振动成像技术的下一个前沿：化学设计的拉曼探针突破了光谱限制

《JACS Au》：The Next Frontier in Vibrational Imaging: Chemically Designed Raman Probes Pass the Spectral Barrier

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由于将尖端显微技术与复杂的化学工程探针相结合，细胞和组织中的多色振动成像技术最近取得了快速进展。在这里，我们回顾了拉曼成像探针的设计策略，并根据其化学结构进行了分类。最后，我们讨论了多色振动探针在研究复杂生物现象方面的潜力，并指出了需要进一步研究的领域。

1. 引言
拉曼成像和红外（IR）成像都已被用于直接、无创地可视化目标分子。红外成像受到强水吸收和有限空间分辨率的阻碍，但最近的发展，如使用可见光探针的中红外光热（MIP）显微镜（1?3）或检测荧光作为信号输出的光致红外激发（BonFIRE）显微镜（4,5），正在克服这些问题。另一方面，拉曼显微镜受到拉曼散射固有截面低的限制，但过去十年左右发展出的复杂显微技术，加上引入的精心设计的化学拉曼探针（图1），使得拉曼成像能够应用于更复杂的生物现象。特别是在细胞和组织中的多色振动成像引起了极大的关注。在这篇综述中，我们首先简要介绍了显微技术的发展，然后重点讨论了按分子结构分类的拉曼探针的进步。

图1
图1. 化学合成拉曼探针和振动成像技术的发展历史概述。缩写：EdU，5-乙基-2′-脱氧尿苷；RIE，相对拉曼强度与EdU的关系；AA，氨基酸；ATRI，炔基标记拉曼成像；SRS，受激拉曼散射；FCCP，羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；RR，共振拉曼；BADY，双芳基丁二炔；ATRaS，炔基标记拉曼筛选；MIP，中红外光热；MARS，曼哈顿拉曼散射；EPR：电子共振；Carbow，碳彩虹；STRIDE，氘的光谱追踪；SREF，受激拉曼激发荧光；PDDA，聚（十-4,6-二炔二酸）；Rdots，拉曼点；AERS，偶氮增强拉曼散射；RESORT，可逆饱和光学拉曼跃迁；BonFIRE，光致红外激发荧光检测；SICTERS，堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射；NPs，纳米颗粒；ABATaRs：基于活性的炔基标记拉曼传感器；NIR，近红外。

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1.1. 显微技术的演变
拉曼显微镜可以通过检测与分子振动相关的非弹性拉曼散射来直接提取分子结构信息，从而实现无标记成像。（6）然而，典型的拉曼散射截面约为10–30 cm2，而典型的单光子吸收截面约为10–16 cm2，这种低灵敏度严格限制了使用拉曼显微镜观察活体样本。实际上，1990年报道的基本共聚焦拉曼显微镜系统（7）需要较长的曝光时间（约10分钟才能获取一个光谱），但到2008年，Kawata及其同事通过采用狭缝扫描激发和检测系统，将成像时间缩短到了几分钟，使得观察活细胞成为可能。（8）Fujita及其同事通过使用结构化线照明进一步改进了自发拉曼显微镜，提高了空间分辨率，（9）引入了贝塞尔光束照明用于厚样品，（10）最近冷冻拉曼显微镜使得使用极长曝光时间成为可能。（11）这些自发拉曼显微镜技术的演变并没有提高拉曼散射固有的低灵敏度，但有一些方法可以增强拉曼散射本身或将其转换为更强的信号。前者采用表面增强拉曼散射（SERS）通过表面等离子体共振来增强电场，后者利用相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）或基于相干拉曼散射（CRS）的非线性光学过程。

SERS通常需要具有局部表面等离子体共振的粗糙金属表面，但与自发拉曼散射相比，其灵敏度提高了4–8个数量级（12），并达到了单分子灵敏度。（13,14）然而，对于SERS的生物应用来说，定量是一个问题，金属基底的细胞毒性也是一个问题。尽管如此，SERS的发展，即尖端增强拉曼光谱（TERS），通过使用带有金属尖端的近场扫描显微镜，实现了极高的空间分辨率（15?17），并能够实现超出衍射极限的超分辨率。（18,19）无金属的CRS显微镜是生物样本的一个有前景的方法。CARS是一种四波混频过程，使用泵浦（ωp）和斯托克斯（ωs）光束。当ωp – ωs与目标的振动频率匹配时，会产生强烈的CARS信号（2ωp – ωs）。（20?22）由于CARS信号频率从激发频率蓝移，它可以避开荧光背景。1982年首次报道的CARS显微镜（23）不适合生物观察，但该技术在2000年代得到了改进和完善，适用于生物成像。（24,25）另一方面，SRS显微镜的发展是为了克服CARS显微镜的非共振背景。（26,27）2007年报道了其在非生物样本中的应用，（28）然后在2008–2009年出现了生物相容的高速SRS显微镜。（29?31）SRS也需要泵浦（ωp）和斯托克斯（ωs）光束；当ωp – ωs与目标的振动频率匹配时，会发生泵浦光的受激拉曼损耗（SRL）和斯托克斯光的受激拉曼增益（SRG）。通过检测这种激光强度的变化，SRS提供了没有非共振背景的强信号。另一方面，高速宽带SRS成像（32）仍然具有挑战性，SRS的光谱覆盖范围通常受到两个光源狭窄频率调谐范围的限制。最近，宽带SRS解决了这一限制（33?35），并且基于SRS的先进显微镜技术，如受激拉曼激发荧光（SREF）显微镜（36）和受激拉曼光热（SRP）显微镜（37）已经开发出来。

1.2. 无标记拉曼成像
拉曼显微镜的一个关键优势是无标记成像。（38,39）细胞的典型峰包括苯丙氨酸的环呼吸模式（1000 cm–1）、CH2变形（1451 cm–1）、肽的酰胺-I振动模式（1660 cm–1）、脂质的CH2伸缩模式（2850 cm–1）和蛋白质的CH3伸缩模式（2935 cm–1）。（8）此外，由于共振拉曼增强作用，可以使用适当的激发波长检测细胞内的色素（见第4节）。实际上，使用532 nm激发光可以在600、750、1130、1314和1585 cm–1处检测到线粒体细胞色素C，并用于评估细胞凋亡（40）或药物诱导的细胞毒性（41）。特别是1800 cm–1以下的光谱区域，称为分子指纹区域，提供了关于分子振动的详细信息。例如，它可以用于代谢物的全面筛查（42）或单细胞的RNA分析（43）。水中的O–H伸缩在3400–3600 cm–1处被用来测量细胞中的水密度（44）和细胞内温度（45）。

高灵敏度的CRS显微镜大大扩展了无标记成像的应用范围，包括脂质（46,47）、核酸（48）、乙酰胆碱（49）和淀粉样斑块（50）。CARS在新的波长下检测信号，因此不需要锁定泵浦光束，使其在表面检测（51?53）和宽带检测（54?56）方面更优越。关于SRS，模拟伊红和苏木精（H&E）染色的受激拉曼组织学（SRH）已被用于快速术中诊断（57?59）。此外，通过结合扩展显微镜（ExM）和机器学习，实现了无标记的超分辨率成像（60）。

2. 同位素标记化合物
无标记蛋白质或脂质的固有拉曼散射信号可以被视为背景信号，这使得在生物样本中选择性地检测特定振动变得困难。由于化学键的振动遵循胡克定律，即取决于化学键的减少质量，因此可以通过稳定同位素替代来调节振动频率。例如，通过用氘（D，质量数：2）替换氢（H，质量数：1），大约3000 cm–1处的C–H振动可以调谐到约2100 cm–1。重要的是，生物分子信号不会出现在1800 cm–2800 cm–1的区域，即所谓的细胞静默窗口，因此用氘替换氢可以被认为是最小的生物正交标记。

2.1. 使用氘标记进行代谢追踪
使用氘标记化合物的拉曼成像主要用于无创代谢追踪，利用这种标记的微小扰动（图2a）。2005年，使用花生四烯酸-d8（AA-d8）直接成像中性粒细胞的吞噬作用（61），此后，使用氘标记的脂肪酸（棕榈酸-d31（62?64）或油酸-d33（64,65））和氘标记的脂质体（将棕榈酸-d31（66）或硬脂酸-d35（67,68）与磷脂酰胆碱结合）进行生物正交检测。Cheng及其同事在先进的CARS（66）或SRS（62,63）显微镜中使用了这些氘标记的生物分子。此外，氘标记具有动力学同位素效应（KIE），因此双烯丙基甲基结构的氘化会抑制多不饱和脂肪酸（PUFAs）的代谢。为了利用这一点，Sodeoka及其同事合成了部分或完全氘化的γ-亚麻酸（D2-GLA、D4-GLA或all-D-GLA），并通过拉曼成像观察到all-D-GLA在肿瘤细胞脂质滴中的积累，为肿瘤选择性细胞毒性提供了可能的基础（69）。其他例子包括高度氘化的D38-胆固醇，它是通过喂食二氧化氘（D2O）的工程酵母菌株产生的（70）。这比胆固醇-d6（64）的氘化程度更高，信号强度大约是商业上可获得的D7-胆固醇的五倍。

图2
图2. 同位素标记的拉曼探针。(a) 可代谢掺入的同位素标记生物分子：脂质和氨基酸。(b) 光谱可分辨的分支链氨基酸和D9-胆碱。代谢标记的氘源，D2O和[D7]-葡萄糖。(c) 带有芳香C–D标签的拉曼探针。(d) 末端炔基的H/D交换引起的振动位移。缩写：GLA，γ-亚麻酸；TCA，三羧酸循环；PCho，丙炔基胆碱。

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氘标记的氨基酸（D-AAs）也进行了研究（图2a）。尽管2008年使用Phe-d5、Tyr-d4和Met-d3进行了自发拉曼成像（71），但Min及其同事随后通过SRS显微镜评估了D-AAs（Leu-d10和一组氘标记的氨基酸）的代谢掺入，并以高时空分辨率可视化了新合成的蛋白质（72）（图2a）。类似地，用稳定同位素标记的13C-Phe在968 cm–1处显示出红移的环呼吸模式（天然12C-Phe：1004 cm–1），并且使用12C/(12C + 13C)的比例来监测蛋白质组降解（73）。Wei及其同事使用Gln-d5研究了多聚谷氨酰胺（polyQ）疾病，并表明SRS能够实现无淬灭的polyQ聚集体成像，因为其浓度是线性的。（74）虽然氘标记有利于无创追踪代谢物且扰动小，但在解释光谱输出时需要小心（图2b）。由于C–D键的化学环境多种多样，C–D振动的拉曼信号通常会变宽，因此检测特定目标的明显峰非常重要。Min及其同事关注了分支链D-AAs（Ile-d10、Leu-d10、Val-d8）和非分支链D-AAs之间的光谱差异。由于分支链D-AAs在2067 cm–1处显示出明显的峰，因此使用分支链D-AAs和非分支链D-AAs的顺序标记实现了脉冲追踪成像（75）。此外，这些分支链氨基酸是必需的氨基酸，可以通过测量C–D（2125 cm–1）/C–H（2930 cm–1）比率来评估细胞生长率（76,77）。代谢可能是识别光谱的复杂因素。例如，胆碱的甲基转移到甲硫氨酸上，后者在细胞中作为甲基来源，可能使得追踪D9-胆碱的行为变得困难。然而，靠近阳离子氮原子的CD3基团在2188 cm–1处显示出明显的峰，与靠近硫或碳原子（如Met-d3或Leu-d10）的峰不同，因此在2188 cm–1处检测到该峰使我们能够选择性地追踪胆碱代谢物池（78）。D2O作为一种廉价且低毒性的试剂，可用于可视化代谢动态。尽管使用自发拉曼显微镜的方法由于灵敏度低和成像速度慢而受到限制（79,80），但将D2O探测与SRS（DO-SRS）显微镜结合使用，通过光谱解混成功可视化了稀疏氘标记的大分子（81）。实际上，SRS显微镜的出现大大扩展了使用D2O进行代谢追踪的应用（82?84）。另一个例子是使用[D7]-葡萄糖（85?88）。葡萄糖被代谢为各种大分子，如DNA、蛋白质、脂质和糖原。Min及其同事对[D7]-葡萄糖喂养的小鼠进行了氘同位素（STRIDE）的光谱追踪，并分离了氘标记的DNA、蛋白质、脂质和糖原的光谱（86）。

2.2. 芳香C–D标签
用氘替换氢进行生物正交标记的策略不仅限于脂肪族C–H键，也适用于芳香族C–H键（71,89?91）（图2c）。正如Phe-d5或Tyr-d4的拉曼光谱所示，芳香族C–D振动倾向于出现在相对较高的波数（约2200至2300 cm–1）处，而烷基C–D振动则出现在较低的波数（约2000至2200 cm–1）处。Nuriya及其同事使用氘代丙泊酚直接观察了麻醉对神经元的影响；丙泊酚-d17在2200 cm–1以上的独特峰据推测来源于芳香族C–D振动。Sawama及其同事对一种靶向线粒体的配体三苯基膦阳离子（TPP+）进行了H/D交换，并发现Mito-Q-d15的芳香族C–D振动位于约2300 cm–1的静默区域。此外，非甾体抗炎药氟比洛芬的芳香族H/D取代产生了氟比洛芬-d8，其在静默区域显示出约2280 cm–1的独特生物正交峰。因此，芳香族C–D标记不仅是一种生物正交标签，也是与其他氘标记化合物（尤其是烷基C–D标记化合物）进行多重成像的有希望的选择。

2.3. 端炔基的H/D交换
H/D交换不仅影响碳-氢振动，还影响碳-碳振动（图2d）。2021年，Sodeoka及其同事发现端炔基的氘代会导致炔基振动的红移。由于红移后的峰仍然出现在细胞静默区域，这种策略对于同时成像类似的炔基标记目标具有潜力。然而，需要注意的是，由于炔基的pKa值相对较低（约20–25），其上的氘很容易被氢取代。Wei及其同事利用这种氢-氘交换（HDX）来评估局部化学和细胞环境，他们用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或丙炔基胆碱（PCho）标记细胞，然后将细胞浸入D2O缓冲液中并监测(R–C≡C–D)/(R–C≡C–H)的比例。

3. 生物正交标记探针
为了克服氘的拉曼强度低和信号宽的问题，Sodeoka及其同事注意到炔基在细胞静默区域显示出独特的拉曼峰，并在2011年进行了炔基标记的拉曼成像（ATRI）。尽管EdU是一种用于荧光检测的胸苷类似物，但其掺入细胞核的过程可以通过拉曼显微镜直接观察到，而无需任何荧光试剂。这是首次使用拉曼探针进行活细胞成像的演示，也是拉曼探针成像的一个关键里程碑。

3.1. 用小标签可视化代谢吸收
葡萄糖类似物2-NBDG和6-NBDG在葡萄糖的第二或第六位被小荧光染料NBD（4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑）标记，它们具有不同的细胞吸收机制，这表明即使荧光团很小，传统的荧光标签也会强烈影响生物分子的内在行为。因此，使用只需要三个原子的端炔基进行标记应该有利于代谢示踪，因为它可以提供清晰且强烈的拉曼峰。此外，由于许多炔基标记的生物分子已经用于点击化学，因此它们很容易获得。除了EdU（胸苷的类似物）之外，EU（5-乙炔基尿苷，尿苷的类似物）、Hpg（L-同丙炔基甘氨酸，甲硫氨酸的类似物）、PCho（胆碱的类似物）、17-ODYA（17-十八炔酸，硬脂酸的类似物）、Ac4ManNAI（过乙酰化的N-(4-戊炔酰)甘露胺，唾液酸的前体）和3-OPG（3-O-丙炔基-D-葡萄糖，葡萄糖的类似物）也被用于直接炔基成像。最近，还研究了炔基标记的蔗糖和多巴胺。值得注意的是，通过13C掺杂可以轻松调节炔基标签的振动频率，从而实现多种生物分子的同时成像。然而，在某些情况下，如葡萄糖和甲硫氨酸，端炔基标记会影响细胞吸收。

3.2. 监测内在标记药物的分布
为了实现最小干扰的标记，对于药物来说，使用小标签是理想的。一些药物在其原始结构中包含拉曼标签，如炔基或腈基，这些标签的细胞内分布可以在不外加标记的情况下被观察到。例如，Erlotinib、Terbinafine、Neratinib和Ponatinib的分布或代谢可以通过无标记的方式观察到。然而，由于腈基的拉曼灵敏度较低，这种成像需要药物在细胞中大量积累。腈基相对于炔基的较低灵敏度可能是为什么具有内在腈基结构的药物很少能以无标记方式观察到的原因。

3.3. 生物正交标签的发展、亮度和颜色
如上所述，小拉曼标签的低灵敏度限制了可标记分子的范围，仅限于那些在细胞中浓度可达到毫摩尔级的分子。为了解决这个问题，Sodeoka及其同事在2012年筛选了多种炔基，以寻找具有更强拉曼活性的化合物。他们定义了相对拉曼强度与EdU（RIE）值，以比较不同拉曼探针的亮度，这一指标至今仍用于定量比较各种拉曼探针。在评估了近一百种衍生物后，发现共轭二炔显示出较高的RIE值，通过末端添加芳香环后这一值进一步增加。炔基通常比其他生物正交拉曼标签（腈基、叠氮化物或氘）显示出更高的RIE值。最近的研究表明，在炔基旁边引入硫连接基团可以增强RIE并导致炔基峰的红移。

3.4. 功能化拉曼活性分子
拉曼标记的小分子探针不仅可以通过振动标记来可视化目标分子，还可以通过反应相关的振动变化来感知各种化学响应。虽然炔基通常比腈基具有更高的灵敏度，但腈基具有强烈的吸电子特性，一些基于腈基的拉曼探针利用了这一特性进行化学传感。例如，FCCP（羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙）由于含有强吸电子的马来酮亚胺结构，其pKa值为6.0，在质子化和去质子化形式下显示出不同的拉曼峰。通过利用这一特性，可以监测质子化和去质子化FCCP的分布。丙烯腈结构作为一种迈克尔受体，含有内在的腈基标签。Yamakoshi及其同事制备了各种α-氰基丙烯酸（αCNA）衍生物，并评估了其与细胞内巯基（如GSH）反应时的拉曼位移变化，从而开发出一种紧凑且水溶性的GSH传感器iPrCAA。

此外，还开发了原位生成的炔基探针（图3b）。这些探针可以通过引入特定细胞器的配体来用于细胞器染色。2015年首次使用MitoBADY作为线粒体报告剂进行了这种类型的细胞器靶向。然而，高浓度的MitoBADY会失去对线粒体的选择性。Baranska及其同事发现具有交叉共轭炔基结构的RAR-BR可以高效地可视化线粒体。其他带有生物正交标签的细胞器标记探针包括用于内质网的falcarinol（图3h）和用于脂滴的NpCN1（图3h）。

B–H键在2400–2700 cm–1的静默区域也显示出拉曼信号。2014年，使用由两个碳硼烷簇夹住的钴原子组成的COSAN实现了活细胞成像。通过替换金属中心，可以调节B–H键的频率，并开发了各种金属（Co、Cr、Fe和Ni）的金属碳硼烷。硼簇化合物被认为是硼中子捕获疗法（BNCT）的有吸引力的候选者。富含硼的药物（ZL-1013/MB和BSH-Chol）的细胞积累可以通过非侵入性方法进行监测。

3.4. 功能化拉曼活性分子
拉曼标记的小分子探针不仅可以通过振动标记来可视化目标分子，还可以通过反应相关的振动变化来感知各种化学响应。尽管炔基通常比腈基具有更高的灵敏度，但腈基具有强吸电子特性，一些基于腈基的拉曼探针利用了这一特性进行化学传感。FCCP（羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙）由于含有强吸电子的马来酮亚胺结构，其pKa值为6.0，在质子化和去质子化形式下显示出不同的拉曼峰。通过利用这一特性，可以监测质子化和去质子化FCCP的分布。丙烯腈结构作为一种迈克尔受体，含有内在的腈基标签。Yamakoshi及其同事制备了各种α-氰基丙烯酸（αCNA）衍生物，并评估了其与细胞内巯基（如GSH）反应时的拉曼位移变化，从而开发出一种紧凑且水溶性的GSH传感器iPrCAA。这是基于结合的金属传感器的首次展示，此后该策略通过使用一种基于螺吡喃的结构得到了进一步改进，这种结构在与锌离子结合时具有可见光吸收特性，从而可以通过SRS显微镜进行检测（138）（见第4.3节）。如上所述，覆盖炔烃报告分子的芳香环上的结构变化是开发比率Raman探针的有效策略。在这种探针设计中，BADY是最可靠的支架之一，许多比率Raman探针都是基于BADY衍生物开发的（122,139?142）（图4d）。采用这种策略的领先探针是2018年报道的2-yne Mito N3（139），它可以在线粒体中积累。该探针通过检测叠氮化物还原为胺过程中的拉曼位移变化来检测H2S。Tomkinson及其同事专注于使用酚、胺、吡啶基或咪唑作为pH响应基团的pH敏感BADY衍生物（140）。这些衍生物显示出不同的pKa值（2–10）和pH依赖的炔烃峰位移（Δνalkyne = 3–18 cm–1）。单氟化酚衍生物的pKa约为8，被用作线粒体pH传感器（Mitokyne 1）（141），而双氟化酚衍生物的pKa约为6，其中酚基团被乙酰氧甲基（AM）结构保护（AM 4），用于检测酯酶活性（142）。胺取代的BADY衍生物包括针对γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的探针（GGT-S）和针对H2O2的探针（H2O2–S）（122）。有趣的是，氨基和羧酰胺的Δνalkyne位移（6 cm–1）小于酰胺和胺的位移（9 cm–1），但通过将末端封端的苯基替换为噻吩基，这一位移增加到了10 cm–1。通过同位素编辑进一步调整了频率，以实现与累积烯衍生物的同时成像。最近，Datta及其同事开发了基于单炔活性的炔烃标记Raman传感器（ABATaRs）（143），利用了推拉效应，并进行了多分析物检测；例如，H2O2和Cu离子（图4e）。在这种探针设计中，炔烃的末端同时连接了一个供电子的酚基团和一个吸电子的吡啶或对硝基苯基团，尽管基于单炔的结构，但仍获得了接近BADY衍生物的高RIE值（约25）。引入了甲酰基来调节酚羟基的pKa，并开发了针对H2O2和Cu离子的特异性探针。基于单炔的结构具有高水溶性和良好的细胞渗透性，开发的ABATaR探针在浓度仅为1–5 μM时即可用于细胞成像。

4. 拉曼活性染料
当分子吸收接近激发波长时，拉曼强度会显著增加，这种现象称为共振拉曼（RR）效应。当激发波长与分子吸收重合时，它被归类为严格电子共振（ER）；当激发波长接近分子吸收时，则称为电子预共振（EPR）共振。利用RR，生物分子如细胞色素C（8,40）、核碱基（鸟嘌呤或腺嘌呤）（144）和类胡萝卜素（94,145?148）可以用作固有的拉曼报告分子用于成像。由于EPR的信号增强因子约为10^4–5（149），RR对于敏感的拉曼探针设计非常有用。按时间顺序，基于偶氮苯的自发RR探针（151）是最早化学设计的RR探针之一，但最近开发了结合SRS显微镜和超多重EPR探针（EPR-SRS成像）的技术（152）。

4.1. 电子预共振（EPR）增强
Min及其同事在2017年使用EPR-SRS检测系统进行细胞成像，并在黄蒽结构中引入了三键作为拉曼标签，开发了MARS染料（152）。MARS染料是吡罗宁衍生物，在第九位有一个腈基团，通过替换第十个核心原子、腈基的同位素替换以及第三或第六位的环扩展，可以粗略或精细地调节腈基的振动频率（153,154）（图5a）。MARS染料的高灵敏度和多重性与组织透明化方法（RADIANT、拉曼染料成像和组织透明化）（155）以及ExM（156）结合使用。在这些带有腈基标签的黄蒽基拉曼探针中，市售的罗丹明800也可以用于细胞间环境检测，因为它可以利用振动溶剂色变效应（157,158）（图5a），被认为是展示各种成像技术概念验证的可靠选择，包括刺激拉曼激发荧光（SREF）（36,159）和键选择性荧光检测红外激发（BonFIRE）光谱显微镜（4,5,160）。EPR-SRS被认为提供了高度光稳定的成像，因为泵浦激光不会直接激发分子（149），但即使在EPR条件下也观察到了光漂白现象（161,162），这可能是由于多种多光子途径的存在，包括双光子吸收。

图5
图5. EPR探针。(a) 基于9CN-吡罗宁的MARS染料和市售的罗丹明800作为环境检测探针。(b) 酶活性和可见光激活的吸收依赖性拉曼信号。展示了使用9CN-JCP探针对活A549细胞中多种酶活性的同时成像的SRS图像。刻度尺：10 μm。部分改编自参考文献（163）。版权所有2020年美国化学学会。(c) 基于MARS染料的铜依赖性邻近标记。展示了使用多色CRP探针在固定野生型或突变型A549细胞中对不稳定铜池的SRS图像。刻度尺：25 μm。部分改编自参考文献（166）。版权所有2024年美国化学学会。(d) 基于花青素的宽带光谱识别。(e) 基于半花青素发色团的分子内环化策略。(f) 染料杂化的V形和酮型累积烯。缩写：MARS，曼哈顿拉曼散射；EPR，电子预共振；GGT，γ-谷氨酰转肽酶；β-Gal，β-半乳糖苷酶；Vis：可见光；CRP，铜拉曼探针；NIR，近红外。

4.2. 基于黄蒽的可激活拉曼探针
由于EPR在分子吸收接近激发波长时指数级增强拉曼强度，因此可以利用分子吸收的变化来调节拉曼信号（图5b）。我们利用9CN-吡罗宁的伯胺基团酰胺化引起的吸光度变化开发了可激活的拉曼探针。这些探针的EPR-SRS信号在氨基肽酶或糖苷酶水解后被激活，并且可以通过腈基的同位素替换同时检测多种酶活性（163）。此外，我们发现9CN-罗丹醇中的取代伯胺基团被酚羟基取代后，在生理条件下表现出高聚集性。开发的基于9CN-JCR的可激活探针由于酶反应后的细胞内聚集作用，比基于9CN-JCP的探针具有更好的细胞保留能力，并实现了果蝇幼虫组织的区域选择性体外成像（164）。黄蒽环的第十位也适用于激活，我们开发了在该位置含有碲（Te）原子的9CN-TeP衍生物。这些衍生物基于Te原子的光氧化表现出可见光触发的SRS激活（165）。此外，Chang及其同事开发了基于多色MARS的探针，利用铜配位实现不稳定铜的成像（166）（图5c）。

4.3. 具有各种化学结构的拉曼染料
像黄蒽染料一样，花青素染料也是多功能的生物成像探针，也适用于EPR成像（图5d）。一些花青素染料（例如Cy5.5、Alexa647）在EPR-SRS检测的指纹区域（1300至1700 cm–1）显示出振动特征的不同（152），Goda及其同事大大扩展了它们的光谱多样性（400至1600 cm–1）。他们的多色花青素衍生物，称为IR740系列，被封装在拉曼活性点（Rdots，见第5.1节）中，用于进行颜色可调节的多重傅里叶变换（FT）-CARS流式细胞术（167）。此外，我们报道了一种结合香豆素和花青素的杂化结构（CHC，香豆素-半花青素），用于CARS检测，表明分子内环化可用于信号调节（图5e）。各种4CN-CHC衍生物的化学结构经过修改后可以同时被检测（168）。分子内环化也被用于锌的检测；CSZin中的腈基振动在分子内环状螺吡喃形式下被抑制，但锌配位伴随转化为花青素形式后激活了腈基振动（138）（图5e）。这种染料可以可逆地检测细胞内的锌离子，利用腈基与双键强度比实现了稳健的SRS成像。最近，多炔异构体累积烯与染料结构结合，获得了V形和酮型近红外（NIR）累积烯。特别是酮型K2的RIE值超过1800，为超亮和超多重成像提供了潜力（169）（图5f）。

4.4. 使用自发拉曼显微镜的共振拉曼（RR）成像
尽管RR是一种增强固有弱拉曼散射的有前景的方法，但它受到强荧光背景的干扰，除非使用专门的拉曼显微镜设备（例如SRS或CARS）。因此，使用自发拉曼显微镜进行敏感的RR检测需要非荧光染料。2015年，Prasad及其同事表明非荧光偶氮苯染料Am-CN Azo-OH可以用作自发拉曼成像的敏感RR探针（151）（图6a）。随后，其他偶氮苯衍生物（例如BBQ650、DABCYL），通常用作荧光淬灭剂，也被开发为自发RR探针（170,171）（图6b）。

图6
图6. 自发拉曼显微镜的共振拉曼探针。(a) AERS探针和通过VCA方法的DAERI。展示了用Azo-细胞器探针对三染活HeLa细胞的自发拉曼图像。刻度尺：5 μm。部分改编自参考文献（173）。版权所有2022年美国化学学会。(b) 基于偶氮的淬灭剂探针。(c) 基于偶氮的比率pH传感器。(d) 基于分子转子的拉曼探针和FVR比率成像。展示了用Mito-、Lyso-或ER-Azo-Viscos探针染色的活Hela细胞的荧光、自发拉曼和FVR图像。刻度尺：5 μm。部分改编自参考文献（178）。版权所有2026年美国化学学会。缩写：AERS，偶氮增强拉曼散射；DAERI，动态偶氮增强拉曼成像；VCA，顶点成分分析；FVR，荧光与拉曼；ER，内质网。

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4.2. 基于黄蒽的可激活拉曼探针
由于EPR在分子吸收接近激发波长时指数级增强拉曼强度，因此可以利用分子吸收的变化来调节拉曼信号（图5b）。我们利用9CN-吡罗宁的伯胺基团酰胺化引起的吸光度变化开发了可激活的拉曼探针。这些探针的EPR-SRS信号在氨基肽酶或糖苷酶水解后被激活，并且可以通过腈基的同位素替换同时检测多种酶活性（163）。此外，我们发现9CN-罗丹醇中的取代伯胺基团被酚羟基取代后，在生理条件下表现出高聚集性。开发的基于9CN-JCR的可激活探针由于酶反应后的细胞内聚集作用，比基于9CN-JCP的探针具有更好的细胞保留能力，并实现了果蝇幼虫组织的区域选择性体外成像（164）。黄蒽环的第十位也适用于激活，我们开发了在该位置含有碲（Te）原子的9CN-TeP衍生物。这些衍生物基于Te原子的光氧化表现出可见光触发的SRS激活（165）。此外，Chang及其同事开发了基于铜配位的邻近标记的多色MARS探针（166）（图5c）。

4.3. 具有各种化学结构的拉曼染料
像黄蒽染料一样，花青素染料也是多功能的生物成像探针，也适用于EPR成像（图5d）。一些花青素染料（例如Cy5.5、Alexa647）在EPR-SRS检测的指纹区域（1300至1700 cm–1）显示出振动特征的不同（152），Goda及其同事大大扩展了它们的光谱多样性（400至1600 cm–1）。他们的多色花青素衍生物，称为IR740系列，被封装在拉曼活性点（Rdots，见第5.1节）中，用于进行颜色可调节的多重傅里叶变换（FT）-CARS流式细胞术（167）。此外，我们报道了一种结合香豆素和花青素的杂化结构（CHC，香豆素-半花青素），用于CARS检测，表明分子内环化可用于信号调节（图5e）。各种4CN-CHC衍生物的化学结构经过修改后可以同时被检测（168）。分子内环化也被用于锌的检测；CSZin中的腈基振动在分子内环状螺吡喃形式下被抑制，但锌配位伴随转化为花青素形式后激活了腈基振动（138）（图5e）。这种染料可以可逆地检测细胞内的锌离子，利用腈基与双键强度比实现了稳健的SRS成像。最近，多炔异构体累积烯与染料结构结合，获得了V形和酮型近红外（NIR）累积烯。特别是酮型K2的RIE值超过1800，为超亮和超多重成像提供了潜力（169）（图5f）。

4.4. 使用自发拉曼显微镜的共振拉曼（RR）成像
虽然RR是一种增强固有弱拉曼散射的有前景的方法，但它受到强荧光背景的干扰，除非使用专门的拉曼显微镜设备（例如SRS或CARS）。因此，使用自发拉曼显微镜进行敏感的RR检测需要非荧光染料。2015年，Prasad及其同事表明非荧光偶氮苯染料Am-CN Azo-OH可以用作自发拉曼成像的敏感RR探针（151）（图6a）。随后，其他偶氮苯衍生物（例如BBQ650、DABCYL），通常用作荧光淬灭剂，也被开发为自发RR探针（170,171）（图6b）。

图6
图6. 自发拉曼显微镜的共振拉曼探针。(a) 通过VCA方法的AERS探针和DAERI。展示了用Azo-细胞器探针对三染活HeLa细胞的自发拉曼图像。刻度尺：5 μm。部分改编自参考文献（173）。版权所有2022年美国化学学会。(b) 基于偶氮的淬灭剂探针。(c) 基于偶氮的比率pH传感器。(d) 基于分子转子的拉曼探针和FVR比率成像。展示了用Mito-、Lyso-或ER-Azo-Viscos探针染色的活Hela细胞的荧光、自发拉曼和FVR图像。刻度尺：5 μm。部分改编自参考文献（178）。版权所有2026年美国化学学会。缩写：AERS，偶氮增强拉曼散射；DAERI，动态偶氮增强拉曼成像；VCA，顶点成分分析；FVR，荧光与拉曼；ER，内质网。

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此外，通过引入各种化学结构（包括多炔骨架），开发了基于偶氮苯的偶氮增强拉曼散射（AERS）探针（172），这些敏感探针被用于进行动态偶氮增强拉曼成像（DAERI）（173）（图6a）。在DAERI中，可以通过线扫描自发拉曼显微镜在几秒钟内捕获宽波数范围内的分子信息，并通过顶点成分分析（VCA）进行分离。还开发了其他基于偶氮的pH传感拉曼探针（174,175）（图6c），偶氮苯可以被视为自发RR探针的标准结构。虽然偶氮苯染料的荧光通过顺反异构化非辐射衰减而被淬灭，但分子转子染料也由于扭曲的分子内电荷转移（TICT）而表现出荧光淬灭，并被用作自发RR探针（图6d）。我们开发了含有二苯甲烯结构的CN-HG衍生物（154），以扩展9CN-吡罗宁的振动窗口。此外，还开发了NF1064衍生物（176,177），用于NIR体内表面增强共振拉曼散射（SERRS）成像。最近，另一种分子转子RR探针的应用是：Azo-Viscos探针可以通过荧光与拉曼（FVR）强度比来监测粘度。这使得可以使用拉曼信号作为内部标准来校正粘度依赖性发射的浓度依赖性。这些探针被用于通过FVR成像评估细胞内微环境（178）（图6d）。

4.5. 光开关染料
二芳基乙烯（DAEs）是众所周知的光致变色染料，也适用于拉曼探针支架，已经报道了多种光开关拉曼探针。尽管DAEs在C═C区域（1300–1700 cm–1）的光开关过程中的拉曼光谱变化首次在2000年代被实验报道（179?182），但Ozeki及其同事在2021年将其用于活细胞SRS成像，使用了市售的CMTE（顺-1,2-二氰-1,5-二(2,4,5-三甲基-3-噻吩)乙烯）（183）（图7a），并且我们利用类似的策略实现了超分辨率拉曼成像（RESORT，可逆饱和光学拉曼转换），使用DAE620作为更亮的光开关拉曼探针（184）（图7b）。引入炔烃标签使振动频率可光开关，开放和闭合形式都可以通过沉默区域的拉曼信号进行监测（185）（图7c）。DTE-Ph也以类似RESORT的方式通过封装在纳米颗粒中用于超分辨率成像（186）。此外，Hu及其同事将DAE与Carbow结构结合，开发了高灵敏度和多重的光开关多炔，称为Carbow-switch（187）（图7d）。最近，报道了一种新的光开关拉曼支架——拉曼标记的腙（188）（图7e）。光开关式拉曼探针。(a) 通过市售的二芳基乙烯证明光开关式SRS信号的存在。(b) 使用开/关信号的RESORT成像。展示了用DAE620-Mito染色的活HeLa细胞的正常SRS和RESORT图像。刻度尺：5和1微米（插图）。部分改编自参考文献(184)。版权所有2023年美国科学促进会。(c) 依赖于光开关的炔烃振动位移。(d) 通过二芳基乙烯和Carbow的混合结构在静默区域获得强信号和多路复用信号。展示了用Mito和Lyso靶向Carbow开关染色的活U2OS细胞的多区域光开关SRS图像。刻度尺：20微米。部分改编自参考文献(187)。根据CC-BY-4.0许可使用。版权所有2024年Yuelin Yang等人。(e) 基于Hydrazone的光开关剂。缩写：SRS，受激拉曼散射；UV，紫外线；Vis，可见光；CMTE，顺式-1,2-二氰基-1,5-双(2,4,5-三甲基-3-噻吩)乙烯；RESORTs，可逆饱和光学拉曼跃迁。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片5. 受聚合物启发的拉曼颗粒尽管聚炔结构和RR探针是提高拉曼强度的有效方法，但它们仍然无法完全克服拉曼散射信号的固有弱点。另一种提高拉曼探针灵敏度的方法是构建受聚合物启发的拉曼颗粒。通常情况下，荧光发射在高探针浓度下会被抑制，但拉曼强度与浓度呈线性关系，而高度结构化的π共轭系统可以实现广泛的电子离域，从而增强拉曼散射。因此，将拉曼活性分子封装到具有高密度或结构化π共轭的纳米颗粒（NPs）中是一种有前景且独特的方法，可以实现超高灵敏度的成像。5.1. 局部浓度策略通过在聚合聚合物珠子时加入拉曼标记的单体，可以制备出拉曼标记的NPs。例如，通过引入拉曼标记的苯乙烯（189）或甲基丙烯酸酯（190）单体，开发出了拉曼活性聚合物点（图8a）。甲基丙烯酸酯拉曼珠子表面的羧基可以进一步修饰，已应用适配体或肽偶联的拉曼NPs进行肿瘤的体内成像。（190）图8图8. 局部浓度策略。(a) 基于拉曼活性单体的聚合物。(b) 通过膨胀和收缩方法生成的Rdots。(c) 带有PDA壳和SERRS报告器的三维VASERS。(d) 使用gGlu-BzBMN激活的聚集触发拉曼探针和利用聚集的成像。展示了用gGlu-BzBMN染色的活A549和H226细胞中的GGT活性的SRS图像。刻度尺：20微米。部分改编自参考文献(203)。版权所有2025年美国化学会。缩写：TAC，三氨基环丙烷；PS，聚苯乙烯；PSMA，聚(苯乙烯-马来酸酐)；THF，四氢呋喃；Rdots，拉曼点；PEG，聚乙二醇；MERdots，大环增强Rdots；ACQ，聚集引起的淬灭；VASERS，体积活性表面增强拉曼散射；PDA，多巴胺；SERRS，表面增强共振拉曼散射；NP，纳米颗粒；AIE，聚集诱导发射；SRS，受激拉曼散射；TPEF，双光子激发荧光；SABER，自组装生物正交酶识别；GSH，谷胱甘肽；GGT：γ-谷氨酰转肽酶；BzBMN，2-(2-(苯氧基)-4-(二乙氨基)苯亚甲基)马来腈。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片尽管聚合可以实现高浓度的拉曼活性分子，但它需要准备拉曼标记的单体，这限制了分子设计的灵活性。2021年，Min及其同事建立了一种使用市售聚苯乙烯（PS）NPs的膨胀和收缩方法来开发拉曼活性NPs的通用策略。（191）在这种方法中，PS NPs在四氢呋喃（THF）中膨胀，并与拉曼活性小分子（例如，Carbow探针）混合，这些小分子扩散到PS NP基质中。然后，加入过量的水，使NPs恢复到原来的大小，形成拉曼点（Rdots）。封装了Carbow探针的Rdots在SRS显微镜下显示出单颗粒灵敏度，并通过表面羧基将其与一级或二级抗体结合用于免疫染色（图8b）。虽然也可以在Rdots中包含拉曼活性染料（167,186），但需要注意，因为大多数有机染料在高密度积累时其光物理性质会发生显著变化。例如，封装了花青素染料的Rdots（167）（见第4.3节）在共封装了花青星大环以构建大环增强Rdots（MERdots）（192）时显示出增强的拉曼信号。（192）大环捕获了阳离子花青素的反离子，改善了花青素在NP基质中的分布，克服了聚集对吸收的影响，并产生了有效的共振增强（图8b）。相反，聚集引起的淬灭（ACQ）对于自发拉曼检测是有利的。例如，具有刚性和平面结构的truxene染料被封装在聚(苯乙烯-马来酸酐）（PSMA）聚合物中，并使用传统的532纳米激光进行高灵敏度RR成像（193）（图8b）。自2000年代末以来开发的基于金属基底的SERS NPs（194），可以说是基于NP的探针设计的先驱。构建SERS NPs的典型方法是在金属表面使用自组装单层（SAM）方法涂覆小分子拉曼报告器。（195?197）然而，这种方法限制了信号增强，因为SAM的亚纳米厚度通常远小于等离子体场的衰减长度（>10纳米）。为了改进这一点，提出了三维体积活性SERS（VASERS）技术。（198?200）在这种方法中，拉曼报告器被一层多巴胺（PDA）捕获，这是一种多功能自粘聚合物，SERS NPs被涂覆了几纳米厚的PDA壳（图8c）。与基于SAM的NPs相比，VASERS NPs的亮度提高了大约一个数量级。即使没有聚合物材料，也可以实现这种局部浓度策略。2017年，开发了一种结合了聚集诱导发射（AIE）衍生的双光子激发荧光（TPEF）探针和SRS探针的混合物AIE-SRS-Mito，作为线粒体报告器（201）（图8d）。通过利用SRS的线性浓度依赖性，量化了线粒体基质中聚集分子的局部浓度。这清楚地表明，利用分子聚集的方法对于拉曼成像是有前景的，包括我们团队在内的多个小组开发了具有聚集控制的酶激活拉曼探针。（164,202,203）NanoSABER（自组装生物正交酶识别）被设计为豆蛋白特异性探针。（202）它由三个域组成：一个作为细胞穿透序列的聚精氨酸域，一个作为豆蛋白识别序列的丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺（AAN）域，以及一个包含丙炔基甘氨酸和氰苯并噻唑的振动报告器域。经过酶切割反应和GSH还原后，振动报告器形成了炔烃二聚体，自组装成NPs（图8d）。我们还开发了9CN-rhodol作为基于聚集的拉曼探针。9CN-rhodol不仅由于吸收的浴色位移而显示出酶诱导的EPR-SRS信号激活，还具有聚集形成能力，并且能够在包含异质细胞类型的体外果蝇组织中可视化目标酶特异性区域（164）。此外，我们简化了这种探针设计，并开发了基于BzBMN（2-(2-(苯氧基)-4-(二乙氨基)苯亚甲基)马来腈）的拉曼探针。BzBMN探针包含一个与BzBMN-NH2连接的亲水酶底物部分，在检测限以下显示出扩散分布，而酶切割反应产生了BzBMN-NH2，其聚集形成了可以通过SRS显微镜检测到的局部高浓度（203）（图8d）。由于J-聚集被报道可以增加共振拉曼增强（204,205），因此适当设计聚集类型应该进一步改进基于聚集的拉曼探针。5.2. 构建大尺度电子离域系统另一种提高拉曼强度的方法是构建大尺度π共轭系统。例如，PPE（聚(苯乙烯乙炔)）衍生物的RIE（C≡C键标准化）值比相应的单体DPE（二苯乙炔）高约2.8倍，这是由于共轭的炔烃链（206）（图9a）。值得注意的是，PDDA（聚(十-4,6-二炔二酸)）是通过DDA（十-4,5-二炔二酸）单体的主客体拓扑化学聚合合成的，在488纳米激发时显示出巨大的RIE（C≡C键标准化）值2.3 × 10^4（207）。大尺度π共轭系统也有助于可见光吸收，由于共轭系统的扩展和EPR效应的协同增强，实现了显著的RIE。此外，通过13C掺杂，PDDA的拉曼位移实现了多路复用（208），并且已经证明PDDA对ROS（活性氧物种）的降解可以用于监测光动力免疫疗法（209）（图9b）。图9图9. 构建大尺度电子离域系统。(a) 基于PPE的共轭炔烃聚合物。(b) PDDA的拓扑化学聚合。(c) 避免脂质背景干扰的分子设计。(d) 基于COF（共价有机框架）的聚合物探针。(e) 基于BBT单体的SICTERS策略。展示了小鼠后肢血管的体内自发拉曼图像，这是通过静脉注射BBT NPs获得的。部分改编自参考文献(215)。根据CC-BY-4.0许可使用。版权所有2024年Shuai Gao等人。缩写：DPE，二苯乙炔；PPE，聚(苯乙烯乙炔)；RIE，相对拉曼强度与EdU；DDA，十-4,5-二炔二酸；PDDA，聚(十-4,6-二炔二酸)；ROS，活性氧物种；P3HT，聚(3-己基噻吩)；PCPDT，聚环[2,1-b;3,4-b’]二噻吩；DSPE-PEG，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇)-2000]；NP：纳米颗粒；COF，共价有机框架；TAPA，(三(4-氨基苯基)-胺；BDDA，4,4’-(丁-1,3-二炔-1,4-二基)二苯胺；TP，1,3,5-三甲酰氟苯酚；SICTERS，堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射；BBT，4,7-双(4-(2-乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2,5]噻唑；D，供体；A，受体。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片这样的π共轭聚合物也可以在没有拉曼标签的静默区域制备（210,211），但为了生物应用，需要微调拉曼位移。实际上，基于噻吩的共轭聚合物聚(3-己基噻吩)（P3HT）由于噻吩单元中的C═C键而在1446厘米^-1处显示出强烈的拉曼信号。然而，它受到组织中脂质信号（1440厘米^-1）的干扰。通过分子平面化克服了这个问题；聚环[2,1-b;3,4-b’]二噻吩（PCPDT）在1386厘米^-1处显示出红移的拉曼峰，这是由于电子离域增强。然后，PCPDT被涂覆了1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇)-2000]（DSPE-PEG），生成了用于小鼠结肠肿瘤或淋巴结术中拉曼成像的PCPDT NPs（212）（图9c）。近年来，开发了共价有机框架（COF）方法来构建大尺度π共轭系统（213,214）（图9d）。COF的一个优点是将吸收扩展到NIR区域。COF构建的偶氮苯（Azo）和TAPA（三(4-氨基苯基)-胺）在785纳米激发下显示出理想的吸收特性（213）。就π共轭扩展而言，从BDDA和TP（1,3,5-三甲酰氟苯酚）合成的BDDA（4,4’-(丁-1,3-二炔-1,4-二基)二苯胺）COF在638纳米激发时显示出极高的RIE（C≡C键标准化）值1.67 × 10^5（214）。这种超高灵敏度被认为是由于COF的层间π–π堆叠结构导致的层间电子离域。BDDA COF进一步通过涂覆PDA层（BDDA COFs@PDA NPs）进行了改进，并用于骨骨折的体内拉曼成像。大电子离域系统也可以通过小分子的自堆叠来构建，而无需共价聚合。Xiao及其同事在2024年报告了堆叠诱导电荷转移增强拉曼散射（SICTERS）（214）。BBT（4,7-双(2-乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2,5]噻唑）单体具有供体-受体-供体（D–A–D）结构，形成了自堆叠的聚集体，发出了强烈的拉曼信号。在这种分子设计中，基于D–A–D的平面构型形成了一个巨大的电子离域系统，该系统在平面内和平面外方向上都进行了扩展，这种三维电荷转移有助于拉曼散射的增强。BBT NPs，其中BBT被两亲性PEG链封装，与类似粒度的SERS相比，显示出超过一千倍的增强（215）。虽然使用NPs的SERS引发了关于基底生物安全性的潜在担忧，但无基底的SICTERS可以被代谢，可能更适合体内应用；实际上，可以非侵入性地可视化小鼠血管（图9e）。最近，通过修改小分子（216）和NP表面，进一步开发了SICTERS NPs（217）。用硒和氮替换苯并噻唑中的两个硫原子，并引入了电子供体分子转子部分，提供了优越的光热效应用于肿瘤治疗（216）。关于表面修饰，构建了用于肿瘤靶向成像和光热消融的口服可递送的适配体涂层BBT NPs（217）。6. 结论与展望在这篇综述中，我们主要关注了近年来化学设计的拉曼探针在生物成像方面的显著进展。代表性拉曼探针的性质，包括分子大小、亮度、波数和应用，在表1中进行了总结。表1. 化学设计拉曼探针的性质和应用总结探针设计相关图示典型大小共振拉曼亮度（RIE）检测区域典型拉曼位移[厘米^-1]代表性应用氘（脂肪族）2MW：2关闭<0.02 (/C–D)静默2100–2200（宽）代谢标记炔烃标签（末端）3MW：25关闭0.11–0.27cs静默2084–2113cc无点击成像0.49–2.7d 2091–2107d BADY3, 4MW：200–270关闭27es静默2219eratiometric传感Het-DY 10–30f 2209–2243f ABATaRs 6.2–22.1g 2199–2221g Carbow（聚炔）3MW：230–310关闭30–380hs静默2037–2226细胞器染色光学条形码MARS染料（9CN-pyronin）5MW：340–490开75–940js静默2141–2241j细胞器染色免疫染色激活成像AERS染料6MW：180–770开3.77–2.81 × 10^4jf指纹1097–1563k自发共振拉曼成像DAE6207MW：426开9.78lfingerprint1503, 1557ls超分辨率成像Carbow-switch7MW：510–620开7.7–489ms静默2011–2219m细胞器染色Rdots（聚炔）8直径：23 [纳米]hoff3.1 × 10^4–8.1 × 10^4hs静默2093–2220h免疫染色PDDA NPs8Mn：2.4 × 10^4非2.3 × 10^4ns静默2040–2122o细胞器染色8.6 × 10^6 (/颗粒)o 光学条形码BTT NPs（SICTERS）9直径：69.1 [纳米]开1012–13 (/颗粒)pfingerprint894体内成像aMW = 分子量。b确切的RIE值没有明确定义，但是根据参考文献(109)中提供的值和乙腈-d3的光谱估算的。c引用自参考文献(109)。末端炔烃带有烷基封端。引自参考文献（109）。末端炔烃带有芳基封端。引自参考文献（109）。BADY的数值已显示。引自参考文献（121）。Het-DY的数值已显示。引自参考文献（143）。骨架化合物的数值已显示。引自参考文献（191）。苯基封端的聚炔（2-炔至5-炔）的数值已显示。引自参考文献（120）。苯基封端的聚炔（2-炔至5-炔）的数值已显示。引自参考文献（153）。引自参考文献（172）。指纹区域的数值已显示。引自参考文献（184）。引自参考文献（187）。封闭形式的数值已显示。引自参考文献（207）。数均分子量（Mn）和C≡C标准化RIE值已显示。引自参考文献（208）。沉默区域的数值已显示。引自参考文献（215）。虽然未明确给出确切的RIE值，但根据提供的拉曼截面进行了估算。小型生物正交拉曼标签（如C–D键或三键）相比传统的笨重荧光标签具有较小的干扰优势，但由于灵敏度较低，可靶向的分子严格限于那些能够高浓度积累的分子。二炔或多炔结构显示出更高的灵敏度，但在分子刚性和亮度之间存在权衡；因此，选择合适的标签时需要考虑可实现的分子浓度和标签大小。在这方面，BADY具有相当好的灵敏度和多功能性（相对容易引入取代基并调节振动频率），因此基于BADY骨架报道了许多功能性探针。然而，BADY具有刚性且亲脂性，因此需要进一步研究以改善其物理化学性质（如cLog P，118,119），以扩展其生物应用。拉曼活性染料具有吸引人的灵敏度，并且可以使用与荧光探针相似的策略进行设计，例如吸收位移或邻近标记。一个关键优势是潜在的超多重性。然而，大多数报道的拉曼活性染料也具有荧光性，因此只能通过SRS或CARS显微镜检测到。开发非荧光的RR探针，以便用于自发拉曼显微镜，将是拉曼成像更广泛应用的重要进展。受聚合物启发的拉曼颗粒通过局部高浓度拉曼活性化合物或大的π共轭系统实现电子离域，这是一种利用拉曼信号与浓度线性关系的独特策略（无淬灭）。然而，它们的应用在某种程度上受到尺寸的限制，基本上超过几十纳米，这一限制可能难以克服。如上所述，已经报道了许多具有多色振动成像潜力的吸引人的拉曼探针。然而，由于更亮的探针往往具有更大的分子尺寸，同时实现高RIE值和小分子尺寸仍然是基于化学设计的最关键挑战之一。另一个问题是拉曼显微镜的可用性相对有限，专门的拉曼显微镜技术（如CARS和SRS显微镜）更是难以获得。因此，改善仪器访问性和开发改进的拉曼探针对于拉曼成像技术在生物学研究领域的广泛应用至关重要。此外，进一步开发引人注目的生物应用（如同时体内检测多种分析物）将吸引更多研究人员采用拉曼探针进行振动成像。在这篇综述中，我们主要关注成像，但也有许多基于拉曼散射的生物分析方法的报道，包括使用液相色谱（LC-Raman）（218）、拉曼板读取器（219）以及采用CRS的流式细胞术（220-222）或自发拉曼（223）。其他应用包括借助拉曼探针的高通量筛选，例如炔烃标记拉曼筛选（ATRaS）（224）、微腔数字SERS生物分析（225）、单细胞多参数分析（226）以及基于拉曼探针解码的单珠单化合物（OBOC）组合库筛选（227）。这些多路复用和高通量技术利用了拉曼技术提取丰富分子信息的独特能力，这些领域的发展有望扩展振动成像的前沿。因此，仍有许多途径可以进一步研究以改进拉曼探针的多样性和应用范围。这是一个可以期待许多新发展的领域。