综述：规范合成生物学与先进基因干预：生物安全框架、基因治疗监管、干细胞制造风险及未来政策方向

《Journal of Biosafety and Biosecurity》：Regulating Synthetic Biology and Advanced Genetic Interventions: Biosecurity Frameworks, Gene Therapy Oversight, Stem-Cell Manufacturing Risks and Future Policy Directions

　　尼拉贾·苏雷什 | 阿努什卡·拉托雷 | 维贾伊·辛格 | 谢伦德拉·德维迪 | 阿卡什·班萨尔
印度北方邦戈勒克布尔全印度医学科学研究所生物化学系初级研究员

**摘要**
基因编辑（CRISPR-Cas9、碱基编辑和引导编辑）、病毒载体疗法（腺相关病毒[AAV]和慢病毒系统）以及工程化干细胞平台（诱导多能干细胞和间充质细胞系）极大地改变了疾病治疗方式，但也带来了严重的生物安全风险、监管空白和生物安全威胁。本文综述了合成生物学中备受关注的“双重用途研究”（DURC），强调了人工智能（AI）辅助设计和基于云的DNA合成如何增加了误用的风险，这一点在2024年DARPA关于基因组工程民主化的研究结果中得到了体现。已经识别出多种生物危害，包括某些基因和细胞治疗试验中观察到的细胞因子释放综合征等免疫毒性；病毒脱落和重组（例如在一些AAV载体研究中罕见地检测到具有复制能力的病毒颗粒）；以及表观遗传失调导致的长期致癌风险。干细胞制造也伴随着多种风险，如致癌潜力、基因异常和受体功能障碍（如异位植入），这些可能扰乱免疫和代谢平衡。全球监管的审查揭示了显著的差距和碎片化现象：美国国立卫生研究院的重组DNA指南落后于欧盟的先进治疗药品（ATMP）框架和ISO 20399标准，低收入和中等收入国家缺乏协调机制，且缺乏生物监测基础设施。最近临床试验的证据（如Luxturna研究中的载体脱落案例）强调了基于代谢组学的风险评估的必要性。未来的发展方向包括建立集成的全球生物安全登记系统以实现实时不良事件追踪，通过AI辅助的序列筛查进行双重用途研究监督，多组学风险评估，以及制定统一的良好生产规范和伦理框架，以应对快速的技术进步带来的挑战。

**1. 引言**
基因组编辑技术的最新进展，尤其是CRISPR-Cas系统，通过实现在体外和体内高度精确地修改基因序列，为多种疾病的治疗创新提供了可能。[1] 同时，病毒载体平台（如腺相关病毒[AAV]、慢病毒和其他工程化载体）的发展扩展了基因校正和疫苗开发的递送机制，但也凸显了与其使用相关的职业和环境生物安全挑战。[2] 具有调控转录基因表达的工程化干细胞和多能细胞正在被探索用于再生医学和靶向细胞治疗，这体现了基因工程与基于细胞的临床应用的结合。尽管取得了这些显著进展，但这些技术仍引发了复杂的生物安全和生物安全问题。基因编辑可能导致脱靶效应、基因组不稳定性和非预期的生物相互作用，因此需要严格的风险评估和治理来确保安全。[1] 病毒载体系统带来了独特的健康和环境风险，需要强有力的控制和机构监督来保护研究人员和公众健康。[2] 这些平台的快速普及超过了全球统一的监管框架，导致监督、伦理治理和双重用途风险缓解方面的空白，需要国家和国际利益相关者的协调政策响应。图1总结了合成生物学中从设计到临床开发过程中的生物安全和生物安全风险及其相关的治理缺口和拟议干预措施。

**2. 合成生物学与备受关注的双重用途研究（DURC）**
合成生物学是生物技术的一个分支，它整合了分子生物学、基因工程、计算建模和系统工程，以合理设计和组装具有特定功能输出的生物组件和途径。合成生物学加剧了众所周知的双重用途冲突，同时在医学、诊断和DNA数据存储方面带来了巨大益处。提高准确性和可访问性的工具降低了潜在误用的风险。基因编辑工具（如CRISPR、碱基编辑器和引导编辑器）使靶向修饰变得更加快速和便捷，扩展了合法的医疗和农业应用，同时也为病原体或生物体的改造创造了新的可能性。[3] 随着合成成本的降低和台式设备的普及，DNA合成生态系统和基于云的设计流程中的安全实践仍存在不一致性：提供者的筛查标准差异显著，自愿性指导缺乏约束力，从而留下了可被利用的漏洞。[4] 除了基因编辑和病毒载体工程外，合成生物学的其他领域也具有重要的双重用途影响。如果缺乏适当的保障和监督，用于代谢工程的工业生物生产平台可能会被重新定向用于生产有害代谢物，包括生物活性毒素。针对病毒控制或其他生态干预的基因驱动技术能够迅速将工程化遗传特征传播到野生种群中，从而增加潜在的生态风险和控制挑战。[5] 无细胞合成生物学系统能够在活细胞外进行生物反应，降低了传统实验室的隔离要求，可能促进生物活性分子的分散生产。[6] 此外，采用非经典核酸或扩展遗传密码的新兴异生物学方法创建了环境相互作用和长期生物安全影响尚不完全清楚的生物系统。这些新兴领域进一步强调了合成生物学和DURC中全面治理和监督框架的重要性。[7] 云服务、集成测序和合成过程以及数据驱动设计平台的网络生物安全漏洞日益突出，需要专门的监督。

**3. 基因治疗和基因组修饰风险**
基因编辑工具（如CRISPR/Cas）可能导致基因组非靶位点的DNA修饰。染色体易位、插入、缺失和其他基因组重排都是这些脱靶修饰的例子，可能影响基因表达或基因组稳定性。这些修饰在治疗性编辑中是一个公认的安全问题，需要在临床前研究中使用敏感的检测技术。[12] 由于随机整合到癌基因附近可能导致恶性转化，因此来自整合载体（如慢病毒或逆转录病毒）的插入突变仍然是一个值得关注的问题，尤其是在干细胞基因治疗中。[13] 在更严重的情况下，这些异常编辑可能导致类似染色体断裂的大规模重排，从根本上破坏染色体完整性。[14] 最近的基因组研究表明，使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑可能会引起复杂的结构变化。对基因组编辑的人类干细胞和细胞系进行全基因组测序发现了一些类似染色体断裂的事件、大范围缺失和染色体易位。一些基因组编辑研究还观察到基因组编辑细胞中存在结构异常，大约15%–20%的基因组编辑细胞表现出结构异常。[15, 16] 在依赖基因组整合的载体疗法中，插入突变是一个已知的风险，因为靠近原癌基因的整合可能触发致癌途径。修改调控基因还可能扰乱精细调节的免疫监视或代谢网络，改变细胞稳态，使个体更容易患病。[17] 虽然重组AAV载体、慢病毒和腺病毒因其转导效率而成为主要的基因递送平台，但它们也带来了独特的生物安全挑战。尽管重组AAV载体通常不整合，但在高系统剂量下仍可能引起免疫反应和肝脏毒性，这对肝脏定向基因治疗构成了严重的安全风险。[18] 由于慢病毒载体可以整合到宿主基因组中，插入突变引起了关注，因为它与恶性转化有关，且其风险仍在评估中。[19] 宿主免疫系统经常受到基因治疗载体和改变的细胞的影响。病毒衣壳蛋白和递送系统可能触发先天性和适应性免疫反应，降低治疗效果并引起炎症损伤。在临床环境中需要采取免疫抑制措施，因为高剂量AAV载体与免疫介导的肝毒性相关。[20] AAV载体的临床经验还表明了载体脱落和具有复制能力的载体的可能性。基因治疗试验的监测在系统给药后检测到体液（包括血液、尿液、唾液和精液）中的短暂载体DNA。尽管rAAV载体具有复制缺陷，但在体内生产过程中可能发生重组事件，生成具有复制能力的载体。这些因素强调了环境监测、长期随访在基因治疗试验中的必要性。[21] 此外，对基因治疗成分的免疫反应可能引发细胞因子释放和相关的系统性炎症毒性。这些效应在基于CAR-T细胞的细胞疗法中尤为明显，需要严格的临床监测和管理。[22, 23] 基因治疗具有超出急性编辑活动的长期影响。如果调控或代谢基因受到影响，基因组紊乱可能导致细胞和代谢途径的持续失调。一些高剂量系统基因治疗模型显示出持续的低水平炎症或组织生理改变，这正在被监测以确保安全。[20] 尽管基因组整合事件的不良后果很少见，但由于基因表达失调或恶性转化的可能性，长期监测仍然是必要的，特别是在分裂组织中。[19] 这些多方面的风险强调了严格生物隔离协议、敏感的脱靶检测策略、全面的免疫监测和长期临床随访框架的必要性。随着基因治疗扩展到更广泛的临床和研究应用，将DURC风险映射与基因组和免疫监测相结合将变得越来越重要。

**4. 干细胞工程和制造风险**
残留的未分化细胞可能发展成畸胎瘤和其他肿瘤，在大规模扩增多能干细胞和合成干细胞期间存在显著的肿瘤形成风险。自我更新和多能性途径与致癌程序共享分子网络，这种重叠可能在移植后增强恶性潜力。基因编辑干细胞可能发展出失调的细胞周期调控或增殖优势，增加癌症风险。[23] 某些多能细胞群体本质上具有肿瘤性，如果在移植前未充分消除残留的未分化细胞，可能会在体内形成畸胎瘤。[24] 培养的胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）和间充质干细胞（MSCs）在体外扩增后可能发生基因组异常，包括拷贝数变异、非整倍体和染色体重排。这些变化类似于癌细胞中的变化，可能增加肿瘤发生的可能性或改变移植后的细胞行为。复制压力、DNA修复受损、端粒功能障碍和培养相关压力都会导致基因组不稳定。[25] 干细胞通过分泌因子和免疫调节信号影响受体，可能导致不希望的细胞因子或代谢紊乱：MSCs释放生长因子、趋化因子和细胞因子，从而改变免疫反应。虽然这些中介在治疗效果上可能是有益的，但当它们失调时，其效果会变得不可预测，可能会导致不良的免疫或代谢后果。[26] 移植后不适当的细胞因子谱型或旁分泌信号可能会改变免疫-代谢途径，从而可能导致异位组织形成或有害的宿主反应。[27] 在大规模生产过程中，保持无菌状态和生物安全至关重要；如果不遵守无菌预防措施，在手动细胞处理过程中可能会发生细胞系之间的交叉污染或引入微生物污染物。[28] 用于基因工程的病毒载体可能会无意中逃逸控制范围，或携带宿主DNA污染物，从而影响产品的完整性和生物安全性。[29] 为应对这些风险，需要严格遵守现行良好的生产规范，进行全面细胞特性分析，并采用统一的国际安全标准，以确保治疗生产的可靠性和安全性。[30] 表1总结了干细胞的制造风险及其相关的具体生物安全风险，将每种风险与已记录的实际观察结果或实验联系起来。

表1. 干细胞工程和制造风险、相关的具体生物安全风险、已记录的实际观察结果和实验及其背后的机制解释。

**生物安全风险分类** | **已记录的实际观察/实验事件** | **机制基础**
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| 致瘤性和不必要的分化** | 在动物模型中，残留的未分化多能干细胞（PSCs）在移植后形成了畸胎瘤。多能性因子（OCT4、SOX2和NANOG）维持自我更新和多谱系分化潜能；在没有分化信号的情况下，这会导致体内畸胎瘤的形成。[23] | 多能干细胞经过长期培养和基因编辑后获得了增殖优势，并表现出致瘤行为。培养选择携带TP53通路改变、MYC扩增或增强抗凋亡信号的克隆，所有这些都会赋予其增殖优势。[25] |
| 细胞扩增过程中的基因组不稳定性** | ESCs/iPSCs在长期扩增过程中出现了重复序列变异（CNVs）和染色体异常。复制压力、端粒功能障碍以及DNA损伤检查点的缺陷导致非整倍体和结构重排。[32] | |
| 涉及生长促进位点的亚染色体复制** | 在适应培养环境的细胞中积累。正向选择有利于具有增殖相关基因拷贝数增加的克隆，这种模式类似于早期致癌进化。[33] | |
| 接受者体内的生化和生理紊乱** | 骨髓间充质干细胞（MSCs）输注改变了临床研究中的全身细胞因子谱型。MSC分泌物（IL-6、TGF-β、PGE2和IDO）调节T细胞和巨噬细胞的反应；失调的旁分泌信号可能会改变免疫-代谢平衡。[34] | |
| 异位或不适当的组织形成** | 在某些干细胞干预中观察到了这种情况。未完全分化的细胞允许环境信号将分化导向非预期的组织表型。[35] | |
| 制造空间中的交叉污染** | 在细胞处理设施中报告了微生物和细胞系之间的交叉污染。共享培养箱、气溶胶、错误标记以及不足的无菌隔离措施可能导致细胞或病原体在不同培养物之间的转移。[28] | |
| 病毒载体脱落** | 在基因治疗受者的体液中检测到病毒载体脱落，需要对其进行监测。复制缺陷的载体可能在体液中短暂存在，残留的包装成分或重组事件可能导致有限的环境传播。[36] | |

**5. 全球监管框架和政策差距**
基因和细胞工程技术的快速全球扩展需要多个监管框架来确保生物安全、生物安保和伦理监督。然而，在监管范围和执行方面仍存在显著差异。美国国立卫生研究院（NIH）关于涉及重组或合成核酸分子的研究的指南规定了构建和处理这些分子（包括那些与天然序列配对的修饰分子）以及含有它们的细胞、生物体和病毒的生物安全措施；此类研究在开始前需要由机构生物安全委员会（IBC）进行审查。[38] 相比之下，世界卫生组织（WHO）提供了防止高后果生物材料在整个价值链中出现漏洞的广泛原则，涵盖了收集、运输、储存、实验室使用、存储和生物库中的操作。[38]
全球生物安全监管系统中最困难的问题之一是国际协调与国家主权之间的平衡。虽然像WHO这样的国际组织提供了促进生物安全和生物安保监管的规范性建议，但由于各国对生物技术监管、病原体样本共享和基因组数据治理的主权，这些建议通常不具有约束力。例如，政治和安全考虑可能会影响各国是否以及在多大程度上采纳国际生物安全建议。[39]
欧盟的ATMP法规代表了一种集中式的监管方法，为ATMPs的市场授权和上市后监督提供了框架，同时强调制造质量和临床安全。[40] 美国食品药品监督管理局（FDA）通过提供环境风险评估、载体脱落和长期随访方面的指导来补充这些框架。ISO标准，包括ISO 20399（针对辅助材料）和ISO 24603（针对多能干细胞生物库），进一步建立了统一的质量保证（QA）、可追溯性和生物库要求。[41]
尽管有这些框架，但仍存在差距。在印度，干细胞衍生产品根据1940年的《药品和化妆品法》以及2019年的《新药品和临床试验规则》进行监管；然而，重叠的法律、非约束性的指南（如《国家干细胞研究指南》）以及监管机构的解散（如内部干细胞研究委员会）使得一些诊所能够提供未经验证的疗法。[41]
除了监管描述之外，在实际实施生物安全监督方面还存在重要的技术和治理挑战。从科学角度来看，快速发展的技术，如基于CRISPR的基因组编辑、合成基因电路和AI辅助的生物设计，在风险预测方面引入了不确定性，包括与脱靶基因组效应、长期细胞行为和生物体释放后的生态影响相关的不确定性。这些科学不确定性使监管评估和生物安全风险评估变得复杂。[42]
治理挑战同样重要。高收入国家（HICs）通常拥有结构化的监管机构、完善的IBC和集中的监督机制，而许多低收入和中等收入国家（LMICs）在监管能力、技术专长和生物安全基础设施方面存在限制。例如，虽然美国和欧盟运营着涉及NIH等机构的协调框架和欧盟ATMP监管系统，印度的监管系统则主要依赖于基于指南的监督，包括NGSCR，这并不总是具有法律约束力。因此，加强生物安全治理需要改进监管协调、提升技术能力，并加强国际合作，以协调标准，同时考虑到各国监管背景。[43]
除了上述问题外，在有效实施生物安全监督方面还有其他技术和治理问题需要解决。首先，从科学角度来看，新技术如CRISPR基因组编辑、合成基因电路和AI辅助设计带来了新的科学不确定性，例如与脱靶基因组效应、长期细胞效应和生物体释放后的生态效应相关的不确定性，这些都给风险预测和生物安全风险评估带来了新的挑战。另一方面，与治理相关的问题也同样重要，需要在有效实施生物安全监督时加以解决。例如，在HICs中，已经建立了正式和结构化的监管系统、IBC和集中式监督机制，而在LMICs中，这些系统仍然缺乏或正在开发和实施中。例如，在美国和欧盟，已经建立了涉及NIH等机构的协调监管系统，而在印度，基于指南的监管仍然占主导地位，如NGSCR所示。[44]
全球范围内，HICs和LMICs之间的差异导致了干细胞旅游现象的持续存在。[44] 合成生物学和AI（SynBioAI）的融合，包括CRISPR-Cas9基因组编辑和AI辅助的序列设计，暴露了监管漏洞，使得基因构建和AI生成的危险蛋白质变体能够迅速在全球传播，引发了重大的双重用途问题。[45, 46] 表2总结了当前关于合成生物学研究的政策及其指南、覆盖范围和实施方面的差距。

**表2. 合成生物学和基因-细胞干预的全球政策及其指南、覆盖范围和实施方面的差距**

| 监督系统 | 当前政策（关于合成生物学/基因-细胞干预） | 政策差距 |
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| NIH指南 | 要求对重组/合成核酸研究进行IBC审查、注册和报告；2019年的修订明确了人类基因转移报告要求。[28] | 对复杂的、可编程的合成生物学构建和快速AI驱动的设计工作流程的覆盖有限；机构审查流程可能无法跟上技术进步的速度。 |
| WHO实验室生物安全指南 | 提供非约束性的、基于风险的生物安全指导，涵盖整个价值链（收集→储存→运输→使用），并推荐机构风险评估和监督实践。[47] | 指导是非约束性的，缺乏可执行的全球监督机制来监测临床载体脱落和跨境报告。 |
| 欧盟ATMP法规 | 建立了ATMPs的市场授权和上市后监督的集中式框架，定义了基于基因和细胞产品的质量、安全和有效性路径。[48] | 成员国之间的实施不均衡，报销/获取方面存在差距，对工程合成电路或AI设计的修改缺乏足够的指导。 |
| FDA基因治疗指南 | 一系列指导文件涵盖了环境评估、载体脱落和长期随访，这些文件影响了基因治疗的临床设计、制造控制和监测期望。[49] | 缺乏标准化的全球协议来监测载体脱落和环境生物监测；指导仍在不断发展，但尚未实现国际统一。 |
| 国际标准化组织 | 新的ISO标准（如ISO 20399针对辅助材料和ISO 24603针对多能干细胞生物库）建立了统一的质量保证（QA）、可追溯性和生物库要求。[50] | 标准的采用尚不完整；与国家GMP/监管框架的对齐程度不一，特别是在LMICs中。 |

**6. 未来方向**
一个全面的、互操作的全球生物安全登记系统对于系统地跟踪与基因和细胞疗法相关的不良事件至关重要，包括载体相关并发症、脱靶基因组编辑、免疫介导的毒性、致瘤性和长期表观遗传修饰。[51] 这样的平台将有助于早期信号检测、跨试验的学习以及协调的国际响应，同时促进赞助者和监管机构之间的透明报告。例如，国际生物安全和生物安保监管专家组的倡议鼓励协调事件报告和共享监管专业知识，以加强全球生物安全和生物安保。[52, 53]
治理框架还必须解决AI辅助生物设计背景下的持续风险（DURC）问题，包括对基因序列的计算筛查、数字保护和出口控制式的监督，以减轻潜在的滥用风险，同时支持合法创新。[46, 54]
临床前评估应超越单一组学评估，发展到综合多组学分析，包括转录组学、蛋白质组学、代谢组学和免疫原性分析，以捕捉修改细胞或基因编辑生物体的复杂生物相互作用和微妙的脱靶效应。[55] 先进的生物安全监测策略的实施还必须考虑HICs和LMICs之间的基础设施差异。在许多LMICs中，监管基础设施（如IBC）、训练有素的生物安全人员和标准化的隔离措施的实施并不一致。因此，在这些地区加强生物安全治理应优先考虑能力建设措施，包括生物安全培训计划、制定国家监管框架和建立区域实验室网络，然后再采用先进的多组学监测技术。国际合作、技术共享倡议和协调的监管支持可能有助于弥合这些差距，并实现实际的生物安全改进。[56]
先进生物安全监测策略的实施还必须考虑HICs和LMICs之间在基础设施方面的现有差异。在LMICs中，监管基础设施（如IBC、生物安全人员和标准化的隔离措施）的实施并不一致。因此，在LMICs中加强整体生物安全治理应优先考虑能力建设措施，包括提供生物安全培训计划、制定国家监管框架和建立区域实验室网络。在采用先进的多组学监测技术之前，这些措施是必要的。 |
结合功能检测与多组学数据的标准化流程有助于检测代谢、免疫和表型扰动，从而加强生物安全评估。[57] 全球统一的GMP标准、QA协议、可追溯性要求和伦理责任框架对于确保一致的生产、临床安全和公平的患者获取至关重要。[58] 区域性倡议，如药品检查合作计划和国际药品监管机构计划，为检查员培训、共享指南和监督协调提供了模型。[59] 综合登记系统、AI意识的DURC治理、多组学风险评估和统一的GMP标准构成了负责、安全和公平转化新兴生物技术的协调全球策略。[60][61]

**7. 结论**
基因和细胞工程技术的快速扩展超过了全球监管框架的协调速度，暴露了生物安全、生物安保和伦理监督方面的持续差距。尽管有NIH指南、WHO原则、欧盟ATMP法规和ISO标准（ISO 20399和ISO 24603）等提供了结构化的指导，但在不同国家之间仍存在差异，特别是在LMICs中，这导致了无监管实践和干细胞旅游现象的持续存在。合成生物学和AI（SynBioAI）的融合，包括CRISPR-Cas9基因组编辑和AI生成的危险蛋白质变体，进一步突显了监管漏洞和双重用途问题，需要强大的计算筛查、监管监督和统一的GMP和伦理框架。整合互操作的全球生物安全登记系统、AI意识的DURC治理、多组学风险评估和标准化的GMP协议，提供了一种协调的方法，以安全负责地转化尖端生物技术，确保公平获取的同时减轻生物安全和生物安保风险。