《IUCrJ》：Advances in cryo-EM that have shaped mechanistic models of membrane-attack-complex assembly and regulation
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补体系统是血液来源的免疫网络，在抗感染与维持免疫稳态中发挥关键作用。膜攻击复合物（membrane-attack complex, MAC）是由补体蛋白组装形成的孔道结构，可在免疫系统激活时在靶细胞膜上形成穿孔。过去十年间，冷冻电镜（cryo-electron
补体系统是血液来源的免疫网络，在抗感染与维持免疫稳态中发挥关键作用。膜攻击复合物（membrane-attack complex, MAC）是由补体蛋白组装形成的孔道结构，可在免疫系统激活时在靶细胞膜上形成穿孔。过去十年间，冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）的技术进步为解析MAC的组装机制、膜重塑过程及调控方式提供了核心分子层面的证据。这些新技术揭示了补体复合物固有的构象柔性特征。通过开发可区分多种构象的计算分析方法，相关研究阐明了MAC活性的详细分子机制，为靶向补体的新型治疗策略奠定了理论基础。当前，AI驱动的图像分析与结构细胞生物学的进展正加速冷冻电镜领域的下一次变革，为理解免疫激活的细胞层面效应提供了新的机遇。
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引言
补体系统是蛋白质介导的免疫网络，在人类健康与疾病中具有枢纽地位。与许多具有重要生物医学意义的可溶性蛋白类似，X射线晶体学曾为补体成分3（complement component 3, C3）及其活化裂解产物C3b的结构解析提供了基础，推动了compstatin等环状肽类治疗药物的发展，该类药物目前已用于补体相关疾病的治疗。尽管C3抑制剂研发取得成功，但晶体学方法在解析其他补体蛋白的分子互作方面仍存在局限：多数补体激活发生于细胞表面，最终形成异质性高、构象灵活的蛋白组装体，这类复合物的结构更适配于冷冻电镜技术——其可在接近天然的环境中对膜蛋白进行可视化，且无需样品结晶。
十年前，冷冻电镜领域经历了“分辨率革命”，从被戏称为“blobology”的低分辨率技术发展为可揭示药物发现相关分子机制的核心手段。直接电子探测（direct electron detection, DED）硬件技术的发展提升了图像采集速度，降低了单张曝光的噪声水平；同步发展的软件工具优化了噪声处理算法，解决了困扰领域数十年的数据过细化问题。这些进展对补体终末通路的研究尤为关键，该通路的最终产物即为具有溶细胞效应的免疫孔道——膜攻击复合物（MAC）。本综述将系统阐述冷冻电镜技术进步如何推动MAC机制研究，并对补体细胞生物学的未来发展方向进行展望。
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MAC组装
MAC是补体通路的终末效应模块，可在病原体或宿主细胞的脂质双分子层上形成孔道，具体靶向取决于激活起始位置。病原体表面抗原或糖类的识别、或C3的自发水解均可触发MAC激活，三条补体激活通路最终均会放大形成表面结合的转化酶，不可逆地启动补体成分5（complement component 5, C5）的蛋白水解切割，启动MAC组装。C5切割后暴露的瞬时结合位点可招募C6等其他补体蛋白，早期解析的初始激活复合物C5b6的晶体结构揭示了C6孔形成结构域之外的多个结构域如何包裹C5的硫酯弹头并靶向细胞膜，但终末通路五种补体蛋白如何组装为膜结合复合物并破坏脂质双分子层的机制仍不明确。
冷冻电镜在膜环境中对复合物进行可视化的能力为MAC组装研究开辟了新路径。基于模型膜的冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography）解析的MAC及组装中间体结构（分辨率23 ?）揭示了该系统的复杂性与异质性；同期，去污剂增溶孔道的单颗粒分析则首次明确了MAC的化学计量比，以及补体蛋白调控结构域如何控制孔形成残基的释放。该冷冻电镜结构显示，MAC孔道由1个C5b6激活复合物、1个C7和1个C8共同构成；定位至膜后，18个C9分子发生聚合完成孔道组装。尽管上述结构解答了MAC组成的长期疑问，但受限于复合物柔性，初始结构分辨率仅达8.5 ?，未达到原子分辨率水平。
动态分子机器的柔性区域在单颗粒分析中易被平均化导致密度丢失，需更大规模数据集与更优的图像分类工具才能解析MAC组装的分子驱动机制。国家设施中高通量冷冻电镜的普及与采集速度提升为大规模MAC数据集分析提供了条件，无像差图像偏移（aberration-free image shift, AFIS）采集模式通过单次载物台移动后的光束偏转实现连续曝光，在不牺牲数据质量的前提下大幅提升了成像效率，缓解了机时瓶颈。通过合并多个高质量MAC数据集，研究人员首次得以解析MAC孔道的动态柔性特征；基于贝叶斯的图像处理方法实现了三维分类，鉴定出两种环闭合程度不同的孔道状态，分辨率提升至约5 ?。针对复合物局部区域的聚焦对齐与局部重构进一步提高了分辨率，结合补体蛋白晶体结构与同源建模，最终构建了MAC的原子模型，明确了MACPF结构域相互作用界面的静电互补性驱动补体蛋白按顺序组装的机制，且与年龄相关性黄斑变性风险相关的C9遗传变异直接定位于聚合界面，提示聚合过程参与补体介导的疾病发生。
补体蛋白的聚合受到严格调控。对比膜结合MAC与晶体学解析的可溶性补体蛋白结构可见，MACPF结构域的聚合界面仅在整合入膜结合组装体后才可及，避免了血清中补体蛋白的非特异性消耗。C8γ是嵌入异三聚体C8的调节蛋白，其在可溶性状态下结合C8α的MACPF结构域并阻断C9结合位点；整合入MAC后，C8γ发生旋转，暴露C8α的聚合界面以招募C9；C9结合后发生螺旋向发夹的构象转变，解除空间位阻以促进后续C9聚合。除调控蛋白互作界面可及性外，补体蛋白的顺序组装还影响局部脂质环境：MAC结构中C6、C7、C8β的孔形成β发夹短于C8α与C9，无法跨越完整脂质双分子层，在膜表面形成带正电的非平面区域，可与脂质头部基团结合，降低脂质双分子层弯曲所需的能量，首次证明补体激活可改变膜物理特性。
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MAC调控
补体调节蛋白在控制膜损伤、预防人类疾病中发挥核心作用。MAC组装一旦启动便不可逆，可同时作用于原核与真核细胞。固有免疫应答中，宿主细胞通过两条途径免受MAC损伤：一条捕获并清除可溶性补体激活副产物，另一条阻断宿主细胞表面的级联组装过程。MAC副产物是补体激活的重要生物标志物，脱靶MAC可攻击邻近巨噬细胞并加剧炎症，低水平MAC激活参与慢性炎症疾病发生，而红细胞缺乏补体调节蛋白时的MAC激活则是溶血性贫血的主要驱动因素。
冷冻电镜极大推进了对MAC调控机制的理解。早期可溶性MAC（soluble MAC, sMAC或sC5b9）的低分辨率结构仅显示其为弧形MAC前体，未明确分子伴侣如何抑制补体蛋白聚合。结合质谱技术与冷冻电镜的最新研究显示，血液中的sMAC存在显著的异质性，可包含不同拷贝数的分子伴侣与不同数量的C9；交联质谱鉴定了分子伴侣附近的补体蛋白残基，指导后续分类与细化，最终将sMAC结构分辨率提升至3.3 ?，明确了分子伴侣clusterin通过静电相互作用结合补体蛋白弧，并封闭C9的聚合面。sMAC结构捕获了一种此前未观测到的C9构象：部分C9已完成跨膜残基从螺旋束到β发夹的转变，而最末端被clusterin封闭的C9仍部分未展开，锁定该螺旋构象即可抑制C9聚合，提示孔道延伸依赖于两组β发夹均完成螺旋向发夹的转变。
细胞膜表面的MAC组装由GPI锚定受体CD59调控，该蛋白是补体终末通路最后的防御屏障，也是唯一的膜结合型MAC调节蛋白。CD59基因缺陷会导致包括红细胞溶解在内的严重人类疾病，同时CD59可被癌细胞劫持作为免疫逃逸机制，介导免疫治疗耐药。冷冻电镜结合膜环境解析为阐明CD59的抑制机制提供了独特视角：可溶性CD59抑制活性较弱，提示膜定位对其结合补体蛋白至关重要。研究人员利用带有合成GPI锚定的CD59胞外域修饰脂质纳米盘，捕获了两种被抑制的MAC复合物：仅含单个MAC前体C5b8的复合物（分辨率3.0 ?）与包含C9的C5b9复合物（分辨率3.3 ?）。结构显示CD59可同时结合C8与C9，提示C8结合是阻断C9膜穿孔与聚合的前提。
在膜表面，CD59可捕获C8α MACPF结构域的螺旋向发夹转变过程：C8α的第一组螺旋束展开以锚定脂质双分子层外层，第二组残基的膜插入轨迹被CD59改变；两者通过发夹起始处的盐桥稳定相互作用，CD59的高度保守芳香族侧链弯曲C8α的富含甘氨酸区域，改变发夹角度；CD59的中心β折叠通过主要由主链原子构成的氢键网络，模板化新形成的C8α发夹，在膜上形成稳定的不可逆复合物。该复合物不仅解释了人类细胞抵御MAC损伤的分子机制，还可用于建模其他物种的抑制复合物，揭示共进化界面残基决定物种特异性补体调控的规律；此外，CD59通过相同界面结合细菌孔形成蛋白，这一发现支撑了基于大环肽的新型补体调节剂的开发，可通过保守二级结构基序调控CD59活性。
CD59结合C8α β发夹后，可阻断C9的膜插入与聚合。被抑制的C5b8复合物结构中，CD59虽偏转C8α的孔形成β发夹，但MACPF结构域的聚合界面仍暴露；C9结合后其MACPF结构域发生构象变化，释放两组跨膜β发夹，而CD59恰好位于这些β发夹的膜插入路径上，阻止其到达脂质双分子层。新结合的补体蛋白的长β发夹需以组装前体的生长β桶为模板，而在被抑制复合物中，C9 β发夹的轨迹改变破坏了后续C9分子的对齐，最终导致仅一组发夹被释放，间接阻断C9聚合，捕获到与sMAC中一致的C9抑制构象，揭示了MAC调控的通用机制。
除蛋白互作外，膜上抑制态MAC的冷冻电镜结构直接证明了免疫激活导致的膜形变：较短的β发夹可在孔道形成前局部减薄双分子层，分子动力学模拟证实这些残基虽锚定于外层膜，但膜仍保持水不透性；针对GPI锚定CD59的全原子模拟显示，脂质头部基团与补体结合界面内的残基形成大量氢键，提示局部脂质环境的变化可能是释放结合界面、允许CD59阻断C8α的必要条件。上述机制解析依赖于结构生物学方法的进步：除处理离散异质性的算法外，CD59抑制复合物还需处理连续柔性的计算工具；AlphaFold等机器学习结构预测工具的应用，为中等分辨率冷冻电镜图中的模型搭建提供了支撑；合成GPI锚定蛋白的脂质系统则为解析模型膜上的MAC调控提供了可能。
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未来展望
十年后，机器学习与人工智能正驱动冷冻电镜革命的下一阶段发展。计算机视觉领域的深度学习方法正在变革结构生物学的各个环节：去噪卷积神经网络拓展了冷冻电镜图像分析的适用范围，可解析更小的复合物，并从低信噪比图像中获得更优重构结果；神经场网络被用于提升实空间细化中冷冻电镜重构的准确性。这些进展在提升均质结构分辨率的同时，也为图像异质性分析提供了新工具，有望通过单颗粒分析可视化补体蛋白复合物的瞬态稀有构象。
与此同时，冷冻电子断层扫描的细胞成像分辨率已接近单颗粒冷冻电镜水平，2D图像分析中的去噪与分类方法正逐步应用于3D断层图；基于深度学习的方法可实现细胞中拥挤嘈杂断层图的3D颗粒挑选，卷积神经网络与U-Net架构正在实现数据自动分割，大幅缩短从数据采集到机制发现的周期。随着冷冻电镜进入下一发展阶段，这些工具将支持研究人员在细胞语境中研究MAC，发现新的生物学机制，推动下一代补体治疗药物的开发。
