无需基因组的基因编辑：在腹足类软体动物Crepidula fornicata中生成F0代CRISPR突变体

《EvoDevo》：Gene editing without a genome: generation of F0 CRISPR mutants in gastropod mollusc Crepidula fornicata

　　

摘要

背景

CRISPR-Cas9基因编辑是一种研究基因功能的强大工具，但迄今为止主要应用于传统的模式生物。由于螺旋动物基因组学存在特定挑战，如基因组大小、复杂性、重复区域比例高以及个体间基因组变异较大，CRISPR-Cas9在螺旋动物模型中的应用一直受到限制。在螺旋动物门中，软体动物是一个具有显著多样性的门类，拥有许多独特的基因家族扩展和新特征，然而使用CRISPR-Cas9来揭示这一类群中基因功能的应用仍然相对较少。

结果

我们利用从头转录组数据，在腹足类软体动物中生成了基因敲除（KO）的F0代CRISPR-Cas9突变体，并设计了单导向RNA和基因分型引物。由于没有组装好的基因组，我们通过与近缘物种的比对来确定假定的内含子-外显子边界，并成功地将基因编辑目标定位于含有配对结构域的基因的特定外显子上。F0代 KO突变体表现出眼睛缺失的表型。通过Sanger测序和CRISPR编辑推断（ICE）分析，从基因型上验证了CRISPR-Cas9基因编辑的成功。

结论

本研究中的突变体表明，的配对结构域对于腹足类动物的眼睛形成是必需的，这为动物眼睛发育的进化提供了新的见解。基因在各种后生动物中高度保守，是眼睛发育所必需的，包括蜗牛。在没有组装基因组的情况下，在软体动物中生成具有明确表型的F0代CRISPR-Cas9 KO突变体，提高了CRISPR技术在非传统新兴模型系统中的功能基因组学应用潜力。