《Molecular Diversity》：Unraveling the molecular landscape and therapeutic strategies for acute kidney injury: insights from transcriptomics, network pharmacology, virtual screening, and in vitro experiments
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急性肾损伤（Acute kidney injury, AKI）是一种以肾功能迅速下降、高发病率与死亡率为特征的临床综合征，目前缺乏有效的早期诊断标志物或靶向治疗。为应对这一关键未满足的需求，研究人员采用了一种整合多组学与网络药理学的方法，系统地研究了AKI的分
急性肾损伤（Acute kidney injury, AKI）是一种以肾功能迅速下降、高发病率与死亡率为特征的临床综合征，目前缺乏有效的早期诊断标志物或靶向治疗。为应对这一关键未满足的需求，研究人员采用了一种整合多组学与网络药理学的方法，系统地研究了AKI的分子机制和潜在治疗靶点。核心靶点通过差异基因表达（Differentially expressed genes, DEG）分析结合加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）进行识别，随后通过蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction, PPI）网络和通路富集分析进行探索。炎症、氧化应激和能量代谢是参与AKI发病机制的关键通路。通过使用十种CytoHubba算法和MCODE模块进行综合筛选，研究人员确定了三个枢纽基因——ACO2、FBP1和PFKL。利用AKI肾组织的单细胞RNA测序数据，进一步表征了它们的表达模式和细胞特异性。此外，研究人员构建了一个miRNA-枢纽基因调控网络，为基于miRNA的治疗策略提供了见解。分子对接分析确定了三种已获批药物——Ajmaline、Cimetidine和Tretinoin——对枢纽蛋白具有强结合亲和力，提示了它们在AKI治疗中药物重定位的潜力。最后，通过查阅小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics, MGI）数据库的基因敲除小鼠模型并进行体外细胞实验，研究人员探索了这些核心靶点的体内外作用，为其生理相关性提供了实验证据。总之，本研究整合了跨队列转录组学分析、基于网络的枢纽基因优先级排序、单核细胞类型定位、转化性药物重定位分析和体外实验验证，从而为AKI候选生物标志物的优先级排序提供了一个多层次框架。
研究背景与问题
急性肾损伤（AKI）是一种常见的危重临床综合征，以肾功能急剧下降、高发病率和死亡率为特征，是住院患者的重要并发症，并与心血管事件、慢性肾病（Chronic kidney disease, CKD）和终末期肾病等不良预后密切相关。目前临床管理主要依赖支持性治疗，如维持液体平衡，或在必要时对危重患者启动肾脏替代治疗。然而，这些干预措施主要针对症状，未能解决疾病的根本分子机制。由于AKI的发病机制涉及代谢失调、氧化损伤、炎症信号和细胞死亡等多个生物学过程的复杂交互，且存在高度个体异质性，开发普遍有效的治疗策略面临巨大挑战。尽管已有多种候选药物进入临床试验，但大多疗效有限或安全性不佳，尚未能转化为标准临床实践。因此，深入理解AKI的分子复杂性，系统性地发掘其关键驱动分子和潜在治疗靶点，对于开发精确有效的治疗策略至关重要。在此背景下，研究人员应用整合转录组学和网络药理学的系统生物学方法，旨在解析AKI的分子图谱并确定核心治疗靶点。该研究发表于《Molecular Diversity》期刊。
关键技术与方法
研究人员整合了来自基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库的三个独立人类AKI转录组数据集（GSE1563、GSE30718、GSE61739），共包含83名AKI患者和68名对照。通过一系列生物信息学与计算分析方法展开研究。主要技术方法包括：首先，对转录组数据进行预处理、批次校正和归一化，并识别AKI相关差异表达基因（DEGs）。接着，利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与AKI相关的共表达基因模块。随后，研究人员将筛选出的核心基因模块与差异表达基因取交集，并通过STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。核心枢纽基因的确定综合运用了CytoHubba插件的十种拓扑中心性算法以及MCODE聚类模块分析。此外，研究利用了已发表的单核RNA测序（snRNA-seq）数据，在单细胞水平验证枢纽基因的表达与细胞类型定位。通过miRDB数据库预测了调控枢纽基因的微小RNA（miRNA），并构建了miRNA-靶基因调控网络。通过查询DrugBank和DSigDB数据库进行了药物可用性筛选，并利用AutoDock软件进行了分子对接分析，评估候选药物与靶蛋白的结合亲和力。研究人员还查阅了小鼠基因组信息学（MGI）数据库中的基因敲除（Knock-out, KO）小鼠模型表型信息，并整合了来自GEO数据库的三种AKI小鼠模型（顺铂诱导、缺血再灌注、脓毒症诱导）的转录组数据进行交叉验证。最后，在顺铂诱导的AKI体外细胞模型中，通过细胞活力、活性氧（ROS）检测、qRT-PCR、蛋白质印迹（Western blot）等技术，对枢纽基因的表达变化和候选靶点（FBP1）的抑制剂干预效果进行了功能验证。
研究结果
差异基因识别与功能富集分析
通过对三个数据集的分析，研究人员鉴定出250个AKI相关差异表达基因，其中129个上调，121个下调。功能富集分析表明，这些差异基因在细胞粘附、T细胞活化、肌肉收缩等生物学过程，以及碳代谢、MAPK信号通路、胰岛素信号通路等关键通路中显著富集，揭示了AKI与炎症及代谢调控网络的强关联。
急性肾损伤背景下加权基因共表达网络的构建
WGCNA分析识别出10个基因共表达模块，其中turquoise模块与AKI相关性最强。该模块包含364个基因，被选为后续分析的关键模块。
AKI过程中核心靶点的相互作用与生物学功能
将turquoise模块基因与差异表达基因取交集，确定了46个AKI核心靶点。对这些核心靶点构建的PPI网络分析揭示了它们之间的紧密相互作用。进一步的GO和KEGG富集分析表明，这些核心靶点主要参与小分子分解代谢、能量代谢、羧酸分解、电子传递活性、氧化还原酶活性等，并富集于线粒体基质、氧化还原酶复合体等细胞组分。通路分析则集中在色氨酸代谢、糖酵解/糖异生、脂肪酸降解等代谢通路，强调了代谢失调在AKI中的核心作用。
鉴定iACO2/i、iFBP1/i和iPFKL/i为AKI的枢纽基因
研究人员对46个核心靶点进行网络拓扑分析。通过综合应用十种CytoHubba算法进行枢纽基因排序，并结合MCODE算法识别稠密连接子网络，最终确定三个高置信度枢纽基因：ACO2、FBP1和PFKL。这三个基因在多种算法中均位列前茅，且同属于得分最高的MCODE模块，表明它们是AKI相关PPI网络中具有核心作用的功能节点，与代谢通路和线粒体过程密切相关。
单核转录组验证与细胞类型特异性表达
利用已发表的单核RNA测序数据，研究人员分析了枢纽基因在AKI与正常肾组织不同细胞类型中的表达。分析确定了10种主要的肾细胞类型，如免疫细胞、内皮细胞、近端小管细胞等。结果显示，枢纽基因的表达表现出明显的细胞类型特异性。例如，在AKI组织中，ACO2在免疫细胞中上调，而在集合管闰细胞中下调；FBP1主要在近端小管细胞中富集；PFKL则在髓袢升支粗段细胞中富集。这为理解枢纽基因在特定肾细胞类型中的功能提供了空间定位信息。
miRNA-枢纽基因网络构建
通过miRDB数据库预测，研究人员构建了针对枢纽基因及其他部分核心靶点的miRNA调控网络。该网络揭示了复杂的转录后调控机制，例如hsa-miR-3658可同时靶向ACO2和ALDOB，hsa-miR-4720-3p可调控ACO2和ACAT1，表明存在可协调调控多个疾病相关通路的上游miRNA。
药物可用性与分子对接
通过数据库筛选，研究人员确定了8种可能靶向ACO2、FBP1和PFKL的潜在药物。分子对接分析显示，阿义马林、西咪替丁、维A酸等几种已批准药物与相应靶蛋白（如阿义马林-ACO2、西咪替丁-FBP1、维A酸-FBP1）具有强结合亲和力，结合能均低于-5 kcal/mol，提示了这些药物在AKI治疗中药物重定位的潜力。
核心靶点的基因敲除小鼠模型回顾
研究人员查阅了MGI数据库中与核心靶点相关的基因敲除小鼠模型表型数据。结果显示，针对枢纽基因及其他部分核心靶点的敲除模型，表现出与肾功能损伤、炎症反应、代谢异常和免疫失调相关的表型，为这些靶点在AKI相关通路中的生物学相关性提供了支持性证据。
其他AKI小鼠模型与人类AKI数据的比较
研究人员纳入了顺铂诱导、缺血再灌注、脓毒症诱导三种小鼠AKI模型的基因表达数据，并与人类AKI转录组数据进行比较。相关热图分析显示，顺铂诱导的AKI模型在基因表达谱上与人类AKI的相似度最高（在16个关键基因中验证了12个，占75%），而缺血再灌注模型和脓毒症模型的相似度较低。这表明顺铂诱导模型在模拟人类AKI代谢特征方面可能具有更高的价值。
体外验证枢纽基因在BUMPT细胞中的表达
在顺铂诱导的小鼠近端肾小管上皮细胞（BUMPT）AKI模型中进行qRT-PCR验证，结果证实了生物信息学分析的预测：与对照组相比，ACO2和FBP1的mRNA表达显著上调，而PFKL的表达显著下调。
药理学抑制iFBP1/i减轻顺铂诱导的肾小管细胞损伤
研究人员在体外模型中测试了选择性FBP1抑制剂MB05032的保护作用。结果显示，预处理MB05032能够部分改善顺铂引起的细胞形态损伤，显著提高细胞活力，降低由顺铂诱导的活性氧（ROS）水平升高，并调节凋亡相关蛋白（如降低cleaved caspase-3和BAX，上调BCL-2）的表达。这为FBP1在AKI相关损伤过程中的功能相关性提供了实验证据。
讨论部分总结
研究人员在讨论中指出，本研究整合跨队列转录组学分析与网络优先排序，揭示了AKI的分子图谱，并将代谢重编程确定为AKI的核心病理特征。三个枢纽基因的功能各异：ACO2参与三羧酸循环，与线粒体功能障碍和氧化应激相关，并在免疫细胞中上调；FBP1是糖异生关键酶，在近端小管细胞中富集，可能与肾小管损伤标志物相关，其抑制在体外实验中显示出保护作用；PFKL是糖酵解关键酶，在髓袢升支粗段细胞中富集，其下调提示了糖代谢紊乱。除枢纽基因外，研究人员还讨论了其他核心靶点，如涉及脂肪酸代谢的ACAT1、ECHS1，涉及支链氨基酸分解的BCKDHA，以及抗氧化酶GPX3、醛脱氢酶ALDH7A1、果糖转运蛋白SLC2A5、纤溶酶原PLG和肾素REN等，共同描绘了一个涉及代谢、氧化应激、血流动力学和炎症信号等多通路相互作用的复杂网络。miRNA调控网络和分子对接分析进一步提示了转录后调控机制和药物重定位的可能性。然而，研究也存在一定局限性，包括对公共数据集的依赖可能引入异质性、缺乏对枢纽基因的因果性功能验证、基因敲除小鼠证据非标准化获得、分子对接和候选药物需进一步实验与临床验证等。这些发现为未来AKI的机制研究和精准治疗开发提供了系统性框架和候选靶点。
研究结论
总而言之，本研究采用了一种多组学整合的网络药理学策略，系统地解析了急性肾损伤（AKI）的分子机制。通过结合转录组学分析、共表达网络构建、蛋白质相互作用图谱和单细胞转录组学，研究人员构建了一个包含46个核心靶点的AKI综合分子框架。其中，ACO2、FBP1和PFKL被确定为AKI相关相互作用网络中的枢纽基因，突出了代谢重编程和线粒体紊乱是AKI的关键病理特征。除了这些经典过程，整合分析还揭示了AKI中多个先前探索不足的代谢和信号通路改变，包括脂肪酸和酮体代谢、支链氨基酸分解、果糖转运和糖酵解通量、醛类解毒以及纤溶和肾素-血管紧张素系统调节。这些发现将当前对AKI发病机制的理解扩展到了氧化应激和线粒体损伤之外，揭示了一个更广泛的代谢和止血重编程网络。分子对接分析进一步鉴定出几种对枢纽靶点具有高结合亲和力的已获批药物，凸显了治疗性药物重定位的机遇。基因敲除小鼠模型数据和体外验证实验的整合，为这些靶点的功能相关性提供了实验支持。总而言之，本研究不仅完善了AKI的分子图谱，还提出了新的候选生物标志物和潜在治疗途径，为未来旨在开发AKI精准治疗的机制和转化研究奠定了坚实基础。
