膀胱癌中琥珀酰化相关基因的鉴定：整合单细胞与转录组学数据

《Frontiers in Immunology》：Identification of succinylation-related genes in bladder cancer: integration of single-cell and transcriptomic data

　　

背景：膀胱癌（BLCA）预后较差，亟需可靠的预后基因。尽管琥珀酰化与肿瘤进展相关，但其在BLCA中的作用仍未得到充分研究。本研究旨在鉴定并验证BLCA中与预后相关的琥珀酰化相关基因（SRGs），并阐明它们对肿瘤微环境（TME）的影响。 方法：研究人员首先通过对15对BLCA和癌旁正常组织（苏州大学附属第四医院-BLCA队列）进行转录组测序初步鉴定SRGs，并通过整合来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合（GEO）数据库的单细胞与批量转录组数据进一步筛选。利用LASSO（最小绝对收缩和选择算子）和多变量Cox回归构建预后风险模型，并结合临床因素构建列线图。通过功能富集、免疫特征分析、体细胞突变和药物敏感性分析获得机制性见解。Scissor算法将批量转录组风险特征映射到单细胞分辨率，从而识别高风险细胞亚群。拟时序分析和细胞间通讯分析描绘了核心基因的动态表达模式。最后，通过体外RT-qPCR（实时定量聚合酶链式反应）和CCK-8（细胞计数试剂盒-8）增殖实验验证了核心基因的表达谱和功能作用。 结果：研究人员鉴定出KCTD16、CD3D和GSDMB为预后基因。基于这些基因计算的风险评分，结合年龄和N分期，被纳入一个风险模型，该模型显示出稳健的预测准确性（AUC > 0.7）。这些基因在非肌层浸润性（NMIBC）和肌层浸润性（MIBC）亚型之间的表达存在显著差异。高风险组显示出增强的免疫逃逸（更高的TIDE评分，p < 0.001），而肿瘤微环境似乎处于一种“炎症但功能失调”的状态。单细胞分析表明上皮细胞是关键亚群，T细胞和成纤维细胞也参与其中。Scissor+细胞与高风险表型相关，并表现出依赖于拟时序的表达模式。RT-qPCR显示GSDMB在BLCA中显著上调，而KCTD16和CD3D显著下调（p < 0.05）。在功能上，敲低GSDMB和KCTD16显著促进了T24细胞的增殖，支持了它们的肿瘤抑制功能。 结论：这个琥珀酰化相关的预后模型能够准确预测BLCA的结局，揭示了与免疫逃逸和肿瘤微环境的联系，并突出了上皮细胞的关键作用，为个体化治疗提供了潜在靶点。

论文解读：膀胱癌琥珀酰化相关预后基因的系统鉴定与功能解析

一、 研究背景、问题与目的

膀胱癌（Bladder Cancer, BLCA）是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，起源于膀胱上皮组织。其疾病负担在男性中显著高于女性，预后不佳。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者复发和进展率高，而肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者的5年总生存（OS）率即使在根治性手术后也低于50%，一旦发生转移，生存率急剧下降。这些现状凸显了识别与患者生存相关的预后生物标志物，以指导个体化治疗、改善临床结局的迫切需求。

在肿瘤发生的各种分子机制中，赖氨酸琥珀酰化近年来备受关注。琥珀酰化是一种广泛存在于原核和真核生物中的保守的翻译后修饰，可调节氧化代谢、细胞信号传导和转录调控等一系列生物过程。肿瘤相关酶和代谢途径可影响染色质和组蛋白的琥珀酰化，从而改变基因转录并调节肿瘤相关基因的表达。因此，探索琥珀酰化在BLCA发生、进展和预后中的作用具有重要的理论基础。然而，尽管有证据表明调节染色质和组蛋白琥珀酰化可能有助于维持NMIBC的恶性表型，但琥珀酰化在BLCA中的作用总体上研究不足，缺乏将其与BLCA临床和生物学特征联系起来的研究，其在膀胱肿瘤发生中的确切生物学功能在很大程度上仍属未知。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为在细胞水平剖析肿瘤生物学提供了前所未有的分辨率。与批量转录组学方法不同，scRNA-seq可以阐明细胞异质性，并揭示特定细胞类型在疾病进展中的功能贡献。在BLCA中，现有研究主要集中在肌层浸润亚型，而在单细胞水平上琥珀酰化的景观在很大程度上尚未被探索。因此，整合大规模转录组数据集与scRNA-seq，可能为揭示琥珀酰化在BLCA中的预后和功能意义提供一种有效策略。

基于以上背景，本研究旨在通过结合批量转录组数据集和单细胞RNA测序分析，系统鉴定BLCA中与琥珀酰化相关的预后基因，评估这些基因的预后价值，表征它们与肿瘤免疫微环境的关系，并在单细胞水平上绘制其细胞分布图。相关研究成果发表在《Frontiers in Immunology》期刊上。

二、 主要关键技术方法

本研究主要采用了以下关键生物信息学与实验技术方法：

1. 1.
   多队列数据整合分析：研究整合了多个公共数据库和内部队列的数据。包括来自TCGA的416个BLCA样本的RNA-seq数据和临床信息（TCGA-BLCA队列，用作主要训练集），来自GEO的验证集（GSE13507），以及用于单细胞分析的scRNA-seq数据（GSE135337）。此外，还使用了来自苏州大学附属第四医院的15对BLCA与癌旁正常组织的转录组测序数据（Soochow-BLCA队列，用作补充训练集进行差异基因筛选）。
2. 2.
   生物信息学建模与筛选流程：通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算琥珀酰化相关基因（SRG）活性评分并对患者分层。通过差异表达分析、韦恩分析筛选候选基因。利用单变量Cox回归、LASSO回归以及多变量Cox回归结合逐步回归法，从候选基因中筛选出独立的预后基因，并构建风险评分模型。通过Kaplan-Meier生存分析、时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线评估模型性能。利用基因集富集分析（GSEA）、ESTIMATE算法、肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）评分、体细胞突变谱分析（maftools）和基于GDSC数据库的药物敏感性预测（pRRophetic包）来探索分子机制、免疫微环境、基因组特征和治疗意义。
3. 3.
   单细胞转录组学整合分析：对GSE135337数据集进行质控、标准化、降维（PCA、UMAP）和细胞聚类（Seurat包）与注释（SingleR包、经典标记基因）。利用Scissor算法整合批量转录组风险表型与单细胞数据，识别与高风险/低风险表型相关的细胞亚群（Scissor⁺/Scissor^-细胞）。使用CellChat包进行细胞间通讯分析，使用Monocle包进行拟时序分析以描绘上皮细胞的发育轨迹和基因动态表达。
4. 4.
   体外实验验证：收集额外的BLCA和癌旁正常组织样本，通过RT-qPCR验证核心预后基因（KCTD16, CD3D, GSDMB）的表达。在T24膀胱癌细胞系中，利用小干扰RNA（siRNA）敲低GSDMB和KCTD16的表达，并通过CCK-8实验检测细胞增殖能力的变化。

三、 研究结果

3.1 差异表达与候选基因筛选

在Soochow-BLCA队列中，BLCA组织与正常对照之间共鉴定出3,769个差异表达基因（DEGs）。通过对TCGA-BLCA样本进行ssGSEA评分分层，发现高评分组与低评分组之间存在显著的生存差异。进一步对高低评分组进行差异分析，获得SRG相关DEGs。韦恩分析揭示了791个位于SRGs与DEGs重叠区域的候选基因。对这些基因进行功能富集分析，发现它们显著富集于免疫反应、细胞外基质组织、钾离子跨膜转运等功能以及病毒蛋白-细胞因子受体相互作用、钙信号通路等通路。蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析显示候选基因（如PXDN, IL1B）具有较高的连接度。

3.2 预后风险模型的构建与验证

通过对791个候选基因进行单变量Cox回归分析，初步筛选出63个与总生存期显著相关的基因。随后通过LASSO回归降维得到24个候选预后基因，再经多变量Cox回归和逐步选择，最终确定三个独立的预后基因：KCTD16、GSDMB和CD3D。基于这三个基因的表达水平和回归系数构建风险评分公式，并将TCGA-BLCA患者分为高风险组（HRG）和低风险组（LRG）。Kaplan-Meier分析显示高风险组生存结局显著更差，时间依赖性ROC曲线在1、2、3年的曲线下面积（AUC）均超过0.7，表明模型具有良好的预测准确性。该模型在独立验证集GSE13507中得到了成功验证。此外，对20个已知SRGs的预后分析发现，SIRT6、SIRT7的高表达预示更好预后，而OXCT1、SUCLA2的高表达预示更差预后。

3.3 临床相关性、列线图构建与分子机制探索

风险评分与临床分期、T分期、N分期、M分期显著相关。在单细胞数据集中，比较NMIBC和MIBC组织，发现KCTD16和CD3D在NMIBC中表达更高，而GSDMB在MIBC中显著升高。结合年龄、N分期和风险评分构建的列线图，能够有效预测患者1、2、3年的生存概率，校准曲线和ROC分析证实了其良好的预测性能。GSEA分析表明，KCTD16和CD3D共富集于移植物抗宿主病（GVHD）和抗原加工与呈递通路，GSDMB和CD3D共富集于造血细胞谱系通路。相关性分析显示GSDMB与多个SRGs（如SIRT7正相关，OXCT1负相关）存在显著表达相关性，而KCTD16和CD3D与这些SRGs无显著相关。

3.4 肿瘤微环境、基因组特征与治疗意义

高风险组显示出显著更高的免疫评分，但同时其TIDE评分也显著更高，提示其肿瘤微环境处于一种“高炎症但功能失调”的状态，可能与免疫逃逸增强和对免疫检查点抑制剂反应不佳相关。体细胞突变分析显示，高风险组TP53突变更常见，而低风险组KDM6A改变更富集。肿瘤突变负荷（TMB）在风险组间有差异，但与风险评分无直接相关性。药物敏感性分析发现，高风险组对PLK1抑制剂BI-2536更敏感，而低风险组对顺铂、紫杉醇等常规化疗药物更敏感。

3.5 单细胞水平解析

对GSE135337数据集的单细胞分析鉴定出T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等主要细胞类型。KCTD16和GSDMB在上皮细胞中表达差异最显著，上皮细胞被确定为核心细胞。Scissor算法整合分析显示，与高风险表型相关的Scissor⁺细胞和与低风险表型相关的Scissor^-细胞主要分布在上皮细胞群中。细胞通讯分析发现，在BLCA组中，上皮细胞与其他细胞群体（如成纤维细胞、T细胞）之间的通讯信号发生了变化。对上皮细胞进行拟时序分析，揭示了KCTD16和GSDMB沿细胞分化轨迹的动态表达模式：KCTD16在终末分化阶段表达升高，而GSDMB则逐渐下调。

3.6 实验验证

RT-qPCR实验证实，与癌旁正常组织相比，BLCA组织中GSDMB表达显著上调，而KCTD16和CD3D表达显著下调。在T24细胞中敲低GSDMB或KCTD16，均能显著促进细胞增殖，这支持了它们在BLCA中发挥肿瘤抑制基因作用的结论。

四、 讨论总结

讨论部分对三个核心基因的功能、模型的意义及研究的局限性进行了深入阐述。KCTD16在不同癌症中作用复杂，本研究中其下调提示在BLCA中可能起抑癌作用。CD3D作为T细胞受体复合物的关键组分，其下调与高风险患者T细胞浸润减少相关，可能损害抗肿瘤免疫，可作为评估免疫状态和预测免疫治疗反应的生物标志物。GSDMB的上调与促进肿瘤作用相关，但其在风险模型中相对低表达及敲低后促进增殖的“矛盾”现象，可能与不同剪接变体的功能异质性有关，即促肿瘤的非焦亡异构体可能占主导。功能富集分析将核心基因与免疫识别、抗原呈递、造血通路联系起来，提示琥珀酰化可能通过协调代谢重编程、表观遗传重塑和免疫调节来影响BLCA进展。高风险组呈现出“炎症但功能失调”的免疫微环境、更高的TP53突变率及对特定靶向药（如BI-2536）的敏感性，为风险分层指导个体化治疗（高风险患者靶向治疗，低风险患者化疗免疫联合）提供了新视角。单细胞分析明确了上皮细胞是琥珀酰化相关信号的关键细胞载体，并揭示了其内部存在与预后风险相关的功能异质性亚群（Scissor⁺/Scissor^-）以及异常的细胞间通讯。

研究人员也指出了本研究的局限性，包括：基于转录组数据未能直接检测蛋白质琥珀酰化水平；需更多体内外实验验证基因功能；不同队列的分析策略存在差异，影响结果可比性；拟时序分析的根细胞选择缺乏生物学验证；以及需要大规模、多中心前瞻性队列验证临床效用。未来研究方向包括多组学整合、核心基因机制探索、提高拟时序分析可靠性、扩大内部队列验证和细化上皮亚群分类。

五、 研究结论

本研究建立了一个全面的生物信息学框架来鉴定BLCA中的琥珀酰化相关预后基因，并基于三个核心基因——KCTD16、CD3D和GSDMB——开发了一个稳健的预后特征。该风险模型在独立队列中表现出一致的预测准确性，并且与免疫微环境改变、突变谱和差异药物敏感性显著相关。功能研究揭示了这些基因参与免疫和造血通路，而单细胞RNA测序则强调上皮细胞是关键参与者，表现出改变的细胞间通讯和拟时序表达动态。实验验证进一步证实了这些基因在BLCA组织中的失调。本研究的结果为理解琥珀酰化在BLCA发病机制和进展中的作用提供了新的见解，为预后预测和定制治疗策略提供了一个潜在的生物标志物系统。