膜 (IAM) 色谱保留因子 | |
| HBDS | 溶剂暴露的 H-键供体数 | ≤2 （参考文献 (39) |
| H BAS | 溶剂暴露的 H-键受体数 | ≤16 （参考文献 (39) |
| Chamelogk | 变色性指标 | |
| CharVol | 特征体积 | |
| NRotB | 可旋转键数 | ≤14 （参考文献 (38)）；≤13 （参考文献 (39) |
| PHI | Kier 的柔韧性指数 | |
| Rgyr | 回旋半径 | |
表 1 中的参数说明了影响降解剂性能的因素。
化合物的大小（通过分子量 MW 和碳原子数 nC 描述）过大可能会阻碍其进入细胞。亲脂性参数，通常通过计算出的亲脂性分配系数（LogP）和离子化合物的亲脂性分布系数（LogD）来描述，被认为是细胞渗透性的主要因素。已经开发了几种描述符来量化这一点，例如色谱疏水性指数（CHI）、ElogP、ElogD 和实验性的“生物学相关 logP”（BRlogP）以及“生物学相关 logD”（BRlogD）。极性也是降解剂分子的另一个障碍，因为过高的极性会导致脱溶剂惩罚，从而阻止膜进入。虽然传统上使用氢键供体数（HBD）和氢键受体数（HBA）来表征化合物的极性，但最近提出了溶剂暴露的 H-键供体（eHBD）和受体（eHBA）的实验描述符。此外，最小化总极性表面积（TPSA）和实验极性表面积（EPSA）对于提高细胞渗透性也很关键。Δlog kWIAM 值已被证明是 bRo5 化合物的关键描述符，与固定化人工膜 (IAM) 色谱保留因子有关。溶解度也是降解剂效力的一个关键参数，受亲脂性和极性的控制。不仅这会影响细胞渗透性，低溶解度的降解剂还可能干扰或阻止可靠的实验结果。热力学溶解度（LogS）也是一个关键参数，其中“高溶解度”的降解剂分子被归类为 >200 μM。
鉴于 bRo5 化合物如 PROTACs 可以被电离，电离是影响降解剂细胞渗透性的关键属性。传统上使用酸碱离解常数（pKa）来描述电离；然而，在由于化合物溶解度低或其他实验挑战而无法确定 pKa 的情况下，可以使用在不同 pH 值下的色谱描述符 log k’80 PLRP-S 来估计电离特性。最近，还研究了 PROTAC 降解剂的形状、变色性和柔韧性，以及进一步影响膜渗透性的参数，如变色性指标（Chamelogk）、特征体积（CharVol）和可旋转键数（NRotB）。
由于 PROTACs 是具有“模块化”结构的异双功能分子，它们具有针对目标蛋白和 E3 连接酶的不同配体部分以及一个不同的连接区域（图 1 A，突出显示了结合部分（紫色）、连接区域（蓝色）和 E3 连接酶结合部分（绿色）。因此，它们可以同时或异步地与新底物和 E3 连接酶相互作用（图 2）。形成三元复合物的自由能变化 ΔGcomplex 可以用方程 (1) 描述（图 3）。从这个平衡处理中得出一个关键参数是协同性（α），由 PROTAC 的二元和三元解离常数之比 Kd 定义（方程 (2)）。当 α = 1 时，系统是非协同的，无论形成二元复合物还是三元复合物，对任一伙伴蛋白的结合亲和力保持不变。α < 1 表示负协同系统，系统的平衡倾向于二元结合。如果 α > 1，则系统被认为是正协同的，因为它有利于形成三元复合物而不是二元结合。正协同性结合高亲和力的三元复合物通常提供有利于三元复合物稳定性、增强泛素化和高效降解的有利情况（16,57?63）。
图 3
图 3. 描述 PROTAC 介导的三元复合物形成的平衡。A. 描述形成三元复合物自由能变化 ΔGcomplex 的方程 (1)；B. 描述 PROTAC 二元结合和三元复合物形成的三体平衡模型。
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PROTACs 和任何双功能分子都表现出所谓的“钩效应”。最初在西套印迹中观察到，在较高的 PROTAC 浓度下，蛋白的泛素化和降解水平降低（9,64）。“钩效应”描述了一种情况，即 PROTAC 的浓度相对于目标和 E3 太高；因此，由于与相应伙伴的二元结合的竞争，三元复合物的形成减少。钩效应容易发生在负协同和非协同PROTAC上，尤其是由高亲和力配体组成的PROTAC中，但对于正协同PROTAC来说，这种效应会减轻，并且只有在化合物浓度非常高时才会出现，而这在细胞和体内环境下往往是难以实现的。除了协同性之外，底物-PROTAC-E3复合物的稳定性也取决于其持久性和稳定性。热力学研究可以用来确定三元复合物的解离常数Kd（以及相应的结合常数Ka = 1/Kd），包括结合焓ΔH和熵ΔS，以及结合化学计量系数N，而动力学测量则可以提供关于结合速率kon、解离速率koff和复合物半衰期t1/2的额外信息。
分子胶降解剂使用与PROTAC相似的细胞降解机制和催化循环（图2）。它们通常具有较低的分子量，因此具有更优越的“药物样”特性，这使得它们更容易渗透细胞并可能提高口服生物利用度。一个关键的机制差异是，分子胶通常只在二元水平上与两种蛋白质中的一种相互作用：例如，典型的分子胶降解剂沙利度胺仅与E3连接酶CRBN结合，一旦形成这种二元复合物，它就可以诱导或稳定新底物的招募。因此，在分子胶存在的情况下，第二种蛋白质的招募必须比在没有分子胶的情况下具有更高的协同性（图4）。由于这些原因，“钩效应”不适用，在通过可逆非共价相互作用起作用的分子胶情况下尤其如此（例外情况见模板辅助或定向共价胶降解剂，这些降解剂在与各自的靶蛋白Brd4或Brd9二元结合后能够与E3连接酶DCAF16形成共价加合物）。
对于PROTAC、分子胶和其他非传统的非共价降解剂来说，更快的结合速率（kon）和更慢的解离速率（koff，对应于较低的总体Kd），以及更长的复合物半衰期t1/2与更高的泛素化水平和更有效的降解相关。（57-63）与三元复合物的形成不同，泛素化在TPD（蛋白酶体途径）的背景下研究较少，但它对于目标降解是一个关键步骤。虽然通常测量总泛素化速率，但泛素化可以分为两个过程：首先是较慢的限制步骤——单泛素化，随后是更快的多聚泛素链扩展。（67,68）最近引入了用于量化未修饰底物向泛素化底物转化的参数Ubmax（在给定时间点上未修饰底物向泛素化底物的最大转化率）和UbC50（转化为泛素化底物的半最大浓度）。（69）高Ubmax值（>90%）和低纳摩尔UbC50值表明目标底物在高效降解过程中被迅速泛素化。需要注意的是，仅泛素化可能不足以实现蛋白酶体降解。这是因为泛素链的类型必须有利于蛋白酶体的识别，以触发其降解活性。此外，某些泛素化位点可以诱导结构不稳定，从而使目标蛋白更快地被降解。（70,71）然而，到目前为止，对于绝大多数利用Cullin RING连接酶复合作为E3连接酶的降解剂来说，发现降解剂在靶蛋白上诱导的泛素化程度越高，观察到的蛋白质降解就越快、越显著。（72,73）至关重要的是，小分子降解剂需要对其进行详细的降解效率表征。常用的参数是半最大降解常数DC50和最大降解效率值Dmax，这些通常是通过对固定时间点的总蛋白质水平进行浓度依赖性测量获得的，例如使用Western blot或其他细胞蛋白质定量方法，因此无法捕捉蛋白质降解的时间依赖性（图5 A和B）。通过进一步评估降解速率、降解程度和降解的持久性或持续时间，可以获得更全面的降解机制了解。Riching等人通过描述额外参数来说明这一点（图5 C）。
对于PROTAC、分子胶和其他非传统的非共价降解剂，更快的结合速率和更慢的解离速率（对应于较低的总体Kd），以及更长的复合物半衰期与更高的泛素化和更有效的降解相关。（57-63）与三元复合物的形成不同，泛素化在TPD背景下的研究较少，但它对于目标降解是一个关键步骤。虽然通常测量总泛素化速率，但泛素化可以分为两个过程：首先是较慢的限制步骤——单泛素化，随后是更快的多聚泛素链扩展。（67,68）最近引入的参数用于量化未修饰底物向泛素化底物的转化，包括Ubmax（在给定时间点上未修饰底物向泛素化底物的最大转化率）和UbC50（转化为泛素化底物的半最大浓度）。（69）高Ubmax值（>90%）和低纳摩尔UbC50值表明目标底物在高周转率下被迅速泛素化，从而推动高效降解。需要注意的是，仅靠泛素化可能不足以实现蛋白酶体降解。这是因为泛素链的类型必须有利于蛋白酶体的识别，以触发其降解活性。此外，某些泛素化位点可以诱导结构不稳定，从而使目标蛋白更快地被降解。（70,71）然而，到目前为止，对于绝大多数利用Cullin RING连接酶复合作为E3连接酶的降解剂来说，发现降解剂在靶蛋白上诱导的泛素化程度越高，观察到的蛋白质降解就越快、越显著。（72,73）
细胞渗透性和细胞内可用性对于小分子降解剂在体内的性能至关重要，因为物理化学性质并不总是能够准确预测“超越五法则”化合物的吸收、分布、代谢和消除（ADME）特征。尽管有多种分析和基于生物标志物的协议用于评估体内蛋白质降解剂的分布、代谢和消除（本文不涉及这些协议的综述，但这里引用了一些例子（77-81）），但我们在这里概述了测量它们的细胞渗透性和估计细胞内可用性的方法，作为在细胞模型中建立生物活性的重要第一步（表2）。
表2. 用于预测或测量降解剂细胞渗透性的选定技术概述
方法
信息
样品制备
通量
IAM层析
脂溶性、极性、电离性
N/
介质
Caco-2/MDCK
总渗透性、流出
活细胞单层；需要血清/BSA
低
PAMPAP
被动扩散
脂质渗透滤板
高
CAPA
细胞内可用性
氯烷标记的降解剂；HaloTag细胞
EPSA（SFC）
在非极性环境中的极性表面积
N/A
高
NMR
分子内氢键、变色性
N/
低
降解剂的物理化学性质通常作为预测细胞渗透性的重要初步筛选方法。这些参数可以通过简单分析化合物的化学结构（如分子量、碳原子数、可旋转键数、氢键供体和受体数等）、计算或实验获得。化合物的脂溶性传统上是通过在两相系统中溶解来确定的——通常是正辛醇和水——两种相被摇晃直到达到热力学平衡，然后量化每相中的化合物浓度。基于这一基本方法，但改进了低通量的“摇瓶”设置，近年来开发了更现代的层析方法来提高通量、材料消耗和灵敏度。特别是固定化人工膜（IAM）层析作为一种预测药物渗透性的方法越来越受欢迎，它根据测量的层析保留时间提供关于极性ΔlogkWIAM的结果。（46,47）文献中证明的两个强预测降解剂分子渗透性的参数是BRLogD脂溶性和ΔlogkWIAM极性方法；利用高效液相色谱（HPLC），这些技术的样品消耗需求非常低。（46,48）其他基于层析的LogD测量工作流程也针对降解剂进行了优化，例如ChromLogD，已被证明适用于高脂溶性化合物。（82）电离度（pKa）通常通过实验测量；然而，最近开发了一种基于深度神经网络（DNN）的多任务分类器来预测pKa。（83）这种方法被用于分析pan-KRAS降解剂ACBI3的电离性，（73）发现可质子化的胺不利于细胞渗透。（83）层析log k’80 PLRP-S方法提供了另一种传统的pKa测定方法，并已被证明可以准确预测中性分子和单阴离子形成分子内氢键的倾向。（50）Jimenez等人证明了通过检查PROTAC的组成成分可以预测它们的热力学溶解性，特别是当它们具有相同的末端官能团时。例如，(+)-JQ1羧酸相对于I-BET726羧酸的溶解度增加，推动了MZ1相对于MZP-54的溶解度提高。（48,339）这些发现表明，战略性选择高溶解度的前体是设计更易溶性PROTAC分子的一个可行指南。
3.1. 直接测量细胞渗透性
多种细胞技术允许直接测量估计的生物渗透性和流出比率。药物的细胞渗透性通常通过基于细胞单层的渗透性测定（如Caco-2）来确定表观渗透性Papp值。（84）该测定已成功应用于PROTAC（85-89）和分子胶；（90,91）然而，对于PROTAC和其他高脂溶性化合物需要特别小心。考虑到PROTAC在测定缓冲液中的溶解度挑战和非特异性结合到孔中的问题，已有报道指出回收率较低。（92,93）通过添加血清等改良测定方法已被证明可以减少非特异性结合。（89）尽管如此，一些研究仍报告了不准确的读数或较大的误差范围，突显了Caco-2协议在研究PROTAC渗透性方面的局限性。（92,93）另一方面，Caco-2测定已被有效用于预测细胞流出，并在进一步的体内研究之前筛选出具有高流出倾向的化合物（详见下文及参考文献）。（49,73,86,89）其他用于测量被动渗透性的模型系统包括Madin-Darby犬肾（MDCK）和MDCK-clone Ralph-Russ犬肾（RRCK）模型。由于其典型的药物转运蛋白表达水平较低，这些模型的使用不如Caco-2普遍。（94）Klein等人进行了MDCK渗透性测定；然而，由于某些化合物的脂溶性过高，它们的浓度低于检测限。（95）据我们所知，RRCK尚未用于小分子降解剂。
在小型分子降解剂的背景下，特别是对于可能高度脂溶性的PROTAC，这些传统的直接测量细胞渗透性的方法可能需要调整实验方法才能提供明确的见解。
3.2. 基于荧光的方法监测细胞摄取
其他细胞方法包括添加荧光标记物来监测细胞摄取。在氯烷渗透测定（CAPA）中，（96）小分子降解剂被氯烷标记。（97）Foley等人将这种方法应用于BET溴结构域降解剂MZ1，（97）其中GFP标记的卤代烷脱卤酶与细胞内的氯烷标记MZ1形成共价键，从而可以通过荧光进行定量。（97）此外，这种方法还可以用于其他细胞定位，并可以定量测量核内渗透。（96）CAPA还可以用于通过表达带有定位信号的卤代烷脱卤酶标记（HaloTag）的目标蛋白来测定PROTAC的亚细胞效应。（80）存在一些限制，因为化合物必须用氯烷尾进行修饰；因此，测量是在修饰过的形式上进行的，而不是真正的无标记化合物。然而，添加氯烷标记并未观察到活性显著下降。（97）此外，由于这种反应与HaloTag发生共价反应，该方法可能无法完全反映细胞流出情况，（97）并且可能会由于化合物积累而过高估计细胞渗透性。（98）细胞内积累可以通过细胞裂解物的质谱进行量化，但需要注意的是，一些鉴定出的分子可能非特异性地定位在细胞表面而不是细胞内部。（99）体外模型也是一个有吸引力的方法，因为它们易于使用。例如，并行人工膜通透性测定（PAMPA）是一种无细胞的磷脂双层方法，用于测量膜通透性。（100）这种简化的模型避免使用细胞，从而降低了成本，提高了通量，同时也去除了基于细胞的模型中存在的复杂因素，如主动运输或外排机制。（101）研究表明，PAMPA具有良好的灵敏度，能够测量预期低通透性的PROTACs，并且与脂质膜上的“被动扩散”估计值很好地相关。（54）然而，其检测限被认为不足以量化那些特别不透且在该测定中回收率低的PROTACs。（86,99）为了提供进一步的见解，与PAMPA结合使用的一个指标是脂溶性通透性效率（LPE）。（54,95）LPE是通过实验测得的膜通透性LogD与计算得出的辛醇/水分配系数之差来计算的，它衡量了小分子相对于其水溶性实现膜通透性的程度。（102）对于像PROTACs这样较大且更灵活的分子，结合PAMPA和LPE特别有效，因为它们比经典小分子更容易发生分子内氢键作用和变色龙行为。例如，Klein等人利用基于VH032的PROTACs及其酰胺到酯的类似物，展示了将LPE与PAMPA结合并比较LogP可以揭示降解剂分子的结构排列如何影响化合物的通透性。（54,95）同时调整PAMPA和LPE的值可以指导药物化学方法，优先考虑某些骨架并优化后续步骤（二元结合、三元复合物形成、泛素化）。这还可以提示是否需要进行结构修改（如掩盖HBDs），或者化合物是否可能存在代谢稳定性差的问题。
3.3. 结构集合作为细胞通透性的预测指标
除了计算的物理化学性质和通透性读数外，许多研究还关注了降解剂的形状、灵活性和变色龙特性。这一点尤其重要，因为总体溶剂暴露的3D极性表面积已被证明与“超出五规则”化合物的实验确定的通透性相关。（103）变色龙特性最初是通过实验测量的，重点是VHL招募的降解剂分子，Atilaw和Ermondi使用2D核奥弗豪泽效应光谱（NOESY）NMR来识别质子-质子对，并确定细胞可渗透PROTACs的结构集合。这些研究使作者能够识别分子内和非经典的氢键、p-堆叠相互作用以及酰胺基团从溶剂中的屏蔽作用，揭示了在模拟细胞内外环境中的延长和极性分子群体。（104,105）进一步的对VHL和CRBN招募的降解剂的NMR研究表明，PROTAC连接子的灵活性、组成和折叠的差异如何控制细胞通透性。（106?110）虽然与其他本节描述的技术相比，NMR在材料需求量方面要求最高，但其明显的好处是可以从NMR管中回收材料并重新组成以进行进一步的实验或分析。变色龙行为也可以通过反相色谱法定性地估计，该方法使用不同极性范围的流动相，基于分子变色龙在非极性环境中通过减少极性表面积来调整其构象的假设。（87）最近，开发了一种超临界流体色谱（SFC）（45）技术来测量降解剂分子的EPSA，重点是高通量筛选以对PROTACs的细胞通透性进行排序。（111）进一步的研究表明，可以从分子动力学模拟中估计变色龙行为。（106,112）总体而言，分子变色龙特性是一个新兴但高度相关的分子特征，特别是在PROTACs中应该予以考虑。
3.4. 评估小分子降解剂细胞外排和摄取的方法
近年来，细胞外排泵ABCC1/MRP1和ABCB1/MDR1已被证明在很大程度上作用于PROTACs。（113,114）事实上，Kofink等人通过监测外排比率发现，改善PROTAC连接子设计，使其采用更紧凑的3D构象，可以降低外排比率，从而显著提高总体口服生物利用度。（89）此外，一些PROTACs已被证明在细胞内被代谢，从而增强了清除和外排。（79,114）Chen等人的研究表明，在靶向BTK的PROTAC中硬化连接子区域可以提高代谢稳定性，进而提高细胞生长抑制效果，优于PEGyl连接子类似物。（114）这些例子强调了监测代谢和外排作为降解剂细胞内可用性和生物利用度的重要屏障的必要性。外排敏感性也可以在下游阶段进行测量，例如，通过zosuquidar对ABCB1/MDR1的抑制或reversan对ABCC1的抑制对DC50的依赖性，这在多项关于降解剂分子的研究中已经得到应用。（73,109,114,115）此外，一些代谢物可能对底物或E3连接酶具有类似的结合亲和力，可能会与完整的降解剂分子竞争并阻碍降解剂的机制，同时可能带来进一步的挑战，例如代谢物羟基-沙利度胺，它仍然可以与CRBN结合并本身起到分子粘合剂的作用。（79,92,116,117）近年来，在开发预测药物代谢物的计算工具方面取得了显著进展，包括应用深度学习策略。（118?121）计算预测在项目早期阶段可能会有所帮助，并应与使用互补实验方法的药物代谢和细胞外排研究相结合。除了外排转运蛋白外，CD36最近也被认定为PROTACs进入细胞的摄取转运蛋白。（122）作者通过化学拉下和全局蛋白质组学鉴定了CD36。虽然作者进行了CD36敲除实验以验证PROTAC的摄取依赖性，但新的CD36抑制剂可以帮助快速检查CD36依赖性，而无需使用敲除细胞系。（123）鉴于这些最新发现，未来的PROTAC设计策略可能包括优化与CD36的结合以增强细胞摄取，正如Wang等人所展示的那样（122），同时最小化与外排转运蛋白的结合。识别这些转运蛋白的参与可以为在组织活性、口服生物利用度或血脑屏障穿透方面存在挑战的PROTAC目标提供有价值的见解。这些挑战可能在不同类型细胞和组织中这些转运蛋白的表达水平和活性上有所不同。
4. 小分子降解剂介导的二元结合和三元复合物形成
4.1. 评估降解剂诱导的三元复合物大小和寡聚化的生化方法
TPD作用机制中的关键步骤是E3连接酶、降解剂和靶蛋白之间的三元复合物的形成。几种无标记的生化技术可以确定是否形成了三元复合物，并评估单聚体和多聚体蛋白集合，例如尺寸排阻色谱（SEC）、电泳迁移率变化测定（EMSA）、质量光度法和天然质谱（图6）。这些方法可以提供与异质或同质寡聚化状态增加一致的分子量变化信息。
图6
图6. 监测降解剂诱导的三元复合物结合的生化方法概述。A SEC色谱图示意图显示三元复合物形成时洗脱体积的变化。B 染色天然凝胶示意图显示三元复合物形成时分子量向上移动。C 高斯拟合质量光度图示意图显示三元复合物形成时分子大小向右移动。D 天然质谱示意图显示三元复合物形成时质荷比（m/z）向右移动。E 天然质谱示意图显示三元复合物形成时质荷比（m/z）向右移动，以及蛋白质寡聚化时质荷比（m/z）也向右移动。
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SEC分析显示，注入复合物的洗脱体积随着三元复合物的形成而增加（图6 A中的效果）。这种方法已应用于多个系统，例如研究homoPROTAC诱导的VHL-EloC-EloB复合物（VCB）（124）、heteroPROTAC依赖的VCB/BET溴结构域复合物的形成（125）以及DCAF16/Brd4与IBG1和IBG3的串联复合物（3）。在快速蛋白质液相色谱（FPLC）纯化系统上进行的SEC分析还有额外的优势，可以纯化出用于后续结构分析的三元复合物，例如X射线晶体学和冷冻电镜（3,126）。通过积分曲线下的面积可以量化存在的物种比例，并且可以通过读取与已知分子量的标准曲线相关的洗脱体积来确定近似分子量。然而，分辨率可能受SEC柱的质量、流速和注入物种浓度的影响。此外，不同形状的蛋白质和复合物，尤其是那些显著偏离球形结构的蛋白质，其保留方式不同，因此仅通过这种方法很难准确预测分子量。该测定的通量很大程度上取决于所使用的SEC柱类型，较小的分析规模柱可以在7分钟内处理一个样本。如果需要更准确的质谱读数，SEC还可以与多角度光散射（MALS）结合使用，后者测量SEC柱洗脱时散射光的强度（这种组合方法通常称为SEC-MALS）。EMSA技术是另一种简单的方法，可以观察三元复合物形成时的质量变化（图6 B中的效果），其优点是成本较低，只需要凝胶电泳设备和试剂。Diehl等人开发了一种天然凝胶电泳方法，用于评估homoPROTACs在非变性条件下使重组VHL蛋白二聚化的能力，并显示出检测到的三元复合物形成百分比与Western blot观察到的pVHL30降解水平之间的相关性。（124）通过积分曲线下的面积可以量化存在的物种比例；然而，像SEC一样，这种技术的分辨率和灵敏度有限。这种测定的通量通常较低，需要制备非变性凝胶，并且蛋白质样本可能需要1-2小时才能获得所需的分辨率。优点是可以在同一凝胶上同时解析多个样本。
对于质量光度法，测量的蛋白质浓度必须很低（在100 pM-100 nM范围内），以便检测吸附在玻璃片上的单个蛋白质颗粒。Schwalm等人的研究表明，在高浓度10 μM的降解剂MS67和AD122存在下，25 nM VCB和25 nM WDR5之间的三元复合物形成率为98-99%（图6 C中的效果）。（62）同样，Crowe等人显示NEDD8-CRL2VHL、MZ1和BRD4BD2在1:1.2:1.2摩尔当量比下形成了完全的三元复合物。质量光度法也有助于研究降解剂依赖的蛋白质寡聚化。Huang等人显示，在没有降解剂的情况下，20 nM蛋白质浓度下存在DCAF15-DDB1-DDA1二聚体和三聚体，在20 nM蛋白质和200 nM分子粘合剂E7820存在下连接物向单体和二聚体转变。（127）这种方法可以很好地了解样品分散情况以及存在的物种，且样品消耗量很小，读数可以在短短1分钟内获得。然而，目前的质量光度检测技术仅适用于40 kDa以上的蛋白质物种。在非常低的蛋白质浓度下，有时需要大量过量添加小分子才能使三元复合物变得可分析。（128）一种有助于识别三元复合物的解决方法是先在微摩尔浓度下预孵育蛋白质和小分子物种，然后立即稀释到纳摩尔浓度再进行测量。
天然质谱（nMS）允许检测处于天然状态的完整蛋白质，保留它们的折叠和相互作用，因此可以用来研究蛋白质与小分子和其他蛋白质形成的复合物。贝弗里奇等人（129）应用了nMS方法来检测由VCB、BET溴结构域Brd4BD1、Brd4BD2和Brd3BD2以及PROTACs MZ1（5）和AT1组成的系统中的PROTAC结合物种。（16）他们证实，nMS显示与Brd4BD2形成的三元复合体比例高于Brd4BD1和Brd3BD2，并且与AT1结合的选择性更好（129），这与先前发表的SPR（59）和ITC（16）数据完全一致。此后，这种方法已被应用于其他PROTAC和分子粘合系统，包括VCB/BET溴结构域（130,131,340）、14–3–3/ERα/p53/LRRK2蛋白（132）、14–3–3/Pin1蛋白（133）、CRBN/GSPT1蛋白（134）、VHL/ACBI3/KRAS（340），以及用于识别带有或不带有RBM39和/或E7820的DCAF15-DDA1-DDB1的寡聚化（127,134）。三元复合体形成和蛋白质寡聚化的质量电荷比变化见图6 D和E。根据仪器的灵敏度不同，nMS非常适合高亲和力pM到低μM范围内的解离常数。总体而言，这些生化技术对于可视化存在的物种组合非常有价值。特别是，SEC、EMSA和MP在分辨率上有限，不太可能捕获更短暂的相互作用。nMS可以实现更高的质量分辨率和灵敏度。在这里，可以检测到更高μM到mM范围内的相互作用；然而，可能需要对仪器灵敏度、温和的电离条件、更高的蛋白质浓度和稳定的缓冲条件进行优化。
4.2. 用于体外评估降解剂二元和三元复合物的生物物理学方法
不同通量的生物物理学测定方法被有效地用于生成评估二元和三元复合体形成平衡所需的定量数据。这些信息对于降解剂的开发至关重要。具体来说，强效且快速的降解剂在低浓度下形成具有高热力学稳定性和长动力学寿命的三元复合体（16,57?63）。因此，评估和优化这一作用模式对于降解剂的优化至关重要。用于评估降解剂复合体的生物物理学方法可以分为基于接近性的、基于竞争性的（图7）或直接结合的方法，并在表1中进行了总结。
图7
图7. 基于接近性和基于竞争性的降解剂诱导的三元复合体结合的典型曲线形状。A. 基于接近性的测定产生钟形曲线，其幅度随着三元复合体协同性的增加而增加，随着协同性的减少而减少。B. 基于竞争性的测定产生S形曲线，其曲线随着三元复合体协同性的增加而左移，随着协同性的减少而右移。
4.2.1. 基于接近性的测定
放大的发光接近性均相免疫吸附测定（AlphaLISA）（135）和时间分辨F?rster共振能量转移（TR-FRET）是基于接近性的方法，它们采用类似的机制来检测三元复合体（图8）。在这些方法中，E3连接酶和目标蛋白都标记有供体和受体物种。当降解剂引起接近时，在供体物种的波长下激发光会导致能量从供体转移到受体物种，从而产生发射信号。对于AlphaLISA，能量转移来自一个“供体”珠子，激发后会生成扩散半径为200纳米的短寿命单线态氧物种（136）。在三元复合体形成时，“受体”荧光团被单线态氧激发，在受体物种的波长下产生读数（图8 A）。相比之下，在TR-FRET中，能量 transfer 从供体荧光FRET对染料传递到其受体FRET对染料（图8 B）。如果受体物种位于F?rster半径内（对于大多数FRET荧光对而言为2–9纳米），它会产生一个与供体不同的发射波长（137）。这些发射信号的增加可以检测并解释为三元复合体形成的增加。Gadd等人首次使用降解剂建立了AlphaLISA接近性测定法来筛选MZ1衍生的PROTAC与VCB和BET溴结构域的结合，作者观察到随着三元复合体协同性的增加，信号幅度也随之增加（这种效应在图7 A中有所示）。（16）尽管该测定法具有优势，但作者还指出，由于固定到供体和受体珠子上的结合位点的多重性和相对连接方向，应谨慎解释AlphaLISA数据（16）。此后，该测定法被扩展到其他E3（11,138）、其他目标蛋白（57,139?143）以及E3连接酶与homoPROTAC的二聚化（144），并已扩展到细胞裂解物系统中研究小分子降解剂（142）。
图8
图8. AlphaLISA和TR-FRET用于基于接近性的三元复合体测量。A. 在AlphaLISA实验中，激发供体珠子会产生单线态氧物种。当形成三元复合体时，供体和受体珠子之间的接近使得受体被单线态氧激发，并在受体染料的波长下产生发射。B. 在TR-FRET实验中，激发供体染料会导致在某个波长下产生发射。当形成三元复合体时，供体和受体染子之间的接近使得能量 transfer 并在受体染料的波长下产生发射。
TR-FRET要求供体和受体物种之间的距离较短，已应用于类似的E3/目标蛋白系统。最近的例子包括一种DCAF1-Brd9 PROTAC（10）、内源性二价粘合剂（IBG1）招募Brd4tandem（3）、通过CDK12/DDB1界面降解cyclin K的分子粘合剂（145）、通过分子粘合剂降解剂招募到CRBN的新底物蛋白（146）以及基于VHL的CRBN降解剂用于CDO1（147）。普日图尔斯基（Przytulski）等人的一项研究旨在比较AlphaLISA和TR-FRET在降解剂三元复合体分析中的效果，结果显示尽管测定原理不同，但在所研究的测试系统中两种测定法均产生了相似的三元复合体响应（148）。虽然这些测定法适用于多种系统，且具有良好的通量和低样品消耗量，但由于PROTAC特有的“钩效应”，拟合和提取结合亲和力可能具有挑战性。尽管需要对两种感兴趣的蛋白质进行功能化，但通过在平板格式中执行这些测定法仍可实现良好的通量，并且蛋白质浓度较低（在纳摩尔范围内），使得AlphaLISA和TR-FRET成为筛选降解剂库中三元复合体形成的高度敏感的方法。
4.2.2. 基于竞争性的测定
另一类用于评估降解剂二元相互作用和降解剂诱导的三元复合体形成的实验方法是基于竞争性的测定。在这种情况下，通常由带有报告物种修饰的已知二元配体组成的探针在与其伴侣蛋白结合时产生基线信号，而在复合体形成时会被置换（图7 B）。
AlphaLISA（图9 A）和TR-FRET（图9 B）都可以用于竞争性设置来评估二元结合；例如，Guenette和Potts开发了一种高通量AlphaLISA测定法，通过滴定未标记的降解肽来置换与E3连接酶结合的生物素化肽（149）。这些方法也可以通过探针置换来测量三元复合体的形成；例如，Imaide和Hsia的AlphaLISA测定法分别使用生物素化的JQ1探针在化合物滴定下置换（SIM1和IBG1），以表征在降解剂存在下Brd4tandem和VCB以及DCAF16之间的二元和三元复合体形成（3,150），并且使用CRBN结合探针量化了CRBN的结合（76）。同样，TR-FRET已被用于评估二元BET溴结构域结合（151）和STAT5降解剂的二元CRBN结合（152）。虽然竞争性AlphaLISA和TR-FRET都可以用于测量二元和三元结合，但这些测定设置需要一个已建立的标记“探针”配体，并且无法直接读取三元复合体的形成参数，这意味着必须通过比较在没有“蛋白质B”存在和有“蛋白质B”存在时的“蛋白质A”-降解剂结合来进行提取（这必须假设与蛋白质B的结合达到饱和）。
图9
图9. 基于竞争性的三元复合体测量。A. AlphaLISA，B. TR-FRET，C. FP。
同样，Lumit也被应用于基于竞争性的系统中。Crumming等人使用GST标记的BRD4和生物素化的BET示踪剂，以及LgBit-和SmBit结合的抗-GST Lumit试剂，能够检测到发光信号（153）。与AlphaLISA和TR-FRET一样，通过与BET示踪剂的竞争来揭示PROTAC的结合特性（153）。
竞争性荧光极化（FP）也可以用于评估二元和三元结合（154），并且有利的是，不需要对E3或目标蛋白进行标记（图9 C）。相反，与E3或目标蛋白结合的小分子探针被荧光染料（通常是荧光素类或其他类似物）修饰。将蛋白质和探针在溶液中孵育会产生一个基线信号，该信号在探针被结合更强的化合物或化合物-蛋白质对置换时减弱。竞争性FP在开发能够竞争性结合VHL的底物HIF-1α肽的非肽类小分子方面发挥了关键作用：这些FP筛选活动促进了用于VHL招募的PROTAC的关键配体的发展（155,156）。同样的方法最近也被用于另一种E3连接酶FEM1C的配体开发（157）。竞争性FP也是评估降解剂三元复合体和协同性的最常用的基于竞争性的测定之一。竞争性测定不受钩效应的影响，允许进行完整的化合物滴定系列和结合量化。Zoppi等人的一项研究比较了PROTAC诱导的荧光HIF1-α肽的置换，发现他们的PROTAC在Brd9溴结构域存在下显示出负协同性，并且在IC50曲线中向右移动（141）。相比之下，正协同性的降解剂三元复合体相对于二元结合曲线或在非协同系统（如图7 B所示）向左移动，对于不同的溴结构域目标SMARCA2/4与VCB和PROTAC的合作也是如此（142），以及不同的BET溴结构域与MZ1的结合（59）。由于其灵敏度和通量，FP三元复合体竞争性测定已被广泛用于降解剂表征和降解剂筛选活动（158）。
所有四种基于竞争性的测定都使用非常低的浓度和少量的“蛋白质1”和探针（纳摩尔范围）。然而，对于三元复合体的测量，第三种结合伙伴“蛋白质2”通常浓度较高，范围在10–25 μM之间。尽管如此，这些测定设置适合于基于平板的筛选。虽然这些方法非常强大，但基于竞争性的测定有一个缺点，即需要开发和验证一个特征明确的荧光标记探针配体。
4.2.3. 基于生物传感器的直接结合方法
基于生物传感器的生物物理学方法在分子结合的表征方面比传统的基于溶液的方法更具信息量。将蛋白质物种固定在芯片表面可以增加蛋白质的局部浓度，从而实现实时和敏感的分子相互作用检测。由于这种增强的灵敏度，可以测量动力学速率常数kon和koff，并计算Kd和t1/2值。
表面等离子共振（SPR）的发展用于PROTAC招募的三元复合体表征，是TPD领域理解降解剂介导的三元复合体形成动态的一个里程碑。最初由Roy等人（59）应用，作者设计了一个VHL-EloB(AviTag)-EloC构建体进行EloB的生物素化。由此产生的生物素化VCB被固定在链霉亲和素涂层的SPR芯片上，首先测量了二元VCB-PROTAC相互作用的动力学。为了测量三元复合体的形成，BET溴结构域蛋白和PROTAC被预先孵育，然后流过SPR芯片上的VCB（图10 A）（59）。在这项首次研究之后，SPR现在常用于通过固定E3或目标蛋白来表征降解剂（10,11,159?163），并且也已扩展到筛选方法（164），包括筛选未纯化反应产物中的分离速率（165）。虽然最初主要应用于VHL招募的PROTAC，但随着最近开发出更小、更可溶的CRBN蛋白构建体（如CRBN-midi（161,166），SPR与CRBN的固定也已成功用于研究CRBN结合配体和三元复合体（167）。
图10
图10. 使用生物传感器方法进行降解剂三元复合体测量的固定设置。A. 在SPR和BLI中，通常固定一种蛋白质物种。B. 在heliX Y-结构测定中，通常固定两种蛋白质物种。
生物层干涉测量（BLI）也成功应用于研究降解剂。尽管大多数研究使用BLI来研究PROTACs和分子粘合剂在二元结合中的行为（148,168?172），但Schiemer等人开发了一种BLI方法来测量三元复合物的形成（173）。作者将生物素-cIAP固定在链霉亲和素涂层的BLI生物传感器尖端上，并将其浸入PROTAC溶液中。短暂清洗后，将这种二元cIAP-PROTAC生物传感器尖端浸入BTK溶液中，以获得三元复合物的结合常数kon、解离常数koff和亲和常数Kd。最近还开发了一种使用heliX生物传感器的方法，用于量化降解剂的二元和三元复合物。在他们的研究中，Ponzo等人（174）通过NHS酯耦合将E3连接酶蛋白（VHL-EloB-EloC或DDB1-CRBN）和BET溴结构域蛋白固定在其生物芯片表面上。通过测量固定在生物芯片上的蛋白附近的DNA链上的荧光染料的淬灭现象，来检测降解剂的二元结合和解离。对于三元复合物的测量，一个DNA“Y结构”被同时固定了E3连接酶和BET溴结构域蛋白（图10 B）。利用这种双重固定方法，通过监测供体染料到受体染料的FRET来测量降解剂介导的三元复合物的结合常数kon和解离常数koff（174）。
最近发表的一种基于生物传感器的方法是逃逸时间立体测量法（ETs），该方法可用于研究小分子降解剂的三元复合物形成。该方法由Zhu等人引入，它依赖于单个分子穿过生物芯片固定的熵陷阱，从而提供与分子流体动力学半径相关的平均逃逸时间（tesc）。由于这是一种单分子方法，样品消耗量低，且具有高灵敏度，因此能够捕捉到微弱的相互作用（175）。据我们所知，这项技术尚未应用于TPD领域。
鉴于计算降解剂诱导的三元复合物半衰期的相关性——因为寿命更长的三元复合物与蛋白质降解的速率和幅度增加有关——允许测量解离常数的生物传感器方法对于降解剂优化非常有用。虽然从这一点来看，生物芯片固定具有优势，但由于非特异性表面结合可能导致的复杂性，通常需要优化测量条件，以确保数据与预期的简单1:1结合模型相符。
4.2.4 其他直接结合方法
等温滴定量热法（ITC）是一种直接结合方法，在二元VHL结合配体的开发中起到了重要作用（156,341），后来也被用于评估VHL招募的PROTAC的二元结合，并被扩展到研究CRBN招募的配体和降解剂（5,176）。ITC是一种无标记的方法，通过测量配体与蛋白质溶液的滴定过程中的放热或吸热变化来评估二元结合。为了测量三元复合物的形成，Gadd等人开发了一种方法：首先将BET溴结构域滴定到PROTAC溶液中以测量二元结合，确保没有剩余的过量PROTAC；然后滴定VCB到饱和的蛋白质-PROTAC溶液中以测量三元复合物的形成（16）。尽管通量相对较低，ITC已成为TPD领域广泛使用的技术，因为它是唯一能够测量结合热力学和相对化学计量的方法。ITC在研究降解剂三元复合物方面的近期应用包括研究VHL同源PROTAC二聚化剂（144）、基于VHL的Brd9（141）和SMARCA2/4（142）PROTACs、招募CRBN的CDK12-cyclin K分子粘合剂（13），以及IBGs与串联BET溴结构域和DCAF16的结合（3）。
核磁共振（NMR）光谱技术可以用来观察小分子配体与蛋白质的结合，甚至测量复合物的解离常数。NMR已广泛用于研究小分子与E3连接酶的结合，例如在早期开发VHL配体的工作中（156,177,178），以及Fesik实验室的最新研究（180）。然而，很少有研究将这种方法应用于小分子降解剂及其三元复合物。De Castro等人引入了一种基于配体的NMR实验，用于估算一系列降解剂的协同参数α（181,182）。他们开发了一种19F标记的VHL E3连接酶配体（182,183），并在基于竞争的测定中使用了它。通过分别滴定PROTAC与VHL以及BET溴结构域复合物与VHL，作者能够从IC50曲线中估算出正协同性和负协同性（181）。Ramachandran等人进一步扩展了这种方法，通过使用特制的荧光“间谍”探针分子，测量肽类和小分子与含有E3连接酶SH2结构域的磷酸酪氨酸结合口袋的竞争性结合，获得了与正交SPR直接结合测量相当的结果（184）。
热变性测定（TDA），也称为热位移测定（TSA），通过两种方法监测蛋白质的热变性：荧光或聚集（185）。差示扫描荧光法（DSF）使用对环境敏感的荧光染料（如SYPRO Orange），这种染料会与蛋白质展开或变性时暴露的疏水区域结合，从而导致荧光信号增加（186,187）。在蛋白质的天然折叠状态下，这些疏水残基通常隐藏在蛋白质核心内，因此染料在水溶液中被淬灭。通常，配体结合会导致蛋白质的热稳定性增加，从而提高蛋白质的熔点（Tm）。DSF已应用于一些降解剂二元系统的研究（188?191）。DSF也适用于高通量筛选；例如，Lucas等人将这种方法应用于针对VCB的1200个片段的库（178）。NanoDSF（nDSF）是另一种可以提供蛋白质在配体结合时热稳定性信息的方法；然而，nDSF的读数来自蛋白质中色氨酸的内在荧光变化。nDSF已被用于降解剂的研究，以监测二元结合（125）。
动态光散射（DLS）是另一种无标记的TSA方法；通过施加温度梯度，可以观察蛋白质的展开和聚集，通过测量散射光的强度来进行监测。到目前为止，尚未有报道使用DLS进行降解剂的发现、开发或表征。虽然这些技术具有优势，但变性温度（Tm shift）并不总是可以直接转化为结合亲和力，而且用于排序配体亲和力的高变性温度不一定能反映蛋白质在生理温度下的表现（192）。
微尺度热泳（MST）可以检测在施加温度梯度时荧光标记蛋白质的空间分布变化。预计配体结合会由于配体本身或蛋白质在结合时的构象变化而引起荧光染料局部环境的变化。MST最初被用于研究PROTAC诱导的VHL和BET溴结构域之间的二元结合和三元复合物形成（193）。此后，该技术被扩展到其他二元（194?197）和三元系统，如VHL和BCL-XL三元复合物（198）以及VHL/EGFR三元复合物（199）。Maiwald等人将该技术扩展到使用荧光标记报告分子的同竞争性测定中，测量CRBN和VHL与二元结合配体的位移（197,200）。
其他较少使用的方法，但这些方法也有潜力研究小分子降解剂的二元和三元结合，包括光谱位移测定（SpS）（201），最近已经发表了一个案例研究（202），以及流诱导分散分析（FIDA），通过流式毛细管监测荧光标记蛋白质的流体动力学半径（Rh）（表3）。
表3. 用于测量降解剂二元和三元结合并影响降解剂分子化学设计的体外生化和生物物理技术概述
方法 结合类型 信息 标记/固定 蛋白质消耗 通量 可检测Kd范围
SECT 三元 无标记 5–100 μM, 5–500 μL 7–35 min/样品 pM-μM
Native gel 三元 无标记 1–10 μM, 5–10 μL 1–2 h/10–12 样本
200 μL 40 min/样品 120 μL 1–12 h/样品 120 μL 1–120 min/样品
4.3 用于识别细胞中降解剂二元和三元复合物的生物物理方法
鉴于细胞内环境的复杂性，体外测得的二元结合和三元复合物的形成可能无法完全反映降解剂在细胞内和体内的效果。细胞靶标的结合依赖于多种因素，包括化合物的细胞渗透性、输出/流出、隔离以及靶蛋白的区室化。此外，细胞内内源全长靶蛋白的结合情况可能与体外使用重组纯化蛋白构建体测得的情况不同。因此，细胞生物物理测定有助于补充体外测量结果。
riching等人提出了一种测量细胞系统中二元结合程度的方法，即nanoluc-vhl融合测定，该方法监测nanoluc-蛋白融合体与halotag标记的报告配体之间的纳米生物发光共振能量转移（nanobret）（58）。最初该测定用于监测mz1衍生的protacs与hek293细胞中的vhl的结合（图11），（58）现已扩展到多种系统，并被广泛使用（10,72,150,203?206）。通过同时对完整细胞和透化细胞进行这些二元结合测定，并比较结果，该测定可以间接评估降解剂的细胞渗透性（205）。这种方法也被扩展用于监测三元复合物的形成，其中标记的物种现在是靶蛋白和e3连接酶（58,63,140,150,207?208）。
图11. 表示在活细胞中测量protacs与nanoluc标记的vhl之间二元靶标结合的通用测定工作流程的示意图。荧光nanobret示踪物的化学结构是专有的，此处显示的化合物仅用于说明目的。
基于蛋白质互补性的进一步荧光方法也被设计用于研究细胞内相互作用；例如，lei等人最近应用了生物分子荧光互补（bifc）（209）来检测akt-protac-crbn三元复合物的形成（342）。在这里，akt和crbn都被标记了egfp或萤光素酶的片段，三元复合物的形成促进了两种蛋白片段的结合，产生荧光信号。
tsa也可以在细胞环境中应用，称为细胞tsa（cetsa）。winter等人首次将此方法用于监测dbet6和dbet1在crbn缺陷细胞中对brd4的细胞结合（6）。smith等人也进行了这项测定，研究了招募p38α的vhl招募protacs（143）。在这里，作者用protac处理细胞并施加温度梯度以变性并沉淀未结合的蛋白质；相比之下，结合的蛋白质保持可溶性，并可通过细胞裂解后的western blot进行定量，从而量化二元结合（143）。基于定量质谱的蛋白质组学可以与cetsa结合，以全面了解降解剂在细胞内的相互作用，从而评估靶标特异性（210）。
这些细胞结合测定的一项注意事项是，靶标结合的结果可能会受到降解剂化合物引起的蛋白质消耗的干扰。 4.3 用于识别细胞中降解剂二元和三元复合物的生物物理方法 鉴于细胞内环境的复杂性，体外测得的二元结合和三元复合物的形成可能无法完全反映降解剂在细胞内和体内的效果。细胞靶标的结合依赖于多种因素，包括化合物的细胞渗透性、输出 流出、隔离以及靶蛋白的区室化。此外，细胞内内源全长靶蛋白的结合情况可能与体外使用重组纯化蛋白构建体测得的情况不同。因此，细胞生物物理测定有助于补充体外测量结果。 riching等人提出了一种测量细胞系统中二元结合程度的方法，即nanoluc-vhl融合测定，该方法监测nanoluc-蛋白融合体与halotag标记的报告配体之间的纳米生物发光共振能量转移（nanobret）（58）。最初该测定用于监测mz1衍生的protacs与hek293细胞中的vhl的结合（图11），（58）现已扩展到多种系统，并被广泛使用（10,72,150,203?206）。通过同时对完整细胞和透化细胞进行这些二元结合测定，并比较结果，该测定可以间接评估降解剂的细胞渗透性（205）。这种方法也被扩展用于监测三元复合物的形成，其中标记的物种现在是靶蛋白和e3连接酶（58,63,140,150,207?208）。 图11. 表示在活细胞中测量protacs与nanoluc标记的vhl之间二元靶标结合的通用测定工作流程的示意图。荧光nanobret示踪物的化学结构是专有的，此处显示的化合物仅用于说明目的。 基于蛋白质互补性的进一步荧光方法也被设计用于研究细胞内相互作用；例如，lei等人最近应用了生物分子荧光互补（bifc）（209）来检测akt-protac-crbn三元复合物的形成（342）。在这里，akt和crbn都被标记了egfp或萤光素酶的片段，三元复合物的形成促进了两种蛋白片段的结合，产生荧光信号。 tsa也可以在细胞环境中应用，称为细胞tsa（cetsa）。winter等人首次将此方法用于监测dbet6和dbet1在crbn缺陷细胞中对brd4的细胞结合（6）。smith等人也进行了这项测定，研究了招募p38α的vhl招募protacs（143）。在这里，作者用protac处理细胞并施加温度梯度以变性并沉淀未结合的蛋白质；相比之下，结合的蛋白质保持可溶性，并可通过细胞裂解后的western blot进行定量，从而量化二元结合（143）。基于定量质谱的蛋白质组学可以与cetsa结合，以全面了解降解剂在细胞内的相互作用，从而评估靶标特异性（210）。>
4.3 用于识别细胞中降解剂二元和三元复合物的生物物理方法
鉴于细胞内环境的复杂性，体外测得的二元结合和三元复合物的形成可能无法完全反映降解剂在细胞内和体内的效果。细胞靶标的结合依赖于多种因素，包括化合物的细胞渗透性、输出/流出、隔离以及靶蛋白的区室化。此外，细胞内内源全长靶蛋白的结合情况可能与体外使用重组纯化蛋白构建体测得的情况不同。因此，细胞生物物理测定有助于补充体外测量结果。
riching等人提出了一种测量细胞系统中二元结合程度的方法，即nanoluc-vhl融合测定，该方法监测nanoluc-蛋白融合体与halotag标记的报告配体之间的纳米生物发光共振能量转移（nanobret）（58）。最初该测定用于监测mz1衍生的protacs与hek293细胞中的vhl的结合（图11），（58）现已扩展到多种系统，并被广泛使用（10,72,150,203?206）。通过同时对完整细胞和透化细胞进行这些二元结合测定，并比较结果，该测定可以间接评估降解剂的细胞渗透性（205）。这种方法也被扩展用于监测三元复合物的形成，其中标记的物种现在是靶蛋白和e3连接酶（58,63,140,150,207?208）。
图11. 表示在活细胞中测量protacs与nanoluc标记的vhl之间二元靶标结合的通用测定工作流程的示意图。荧光nanobret示踪物的化学结构是专有的，此处显示的化合物仅用于说明目的。
基于蛋白质互补性的进一步荧光方法也被设计用于研究细胞内相互作用；例如，lei等人最近应用了生物分子荧光互补（bifc）（209）来检测akt-protac-crbn三元复合物的形成（342）。在这里，akt和crbn都被标记了egfp或萤光素酶的片段，三元复合物的形成促进了两种蛋白片段的结合，产生荧光信号。
tsa也可以在细胞环境中应用，称为细胞tsa（cetsa）。winter等人首次将此方法用于监测dbet6和dbet1在crbn缺陷细胞中对brd4的细胞结合（6）。smith等人也进行了这项测定，研究了招募p38α的vhl招募protacs（143）。在这里，作者用protac处理细胞并施加温度梯度以变性并沉淀未结合的蛋白质；相比之下，结合的蛋白质保持可溶性，并可通过细胞裂解后的western blot进行定量，从而量化二元结合（143）。基于定量质谱的蛋白质组学可以与cetsa结合，以全面了解降解剂在细胞内的相互作用，从而评估靶标特异性（210）。
这些细胞结合测定的一项注意事项是，靶标结合的结果可能会受到降解剂化合物引起的蛋白质消耗的干扰。>因此，必须小心避免并控制参与与耗尽的过程，例如，进行短时间治疗并同时使用neddylation和蛋白酶体抑制剂如MLN-4924和MG132。(210) 使用荧光PPi（fluoPPi）方法结合活细胞共聚焦显微镜可视化技术，可以通过成像绿色光稳定mNeonGreen蛋白来监测细胞区域中的三元复合体形成。这种检测方法已应用于研究Brd4、FKPB12F36 V和CBP/EP300介导的CRBN三元复合体。(211,212) 基于相位分离的蛋白质相互作用报告器（SPPIER）与fluoPPi类似，但使用纳米荧光素酶（NanoLuc）作为荧光报告器。SPPIER适用于CRBN和VHL体系；然而，它的空间分辨率不如fluoPPi。(213) 一种被证明对确认三元复合体形成有效的方法是共免疫沉淀。在这种方法中，可以在细胞中过表达其中一个蛋白质结合伴侣，并使用高亲和力标签如FLAG、HA或链菌亲和素。化合物处理后进行沉淀，再通过Western blot来确定是否存在三元复合体。虽然这种方法适用于已知结合伴侣的细胞中的三元复合体验证，例如VHL/p38α (143,214)和DCAF16/FKBP12 (215)，但也可以扩展到其中一个结合伴侣未知的情况，并结合质谱分析来鉴定复合体的其他组成部分。(216?218)4.4. 评估降解剂二元和三元复合体结构的方法迄今为止，已经应用了多种结构生物学技术来研究降解剂的二元和三元结合，并在原子水平上表征它们的分子特征，总结见表4。表4. 用于研究降解剂二元和三元复合体的结构技术方法信息样品制备材料消耗X射线晶体学高分辨率信息结晶中等单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）对大于40 kDa的复合体分辨率变化大，样品异质性适用冷冻电镜网格和浸没冷冻或喷雾低蛋白质观察核磁共振（NMR）涉及结合的残基，复合体小于30 kDaE3或POI蛋白同位素标记高HDX-MSS溶剂暴露的残基与氘交换、淬火和消化低IM-MS复合体构象和组装中等SAXS复合体大小和形状中等到目前为止，X射线晶体学是获取降解剂二元结合和三元复合体形成结构信息的主要方法。该方法需要大量高纯度蛋白质，并且有一些缺点；例如，复合体可能无法结晶，或者晶体无法以足够的分辨率衍射，或者只能捕捉到溶液中存在的多种构象中的一种，有时会受到非天然晶体接触的影响。尽管有这些限制，X射线晶体学仍然是一种强大的技术，可能是获取蛋白质结合位点和结合模式高分辨率信息的最佳方法，同时还能揭示结合的小分子的生物活性构象，这可以用于进一步的基于结构的药物设计。事实上，Ciulli和同事们的一系列研究依赖共晶体结构来指导首个VHL小分子配体的设计。(17,155,156) 通过结构引导设计开发的这些VHL配体，促成了首个非肽类VHL招募PROTAC的创建。(5,9,219) Gadd等人的蛋白质X射线晶体学研究展示了首个报道的PROTAC三元复合体晶体结构，即VCB（VHL-ElonginC-ElonginB）作为E3激酶的底物-适配器组分，以及Brd4BD2作为目标蛋白。(16) 通过这个晶体结构，作者揭示了MZ1在VHL和Brd4BD2之间广泛的PPi介导的相互作用，并展示了PROTAC如何自身折叠以实现三元复合体中的特定分子间相互作用。Gadd等人使用生物物理学方法表征三元复合体，揭示了MZ1对Brd4BD2的特异性优于其他BET溴结构域，并解释了MZ1为何优先降解Brd4BD2，进而基于该结构合理设计了具有改进Brd4BD2特异性的新型PROTAC AT1。(220,221) 随着更多VHL-PROTAC三元结构的发表，这种方法也被扩展到CRBN。自从确定cereblon是沙利度胺招募的E3激酶后，(2) X射线晶体学被用来理解沙利度胺和来那度胺如何以二元结合复合体的形式招募CRBN。(18,19) 这些由Thom?和Cathers实验室领导的努力随后获得了CRBN与其分子接头及其新底物三元复合体的X射线晶体结构。(65,218,222,223) 切片cereblon构建的发展进一步获得了二元和三元X射线晶体学降解剂结构。(161,166) 虽然X射线晶体学对于提供高分辨率信息至关重要，但其固有的缺点是会丢失关于构象异质性的信息。因此，溶液中的技术可以进一步洞察降解剂-蛋白质系统的复杂性。单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）已被用于解析降解剂-蛋白质复合体。降解剂结构表征的cryo-EM最初在2019年通过DCAF15-DDB1复合体建立，(224,225) 然后Watson等人将其扩展到CRBN E3激酶底物受体的一系列二元分子接头-CRBN结构。(226) Lejava等人进一步使用cryo-EM表征了二元CRBN结合剂，(227) 并使用cryo-EM解析了降解剂介导的三元复合体，例如cereblon与Ikaros和SD40的复合体。(172) 冰冻电镜对三元复合体的研究提供了关于新的降解剂结合模式的关键见解；例如，DCAF16-IBG1-Brd4tandem复合体揭示了分子内双价接头的存在，并指导设计了具有更高活性的皮摩尔级降解剂，(3) 而DCAF16-Compound 1-SMARCA2之间的三元结构表明Compound 1通过共价键将SMARCA2招募到DCAF16，且与IBG1招募的方式在结构上有所不同。(228) 尽管冷冻电镜结构的分辨率相对较低且定位较为局限，无法很好地解析小分子，但最近的“分辨率革命”在冷冻电镜硬件和数据处理方面取得了显著进展，有望提高该技术的实用性，许多降解剂三元结构的整体分辨率已达到4 ?以下。(3,4,73,229?234) 到目前为止，大多数关于PROTAC三元复合体的结构研究都限于E3激酶底物受体，但cryo-EM也被用于可视化完全组装的多亚基催化活性E3激酶复合体NEDD8-CRL2VHL与MZ1和招募的非天然底物Brd4BD2的复合体。(69,235) 随着深度学习神经网络模型和算法（如3DFlex、(236) cryoDRGN、(237) 3D变性分析(3DVA)、(238) 和e2gmm等的开发，cryo-EM现在已成为探索异质性和灵活性的强大方法。例如，这些方法有助于映射cereblon的开放/关闭构象(226)并突出cereblon三元复合体的灵活性。(172) Crowe等人使用3DVA解析了完整的降解剂诱导的Brd4BD2-MZ1-NEDD8-CRL2VHL-UBE2R1-Ub复合体的连续灵活性，揭示了Cul2支架蛋白的运动范围，并提供了关于招募的新底物蛋白与E2催化位点之间可能界面的信息。(69)蛋白质观察核磁共振（Protein-observed NMR）是一种溶液中的技术，也能提供原子级别的结构分辨率；然而，这种方法尚未广泛应用于研究小分子降解剂介导的复合体。Schieimer等人使用蛋白质观察NMR研究了BTK和cIAP1之间的降解剂介导的三元复合体。作者使用1H/15N-HSQC鉴定了二元和三元复合体，并表明BTK和cIAP1之间没有稳定的PPi形成，从而证明了降解剂诱导的三元复合体是非协同的。(173) TPD中的蛋白质观察NMR研究受到限制，可能是由于30 kDa的大小限制，导致线性宽化和常规NMR实验中的光谱拥挤以及光谱分配的复杂性；然而，更现代的方法如TROSY和/或蛋白质氘代可能会提高分辨率极限。(240,241) 尽管蛋白质观察NMR的通量低且样本消耗大，且需要准确的光谱分配，但它具有研究降解剂介导的二元和三元复合体的潜力，并能捕捉溶液中的瞬态物种。质谱是一种有用的方法，可用于结构评估降解剂的二元和三元复合体。氢-氘交换质谱（HDX-MS）可以通过与氘交换后进行淬火、消化和肽分析，来确定哪些残基因氘的摄入而质量增加，从而了解酰胺氢的溶剂暴露情况。HDX-MS可以解析由二元降解剂结合引起的构象变化；例如，Watson等人展示了cereblon的溶剂暴露减少，这与分子接头结合时从“开放”状态转变为“关闭”状态一致。(226) HDX-MS还可以研究三元复合体的形成；例如，Dixon等人强调了VHL和SMARCA2/4在与ACBI1和其他PROTAC形成三元复合体时形成的PPi残基。(242) Eron等人使用HDX-MS研究了CRBN/Brd4三元复合体。(243) 离子迁移率质谱（IM-MS）可以提供溶液中存在的天然蛋白质构象和相互作用的信息。Song等人使用IM-MS揭示了MZ1介导的VCB和Brd4BD2之间的三元复合体可以采用多种构象。(131) 小角X射线散射（SAXS）也可以应用于TPD，以提供复合体的大小和形状信息。Kroupova等人使用这种方法研究了二元结合，表明他们的新型CRBN构建能够在与iberdomide、mezigdomide和来那度胺的二元结合下从“开放”构象转变为“关闭”构象，这与Watson等人使用全长CRBN-DDB1复合体获得的见解一致。(161) Dixon等人还使用SAXS展示了VHL-ACBI1-SMARCA2/4系统的三元复合体形成。(242) 近年来，已经开发了计算方法来预测和建模降解剂三元复合体。如HADDOCK(244)和Rosetta(20)等方法提供了在小分子降解剂化学合成和生物评估之前的计算机筛选潜力。还开发了模型PROTAC介导的三元复合体形成的计算方法；(245?250) 其中一些已在其他地方进行了综述。(35,251)5. 评估目标蛋白泛素化的方法5.1. 生物物理学方法在体外和细胞中监测泛素化水平除了E3-降解剂-底物三元复合体的形成外，还需要加载泛素的E2与底物结合后释放泛素到新底物的赖氨酸上并形成多聚泛素链，以触发多聚泛素化底物的识别、展开和降解。最初，在TPD的背景下，泛素化测量较为稀少，通常使用终点测定法，在给定时间停止反应。这些实验可以使用纯化的重组蛋白在体外进行。细胞中的泛素化水平也可以通过使用蛋白酶体抑制剂MG132预孵育细胞来评估，然后用共免疫沉淀或亲和标签沉淀和Western blot来识别泛素化，通过观察特有的“多聚泛素阶梯”效应。(64,68,143),(252?254) 通过放射性标记也探索了降解剂靶向底物的可视化。(9) 虽然这种方法非常敏感，但由于辐射危害而不受欢迎。Vieux等人的一项研究评估了泛素化动力学；然而，这种方法也依赖于时间点和免疫印迹。(255) 虽然这些实验方法能有效确认目标蛋白的泛素化，但仅是半定量的，不允许连续读数，从而限制了对酶催化反应的实时动力学数据和参数的外推。具有更高灵敏度的荧光小分子和相关仪器的开发为更敏感和基于时间的泛素化事件监测提供了机会。(256) Crowe及其合作者开发了一种直接共价标记Brd4BD2的Alexa Fluor 647蛋白，在体外泛素化后使用Alexa Fluor 488标记的泛素并通过SDS-PAGE分离蛋白质物种，从而可以在给定时间点量化Ubmax和UbC50参数。(69) 在TPD的背景之外，还测量了泛素的荧光极化，(257,258) 以及标记的泛素物种与标记的底物之间的FRET和单分子FRET（smFRET）。(259?261) Schroder等人还使用FRET研究了PROTAC依赖的BTK泛素化。(10) 另一种用于泛素化监测的工具是串联重复的泛素结合实体（TUBEs）。由Hjerpe等人引入的TUBE技术基于四个泛素结合结构域（UBAs），这些结构域能够识别四聚泛素。（262）利用这一工具，可以从重组系统和细胞提取物中分离出多聚泛素化的蛋白质进行进一步分析。值得注意的是，TUBE可以保护其结合的多聚泛素链免受去泛素化酶（DUBs）和蛋白酶体的降解；然而，在这些实验中通常仍需要使用蛋白酶体抑制剂。该方法可以与磁珠TUBEPull-down结合使用，并通过Western blotting检测目标蛋白以及进行质谱分析。（263）商业化的“UbiTest”试剂盒将这种技术扩展到了平板格式，Gross等人利用它研究了dBET PROTACs介导的BET蛋白泛素化过程。（264）虽然这种方法不需要针对目标蛋白的抗体，但其信号可能会受到其他多聚泛素种类的背景噪音影响，且无法解析动力学过程。TUBE还用于商业化的“UbiQuant”检测中，其中AlphaLISA标记的TUBE和针对目标蛋白的抗体能够在目标蛋白多聚泛素化时增强信号。已经发表了一例关于Brd3被dBET1泛素化的研究。（263）带有荧光标记（如TAMRA或荧光素）的TUBE也得到了研究；（263）到目前为止，尚未有实验使用这些荧光标记与小分子降解剂结合。Riching等人的研究首次在细胞背景下测量了降解剂诱导的泛素化动力学，并通过一系列基于生物发光的细胞实验发现了细胞三元复合体形成与目标蛋白泛素化水平升高之间的关联，表明有效的泛素化源于三元复合体的形成。（58）这种NanoBRET泛素化检测技术已被成功应用于多种系统中。（3,72,141, 150,265）
5.2. 降解剂-目标蛋白泛素化的结构和机制特征
除了提供泛素化速率的动力学信息外，了解降解剂如何影响目标蛋白的有效性和选择性泛素化的结构和机制细节对于开发高效降解剂非常重要。直到最近，这类研究仍然较少，主要集中在计算建模上。通过建模和质谱分析已经对招募E3 CRL2VHL的降解剂进行了研究；例如，Gadd等人对CRL2VHL与MZ1、Brd4BD2、UBE2D及泛素复合物进行了建模，并在MZ1依赖性体外实验中确定了BET溴结构域上的赖氨酸泛素化位点，发现Brd4BD2上的K346位点靠近E2活性位点。Khan等人也使用质谱技术发现，在他们的VHL招募DT2216 PROTAC中，BCL-XL上的K87是唯一的赖氨酸位点。最近，有几项研究专注于CRL4CRBN招募系统。Bai等人的研究通过Rosetta建模预测了几种cereblon招募PROTAC对周期蛋白依赖性激酶（CDK）的泛素化效率，并通过质谱技术定位了泛素化赖氨酸位点。（265）Wu等人进行了分子动力学模拟，以了解Brd4BD1表面赖氨酸相对于CRL4A招募的E2活性位点的排列情况。（266）Zhao的研究数学模拟了VHL、CRBN和BIRC2招募系统的三元复合体动态，指出了靠近目标底物E2活性位点的泛素化区域。（267）最近，冷冻电镜（cryo-EM）为获得泛素化的结构细节提供了实验方法。Crowe和Li等人利用这一技术解析了Brd4BD2与MZ1及CRL2VHL复合物的结构，分别使用了UBE2R1和UBE2R2。（69,235）Crowe等人利用UBE2R1开发了一种可用于冷冻电镜的灵活交联试剂，明确了K456位点是亲核攻击的最佳位置。在对重组Brd4BD2进行体外泛素化处理后，他们通过质谱技术发现了K-GG修饰位点，揭示了可以被CRL2VHL/UBE2R1泛素化的“轻链面”，其中K456位点是唯一显示出泛素化迹象的赖氨酸位点。（69）尽管获得高分辨率的冷冻电镜结构较为困难，但这种方法能够有效展示底物的取向、可被泛素化的赖氨酸数量，以及降解剂对底物的泛素化能力。
“泛素组学”（即蛋白质组中泛素的全局映射）可以为内源性目标蛋白的赖氨酸修饰提供见解。Dixon等人和Cantley等人利用该技术分别对SMARCA2和SMARCA2/4上的泛素化赖氨酸进行了研究（242,268），Crowe等人研究了MZ1处理后BET蛋白上的泛素化赖氨酸。（69）这种方法还能揭示潜在的脱靶泛素化现象，这对于评估降解剂的安全性非常重要。已经开发了多种基于计算的方法，利用实验验证的泛素化位点数据库来预测泛素化情况（269）。这些方法通常结合了多种参数，包括但不限于氨基酸组成（AAC）、氨基酸成对组成（AAPS）、位置加权矩阵（PWM）、位置特异性评分矩阵（PSSM）和溶剂可及表面积（SASA）以及机器学习算法，例如ESA-UbiSite、DeepUbi（270）、UbiComb（271）等。（272-274）目前这些方法尚未应用于文献中的TPD研究。
总体而言，这些研究主要依赖于建模和预测，或结合冷冻电镜技术以及体外或细胞蛋白质组学质谱分析；尽管如此，仍有研究表明目标蛋白上可被泛素化的赖氨酸数量与目标的降解性之间存在关联。（242,275）
5.3. 解析降解剂介导的泛素链组装
除了整体结构和赖氨酸对E2活性位点的可及性外，目标蛋白还需要被带有K48和/或K11连接的多聚泛素标签修饰，这些连接有利于26S蛋白酶体的识别和处理。（276）质谱是最常用于分析泛素链连接的方法。例如，Ottis等人通过细胞蛋白质组学方法证实CRL2VHL和CRL4CRBN可以介导其降解剂招募的底物上的K11和K48连接。（277）目前正在开发确定泛素链确切拓扑结构的方法，以区分单个多聚泛素链与多个单聚或多聚泛素链，并区分线性链和分支链。Kaiho-Soma等人研究了TRIP12如何与CRL2VHL结合，促进Brd4上的K29/K48分支链的形成，并加速Brd4和Brd2的降解。（278）他们使用工程病毒蛋白酶Lbpro*解码了分支泛素链的连接结构。（278）在TPD领域之外，Meyer等人使用质谱方法发现K11/K48链更容易被p97和蛋白酶体识别，表明链的分支可能有利于降解。（280）诸如异肽酶T之类的去泛素化酶可以分解多聚泛素链，生成用于质谱分析的片段以确定连接类型。（281）除了质谱方法外，还有一些特异性识别泛素连接的抗体和TUBE，它们被用于验证目标蛋白是否被K48或K11链修饰。（282）简单的SDS-PAGE分析也可以用于此目的；例如，加入K48特异性去泛素酶（如OTUB1）后，如果泛素链消失（通过凝胶染色观察到多聚泛素梯状或污片），则表明存在K48链。实际上，商业试剂盒（如UbiCRest）结合了多种连接特异性去泛素化酶，可用于体外分析泛素连接偏好。（283）尽管已经开发了许多工具，但确定泛素化的确切分子谱型（包括泛素链的架构）仍然具有挑战性。最近发现的非经典“非赖氨酸”泛素化事件和机制进一步扩展了泛素代码的范围（284），研究这些新机制将有助于降解剂的发展。
6. 小分子介导的降解
6.1. 监测目标蛋白降解速率和水平的方法
降解剂的效果最终取决于其降解目标蛋白的能力；因此，建立可靠的实验方法来评估目标蛋白的水平是降解剂开发流程中的关键步骤。最常用的方法是降解剂处理后进行Western blotting。2023年的一项文献综述显示，在评估的期刊中，60%的TPD相关论文仅使用Western blotting来评估目标蛋白的降解情况。（285）这种方法具有半定量特性，但存在一些限制，尤其是信号饱和需要大量时间、需要经过验证的有效抗体，并且需要特定的时间点进行检测。因此，更灵敏和定量的方法（能够实时连续检测）对于提高通量和更全面准确地了解蛋白降解过程非常有用。在TPD研究中，应用了多种基于免疫印迹的技术。毛细管电泳方法比Western blot具有更高的通量，但也有类似的缺点。（89,286）酶联免疫吸附测定（ELISA）在平板形式下具有更高的通量且更定量，但需要预先制备标记抗体。（163,287,288）AlphaLISA、TR-FRET和Lumit检测可以在高通量平板上进行，需要两种不同的抗体结合目标蛋白的不同表位，而且这些检测属于终点分析，需要细胞裂解。（289,290）对于TR-FRET，可以使用预标记的二次抗体来避免标记一次抗体的需求。（151）质谱是一种灵敏且无标记的检测方法，但通量较低。全局蛋白质组学分析可用于检测目标蛋白在降解前后的丰度，对于验证降解剂的选择性和识别脱靶效应非常重要。（142）例如，Zorba等人展示了他们的BTK PROTAC对TEC的脱靶降解；（176）而Wang等人测试了一种非选择性的Helios降解剂，并发现了新的蛋白靶点ZNF324。（291）细胞培养中的稳定同位素标记（SILAC）方法通过在高同位素培养基中培养细胞来识别和定量同位素标记的蛋白质；An等人的研究利用这种方法发现了新的CRBN招募分子胶粘蛋白ZFP91。（292）Savitski等人开发的“多重蛋白质组动力学分析”（mPDP）结合了SILAC和同位素质谱技术，用于确定他们合成的VHL招募BET降解剂的脱靶蛋白。（293）虽然上述方法是评估目标蛋白降解的常用方法，但荧光和发光标记以及内源性蛋白标记策略的发展使得在活细胞中实时监测蛋白降解和再合成成为可能。（294）绿色荧光蛋白（GFP）已应用于多个研究，例如Brd4（5,20）、周期蛋白K（13）、IKZF1（20）和KRASG12C（253）。最近，通过在HEK293细胞中短暂转染N端标记的BET溴结构域NanoLuc-Brd4BD2，实现了细胞降解的定量，观察到不同赖氨酸到精氨酸泛素突变体之间的统计学显著差异。（69）其他标记如enhanced ProLabel（ePL）也已被探索。（295）目前，在降解剂开发研究中，最广泛使用的方法是HiBiT系统，该系统最初由Riching等人建立（58,74）。这种方法利用CRISPR将内源性底物蛋白标记11个氨基酸长的HiBiT肽。（294）LgBit（18 kDa多肽）转染细胞后，HiBiT和LgBiT结合形成NanoBiT复合物。然后用endurazine处理细胞，该化合物被细胞酯酶还原形成furimazine衍生物，进而与NanoBiT复合物结合。当活性NanoBit酶氧化furimazine时，会释放出furimamide以及一个发光信号，该信号可以被追踪用来监测NanoBiT底物蛋白在蛋白酶体中的降解过程（图12 A）。(58,74) 这种方法最初被用于监测BET蛋白（58），例如BRD4（如图12 B所示例子），后来应用范围不断扩大，涵盖了多种系统，如内源性BET溴结构域（3,10,58,66,141,150）、WDR5（62）、SMARCA2/4（296,297）、KRAS（73,298）、CBP/p300（299）、TEAD（300）和CDK2（301）等。图12展示了使用PROTACs进行细胞HiBiT降解的原理：A图说明了endurazine与LgBit+HiBiT结合产生可在活细胞实验中检测到的发光物质；B图展示了监测内源性HiBiT标记的BRD4降解的实验流程。
目前这些蛋白质标记策略是确定最大降解速率（Dmax）和半最大降解浓度（DC50）等关键动力学参数的最定量方法。但这些方法通常需要对目标细胞系进行异位或基因组编辑，对于某些内源性目标蛋白来说，使用CRISPR-Cas系统时可能具有挑战性。此外，还需要注意标记不会影响天然蛋白的稳定性和活性（302）。另外，这些标记中的表面暴露赖氨酸可能会成为降解的靶点（303）。鉴于所有这些注意事项和局限性，使用无标记的方法来验证报告基因实验结果仍然很重要。
可以在体外探索测量降解的方法，例如利用纯化的26S蛋白酶体和泛素化机制，但这一点尚未应用于小分子降解系统。尽管已经开发了一些计算机器学习模型来预测目标蛋白的降解性，但这些模型似乎依赖于泛素化等上游事件（275）。为了应用深度学习方法，需要更多的实验数据来训练可靠的模型（305）。
6.2 研究目标蛋白降解途径和细胞定位的方法
除了监测细胞内蛋白质水平外，还需要了解降解发生的途径。例如，不同的降解机制（如UPS系统和自噬）之间可能存在相互作用（306,307）。Wang等人的研究就发现了这一点，他们发现SEH并非如最初预期的那样通过蛋白酶体降解，而是经历了溶酶体降解（288）。通过使用蛋白酶体抑制剂MG132或测试目标蛋白是否被p97识别（308），可以验证部分降解机制。在测试目标蛋白降解时，还应包括其他适当的对照实验，例如使用不与目标蛋白或E3连接酶结合的非活性化合物，以检测非降解酶依赖性的蛋白不稳定性；或者使用bafilomycin等溶酶体/自噬通路的药物阻滞剂（309）。
了解目标蛋白在细胞内的位置对于探究降解途径也很重要。实际上，UPS系统可以有效地降解核质和胞质蛋白（310），某些核蛋白需要被转移到胞质中才能被蛋白酶体高效降解（311）。某些位于特定细胞器（如内质网）的蛋白也会被UPS系统降解（313）。然而，针对这些细胞环境外的蛋白（如分泌蛋白和细胞外蛋白以及线粒体中的蛋白）进行降解是不可行的。膜蛋白也是TPD（T NASA）的潜在靶点。膜蛋白可以通过单次穿膜或多次穿膜的方式被降解；这类蛋白通常具有胞质结构域，从而能够被UPS系统识别，已有研究表明PROTACs可以降解这两类膜蛋白（314?316）。尽管如此，膜蛋白降解过程中的具体机制仍不清楚：最近的研究表明，PROTAC处理和CRL2VHL的泛素化可能触发EGFR/HER2的内吞作用并使其被运送到溶酶体进行降解（317）。
7. 对药物开发的影响和应用
小分子降解剂可以被优化以完全且强烈地降解其靶向底物蛋白；然而，必须进行仔细的评估和数据分析，以产生适合临床试验的候选化合物。小分子的物理化学性质直接影响其药代动力学和药效学特性，因此对降解剂的优化和治疗效果至关重要。由于降解剂采用催化作用模式，其主要优势在于可以在亚化学计量浓度下发挥作用。尽管如此，仍需微调降解剂分子结构以克服其在作用部位吸收和递送的挑战。降解剂可能面临细胞外排问题（113,114），并且在体内可能被代谢（79,318），导致药物分子被排出或失活。改善吸收、代谢和外排的方法需要与分布研究相结合，以优化组织特异性，从而减少其他组织的细胞毒性和副作用。第2节描述的方法论，结合其他地方的体内研究和蛋白质组学方法（34），可以帮助生产具有校准ADME特性的临床候选物。
即使具备最佳的递送和靶蛋白结合能力，降解剂分子仍需在其作用部位产生正确的药效学反应——即劫持UPS机制，从而强烈降解目标蛋白并维持其低水平。因此，使用前述方法进行优化和评估对于药物开发同样关键。必须找到适当的平衡，以协调ADME特性和所需的靶蛋白降解效果。
除了物理化学性质外，靶向递送策略和降解剂的进一步功能化也有助于克服选择性和通透性方面的挑战。一些提出的方法包括引入额外的靶蛋白配体（150,319）、抗体（320?322）、肿瘤细胞特异性标签（323?327）、前药基团（328）和笼状结构（329?331），通过点击化学（332）或其他载体调控递送（333），或者利用光控方式来时空调节降解剂的激活（334,335）。尽管已有这些多功能降解剂的概念验证研究，但尚未产生临床候选物。总体而言，本文讨论的方法（图13），结合蛋白质组学分析和体内及临床前评估，可以产生适合推进到临床阶段的候选化合物（73,336）。
尽管本文概述了多种方法，但在降解剂开发或药物发现项目中应用这些方法时，需要根据具体项目目标来选择合适的检测方法——无论是目标验证、细胞降解的证明，还是体内的概念验证。实际上，这一过程涉及为特定目的和最终目标选择合适的检测方法。例如，在部署筛选级联时，需要考虑哪些方法在通量和可扩展性方面最适合。而对于关键化合物的深入表征或构建详细的机制洞察，选择能够提供高信息量的方法更为重要，这些方法可以揭示结构-活性关系的细微差别。
在传统方法中，最初的命中化合物识别和结构-活性关系（SAR）分析可以通过基于平板的高通量筛选方法进行，如HiBiT细胞降解测定或二元结合生物物理测定。细胞测定有其优势，因为它们能在天然环境中捕获目标蛋白，且不需要大量纯化重组蛋白。近年来，出现了几种直接针对生物学目标的方案（204,337,338），消除了在生物筛选前进行批次分子纯化的需要。一旦识别出结合剂和初始降解剂，就需要通过机制验证来确认降解过程是否通过预期的UPS依赖途径进行，而中等通量的测定方法（如TR-FRET或AlphaLISA）可以确认有效的三元复合物的形成。最后，候选化合物的优化阶段通常会结合多种方法来优化特定的降解剂分子系列。低通量但信息丰富的方法（如X射线晶体学或冷冻电子显微镜）能够提供必要的结构信息，用于单原子或基团水平的药物化学修饰，以提升活性和合理设计连接剂。总体上，通常会结合多种方法来解决化合物设计和优化问题。
Popow等人开发ACBI3（一种泛KRAS降解剂）的工作就是一个例子（图14 A）。作者从KRAS开关II口袋中的配体共晶体结构开始，确定出口载体并连接烷基和PEG连接器，生成了一系列招募VHL的PROTACs。通过二元和三元FP筛选，作者发现化合物2具有高合作性和高亲和力。细胞靶标结合测定帮助作者发现了化合物2的渗透障碍，并发现了更具渗透性的衍生物化合物3。化合物3与KRASG12V和VCB形成的三元晶体结构揭示了连接器优化的机会，最终得到了化合物4。Vetma等人通过一系列关键的三元复合物SPR表征和HiBiT细胞降解测定，开发出了ACBI4（一种泛KRAS降解剂）（图14 B）。
Robbins等人展示了如何通过组合多种方法从早期结合剂命中化合物到临床候选药物NRX-2127 BTK降解剂的开发（图14）。作者首先使用高通量DNA编码文库（DEL）筛选方法探索化合物空间，并确定了BTK的二元结合剂，然后通过结合二元X射线晶体学和分子对接来确定可能的出口载体。随后开发了一系列PEG连接器PROTACs并在细胞降解测定中进行了筛选。由于化合物5具有较高的BTK降解活性和较低的分子量而被选中。经过小鼠药效学测定和进一步的细胞分析后，NRX-0492因其良好的体外和体内效果而被优先考虑。最后，通过二元X射线晶体学修改了BTK结合剂，得到了NRX-2127（图14 B）。
8. 结论与未来展望
本文全面介绍了目前可用于表征和理解小分子降解剂通过泛素-蛋白酶体系统降解途径作用机制的方法和检测手段。我们首先探讨了如何直接测量细胞渗透性以及通过荧光监测来进行评估。我们介绍了利用化合物的物理化学性质以及计算和实验方法预测降解剂构象的方法，从而了解化合物的灵活性和折叠特性。降解剂在细胞内的摄取，特别是对于较大且具有较大暴露极性表面的双功能分子来说，是降解剂开发的一个限制因素。对于PROTACs和其他不符合“五规则”的降解剂，必须在实验室合成前进行计算机评估和物理化学性质考量，之后可以通过多种检测方法来表征分子在细胞内的复杂行为。
我们还探讨了表征降解剂与靶蛋白或E3连接酶的二元结合以及三元复合物形成的方法。我们重点关注了生化及生物物理学方法，用于表征三元复合物的大小和寡聚状态、基于溶液的邻近性和竞争性检测方法，以及生物传感器和基于溶液的直接结合方法。这些方法在蛋白质消耗量、标记和固定要求、检测范围以及提供的信息类型等方面进行了比较和对比。这些体外生物物理学实验对于降解剂的优化至关重要，能够在最大限度地提高三元复合物形成的持久性（半衰期）、稳定性以及解离平衡的协同性方面提供大量宝贵信息，这些信息还有助于预测药代动力学（PK/PD）关系。这些方法可以通过细胞生物物理学中的二元和三元复合物研究来补充，尽管后者在定量分析方面可能较弱，但能够揭示与内源性全长蛋白质的相互作用。综合这些实验结果，我们可以获得关于化合物的细胞通透性、输出/外排、隔离机制以及靶蛋白分布的信息。一系列结构生物学技术可用于研究降解剂与蛋白质复合物的相互作用。蛋白质X射线晶体学能够提供高分辨率的信息，指导优化后的二元和三元复合物的分子设计；然而，它可能无法全面反映异质系统的实际情况。其他方法如冷冻电镜（cryo-EM）有助于解析样品的异质性，并为大型复合物的结构解析提供有用数据，而溶液中的方法则能从不同角度加深我们对这些复合物的理解。
泛素化在靶向蛋白降解（TPD）中的作用尚未得到广泛研究，但它却是降解剂作用机制中的一个关键步骤。近年来，生物物理学和结构生物学方法被应用于优化降解剂介导的靶蛋白泛素化过程。细胞内的降解实验对于验证降解剂的作用机制及评估脱靶效应非常重要，而一些基于平板的降解实验则为化合物分析和筛选提供了定量且高通量的数据。总体而言，这篇综述阐述了如何研究降解剂的开发过程，从验证其基本作用机制到优化其作用路径中的各个步骤。虽然这里描述的每种检测方法原则上都可以用于药物发现工作，但由于时间和资源的限制，实际上在任何给定的药物发现项目中，只有少数几种检测方法会被实际应用——这通常取决于通量、可扩展性、数据生成速度和材料消耗等因素。尽管存在这些实际考量，但深入研究E3连接酶与靶蛋白之间的分子识别机制及其对靶蛋白泛素化和降解的影响，在许多情况下对降解剂分子的成功至关重要。这种深入研究需要开发并应用体外和细胞内的生化、生物物理学及结构生物学方法，而这些方法往往成本较高、耗时较长、技术要求较高且通量较低。因此，这类方法通常只适用于少数精心挑选的化合物。面临的挑战是在设计-制备-测试-分析（DMTA）的时间框架内获取足够的数据，以支持药物化学家的决策过程。进一步的创新，包括自动化、筛选和计算方法的发展，将有助于更快、更深入地了解降解剂的作用机制。
这里引用的大部分文献都集中于CRL2VHL和CRL4CRBN这两种降解剂，随着E3连接酶库的不断扩展，越来越多的降解剂分子被设计用来靶向其他类型的Cullin RING连接酶（如VHL和CRBN以外的酶）。尽管CRL2VHL和CRL4CRBN系统已经较为成熟，但本文讨论的方法同样可以应用于其他E3连接酶或其他需要降解的蛋白质的降解剂开发过程中。预计这篇综述中的方法将促进对降解剂作用机制、整体性质和性能的进一步研究，并为改进的降解剂药物及其他基于邻近效应的药物治疗策略的优化提供指导。
