《Journal of Controlled Release》：Innovative lipid nanoparticle formulations: Bridging the gap toward decentralized personalized gene therapies
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脂质纳米粒（LNP）已成为递送核酸的一项关键技术，在mRNA疫苗和RNA疗法的成功中发挥了关键作用。包括微流控混合和射流撞击混合在内的既定制造方法已展现出极佳的可扩展性、重现性和临床相关性，尤其是在SARS-CoV-2疫苗开发期间。然而，这些技术也伴随着与有机
脂质纳米粒（LNP）已成为递送核酸的一项关键技术，在mRNA疫苗和RNA疗法的成功中发挥了关键作用。包括微流控混合和射流撞击混合在内的既定制造方法已展现出极佳的可扩展性、重现性和临床相关性，尤其是在SARS-CoV-2疫苗开发期间。然而，这些技术也伴随着与有机溶剂（乙醇）处理、个性化医疗的可扩展性以及环境考量相关的挑战。本综述关注了LNP配方中旨在通过替代和互补方法应对这些挑战的最新创新。本综述的一个核心重点强调了利用预制囊泡（PFV）或其他纳米结构的形成后包封策略。这些策略促进了核酸的模块化、按需装载。此外，无有机溶剂技术，包括热循环、钙介导的DNA包封和水相超声处理，为生物相容性、简化的制造提供了新的机会。结合这些配方策略，本文讨论了连续制造平台的最新进展，这些平台实现了端到端的工艺控制、实时分析和提高的生产效率。通过比较传统和新兴技术，本综述概述了不断发展的LNP配方格局，并确定了将创新整合到传统生产流水线中的关键机遇。
1. 引言
脂质纳米粒（LNP）作为靶向递送敏感或关键的活性药物成分的药物递送系统已有数十年历史。2018年Onpattro的获批是一个里程碑，它是首个基于核酸的LNP药物，利用了小干扰RNA（siRNA）。除siRNA外，信使RNA（mRNA）已成为一个极具前景的创新疗法平台，并在COVID-19大流行期间获得了公众的广泛关注。在此期间，另外两种基于LNP的基因疗法作为mRNA疫苗获批。这推动了基因治疗领域的研究，并使LNP成为递送核酸的关键技术。除了作为疫苗平台，mRNA还具有广泛的治疗潜力，目前临床研究主要集中在抗肿瘤应用，同时基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法也在探索中。特别是在CRISPR-Cas9应用的背景下，LNP有潜力通过实现对罕见或先天性疾病的治疗来显著推进全球医疗保健。目前全球约有3亿人患有罕见病，其中约80%具有遗传根源。由于某些疾病的罕见性，传统临床试验往往不可行，使得个性化医疗成为一种更有前景的途径。在这种背景下，基于LNP的基因编辑提供了一个独特的平台，其中只需调整和测试疾病特异性的核酸，而递送系统仅需微小的调整。这增强了这些疗法的多功能性和转化潜力，最近以NANOSPRESSO计划的形式受到了关注。例如，2019年反义寡核苷酸Milasen被成功应用于单例患者。然而，自此之后进展缓慢，仅报道了少数其他病例。在这里，LNP可能成为实现有效实施的决定性工具。众多研究已证明使用LNP递送系统进行基因编辑的成功。2025年，报道了首个用于遗传性疾病（严重氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）缺乏症）的、通过LNP实现的个性化CRISPR疗法。如果长期研究能同时确认其安全性和有效性，这一突破可能成为进一步发展和潜在更广泛应用的开端。除了罕见病，个性化和肿瘤特异性的癌症治疗也很有前景。癌症通常源于点突变的复杂相互作用，原则上这些突变适合治疗干预。每年全球有超过2000万新病例，且发病率预计会进一步增加，这代表了大量可能受益于基于LNP疗法的患者群体。然而，其临床转化面临诸多挑战，如有效递送治疗药物至肿瘤组织、意外基因组改变的风险以及不利免疫反应的潜在可能。由于对疫苗技术需求的增长和工业兴趣的增加，近年来已建立了大规模LNP生产设施。然而，传统的LNP制造仍然严重依赖有机溶剂，导致了化学废物和能源密集型过程。特别是在个性化治疗方面，在本地医疗中心实施LNP将是有利的，而大规模批量合成则不太核心。在此背景下，考虑创新的配方策略并结合生命周期评估以满足本地监管和未来要求可能是有益的。能够封装多种核酸的即用型空LNP可能为解决这一挑战提供有前景的机会。本综述旨在首先总结现有技术，然后聚焦于创新方法，以探索LNP配方技术的当前格局。同时，在生命周期考量的背景下讨论了传统LNP材料的特性。本文还将重点介绍关键进展、行业趋势和未来创新的机会。
2. 传统LNP生产：当前实践与挑战
标准的LNP配方，以FDA批准的含siRNA或mRNA的药物为例，通常包含四种关键的脂质成分：可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和隐形脂质，如聚乙二醇（PEG）缀合脂质。配方本身通常依赖有机溶剂系统，如乙醇或氯仿，以促进脂质混合和纳米粒形成。尽管存在多种生产LNP的方法，但其中许多最初是为常规药物递送开发的，其中需要封装小的、主要是疏水性的成分。一个典型例子是薄膜水化法，这是一种制备载药LNP的成熟且直接的方法。在此技术中，脂质溶解在有机溶剂中，然后蒸发在容器表面形成一层薄薄的脂质层。随后用含水溶液对干燥的薄膜进行再水化，导致脂质体结构的形成。形成的囊泡类型取决于水化和搅拌条件，可以从大的单层囊泡到小的单层或多层囊泡。通过确定孔径的膜挤出或超声处理等技术用于控制粒径和改善均匀性。该方法有利于小规模LNP生产，但在扩大规模时，由于蒸发时间长、包封效率低和批次间差异，带来了挑战。虽然此类方法仍用于某些活性药物成分（API），但对于核酸包封而言，它们已经过时且不再是最先进的。除薄膜水化法外，还包括反相蒸发法。对于核酸包封，微流控是广泛采用且高效的LNP生产方法。基于纳米沉淀原理，该技术能够在微尺度通道内快速、可控地混合脂质相和水相，通常通过乙醇稀释。由此产生的静电驱动的自组装过程形成高度均匀的纳米颗粒。微流控芯片设计的最新进展进一步提高了重现性和可扩展性，能够精确调整配方参数，如流速、浓度和相比。存在多种微流控混合器设计，包括Y形混合器、流体力学流动聚焦系统、交错人字形混合器和分叉混合器。设计的多样性使得能够根据LNP合成的特定要求进行以工艺为导向的优化，使微流控成为生产治疗性纳米颗粒的强大而灵活的平台。然而，用于微流控装置的材料选择也应考虑在内，因为常用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）在接触有机溶剂时会膨胀，可能导致通道变形影响工艺。在COVID-19大流行期间，射流撞击混合（IJM），一种特定的先进微流控技术，因其被Knauer、BioNTech和辉瑞等公司用于以高通量率生产高质量mRNA-LNP而受到关注。在此方法中，两股高速流体流，通常是脂质溶液和含药物的水相，在有限空间内碰撞。这种碰撞产生强剪切力和快速混合，从而形成尺寸均匀的LNP。关键参数如流速和压力可以精确调整以控制纳米颗粒的特性。尽管有效，但这些方法涉及环境问题，包括溶剂废物和蒸发过程中的能源消耗。此外，使用大量易燃溶剂需要广泛的安全预防措施，并增加了制造成本。尽管这些方法在工业水平上是成功的，但替代的、创新的制造技术可以改进工艺。此外，它们有潜力促进去中心化和个性化治疗方法的实现。
3. 现代LNP制造策略
为满足药物开发不断变化的需求，LNP的制造策略正在经历持续转型。在此背景下出现了两大行业趋势。一方面，正在优化大规模连续制造工艺，以确保高效、可重复且经济地生产高容量药物，如疫苗。另一方面，越来越关注去中心化、小规模制造平台，旨在支持个性化药物的开发，其中灵活性和患者特异性定制是关键。
3.1. 通过连续制造改进大规模LNP生产
最近的进展已将LNP制造从传统的批处理方法转变为完全集成的连续制造平台，提供了无与伦比的效率、可扩展性和实时控制。Nag等人开发了一种基于有机溶剂、由实验设计（DoE）原则指导的稳健连续流工艺，能够精确控制LNP尺寸（60至180纳米）。这消除了工艺特定的配方或设备配置，在不同规模上具有高重现性，并使用SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物进行了验证。Sheybanifard等人进一步推动了该领域的发展，将微流控LNP形成与实时在线分析和自动溶剂去除相结合。这使得能够对制药级生产进行质量控制。Nourafkan等人开发了一个集成了尺寸监测、切向流过滤和mRNA完整性验证的实时在线模块化平台。该平台实现了>95%的包封效率，并保持一致的尺寸（105纳米，PDI 0.1）。总的来说，这些创新可能标志着从静态、手动协议向更动态、质量源于设计的制造方法的转变。此类发展可能有助于减轻RNA疗法和疫苗生产中的监管、可扩展性和重现性挑战。这些是未来大规模工业制造的关键参数。
3.2. 用于个性化医疗的去中心化、小规模LNP生产
然而，这些工业药物生产方法通常不太适合个性化医疗，其中必须解决患者特定的要求。这在罕见病的治疗中尤其相关，其中可适应不同核酸序列的通用纳米载体变得越来越有价值。目前罕见病疗法极高的成本通常给医疗保健系统带来重大的伦理和财务挑战。降低这些成本将为个性化医疗提供更可持续和可及的解决方案。与生产数百万剂疫苗不同，这些疗法需要根据患者的遗传特征定制个性化配方，理想情况下应在本地医疗机构制备。像NANOSPRESSO这样的项目突显了去中心化、按需LNP制备的相关性。其中提出的平台技术，与大规模制造相比，提供了实施个性化医疗所需的灵活性。尽管在广泛应用此类方法之前仍存在众多监管障碍，但一个强调整个制造过程的质量源于设计框架可能使这一目标更加现实。最终，此类策略有潜力为个性化基因治疗，更广泛地说，为个性化医疗提供有效的治疗选择，这日益被视为未来医疗保健的核心范式。就在最近，世界上首例针对新生儿的个性化CRISPR疗法突显了此类方法的直接相关性，并强调了其对未来的承诺。
4. LNP配方中的可持续性：生物相容性和生命周期方面
脂质纳米粒（LNP）配方的可持续性取决于所选材料及其生产过程中涉及的工艺。脂质成分的生物相容性及其生命周期对环境的影响以及生产过程本身是未来LNP开发的决定性因素。在材料方面，从与重大生物相容性问题相关的永久性阳离子脂质向可电离脂质的转变取得了显著进展。此外，正在付出大量努力开发创新的合成路线，并纳入可生物降解的功能，如酯基，以提高生物相容性和可持续性。除了核心脂质成分的这些结构创新，注意力已转向辅助脂质，如PEG化的隐形脂质，它们自身带来了一系列生物相容性和可持续性挑战。由于PEG在日常产品中的过度使用，许多人已经产生了PEG特异性抗体，甚至无需药物暴露。这些抗体会使个体易患过敏症和过敏反应，药物给药可能会加剧这些反应。此外，重复给药PEG化制剂会加速清除，从而影响治疗效果。因此，对替代品的需求代表了当前研究的核心焦点。正在研究的候选物包括聚肌氨酸、两性离子聚合物、聚甘油基脂质和聚（2-恶唑啉）。与PEG相比，聚（2-恶唑啉）在生物相关条件下发生有利的氧化降解。它们可能在氧化时降解，这增强了它们作为可持续替代品的潜力。除了生物相容性，可持续性方面应纳入LNP制造的整个生命周期。早期整合生命周期评估（LCA）指标可确保环境考量成为LNP创新的驱动力，而不是事后考虑。尽管LCA在传统药物制造中已很成熟，但其在纳米材料，特别是LNP中的应用仍处于早期阶段。考虑到对LNP日益增长的需求，存在相当大的潜力来扩展和完善这些方法，特别是考虑到医疗保健部门，更具体地说是制药行业的碳足迹不成比例地增加。这就凸显了检查脂质原料供应链及其合成路线的重要性。对于药物应用，由于重现性要求，完全合成的材料是首选，尽管一些脂质（例如胆固醇）仍可来源于动物，这带来了相当大的环境影响。因此，创新的合成策略或植物基替代品代表了减少环境负担同时保持药物质量标准的有前景的途径。此外，LNP对温度高度敏感，需要严格的冷链管理以保持稳定性和效力。例如，辉瑞/BioNTech的mRNA疫苗必须在约-70°C的温度下储存和运输。此类要求需要专门的基础设施，包括温控储存单元和耐用、耐低温的小瓶。然而，冷链基础设施的全球分布高度不均衡，特别是在低收入和中等收入国家，维持这些条件构成了重大的物流挑战，这与增加的碳足迹密切相关。因此，研究了改进稳定性和更实用分布和储存温度的改性脂质和新型缓冲系统。最后，溶剂使用也必须在可持续性的背景下考虑。有机溶剂在单个脂质成分的合成和实际的纳米颗粒制造过程中都起作用。乙醇已经代表了一个相对有利的选择，但长期目标可能是在LNP生产中完全消除有机溶剂，符合更广泛的绿色化学原则和更少的能源消耗。
5. LNP的替代配方方法
5.1. 利用预制囊泡的形成后包封
最近的出版物强调了一种方法，其中首先生成无核酸的脂质结构，即预制囊泡（PFV），随后在第二步中将其装载所需的核酸。这种方法代表了个性化纳米医学向前迈出的有希望的一步，因为它符合模块化LNP生产的“一刀切”原则。表1概述了这些PFV方法。最近的进展挑战了乙醇对于在LNP中包封小干扰RNA（siRNA）至关重要的长期范式。研究表明，可以在完全没有乙醇的情况下有效捕获siRNA。这一结果代表了其研究小组早期方法的进步，据我们所知，该方法是首次使用预制脂质体。然而，在该方法中，多核苷酸被添加到含有乙醇的缓冲混合物的脂质体中，乙醇含量被认为是包封的关键。随后，该技术针对siRNA进一步优化，并在后来的研究中被描述为预制囊泡法。Kulkarni等人的新研究揭示，颗粒形成和核酸装载是模块化和可分离的步骤。原则上，PFV最初是通过将乙醇溶解的脂质与酸性水缓冲液混合生成的。随后，将这些PFV与siRNA结合，实现了高效包封。所得的包封效率和颗粒特性与常规制备的LNP相当。冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）和动态光散射（DLS）显示，siRNA触发囊泡膜重组，导致破裂和多层重排，这被描述为囊泡反转机制。功能分析证实，PFV系统有效实现了与标准LNP相当的基因沉默水平。提出的机制模型表明，siRNA在带正电荷的囊泡之间充当分子拉链，促进融合和双层重新形成，直到pH中和稳定最终的纳米颗粒结构。这些发现对个性化医疗具有重要意义。PFV可以储存，并根据需要与核酸结合，无需专门的混合设备。它们还将核酸材料需求减少了100倍以上。据我们所知，Ding等人在2021年首次描述了mRNA的可比技术。在一个简化的配方中，空LNP通过纳米沉淀法使用乙醇脂质溶液制备。然而，该研究的重点主要不在于配方方法本身，而在于评估新合成的可电离脂质。开发了一系列LNP配方，通过系统改变所用可电离脂质的胺头基结构来优化mRNA递送。在测试的候选物中，含有基于精胺脂质的114-iLNP表现出优越的性能。在体外，114-iLNP在HeLa细胞中实现了>95%的转染效率。共聚焦成像证实了有效的内体逃逸和均匀的细胞质mRNA分布。在体内，静脉注射负载荧光素酶mRNA的114-iLNP产生了强烈的肝脏定位的生物发光。此外，114-iLNP有效递送人促红细胞生成素（hEPO）mRNA，诱导了强大、剂量依赖性的血清hEPO水平，主要在肝脏表达。在后续研究中，同一研究小组进一步应用和优化了这种方法来筛选更多新型脂质材料。Eygeris等人将两步配方方法推进，其中mRNA被装载到PFV中（PFV-LNP）。在该方法中，纳米颗粒组装和核酸的包封是分离的过程。首先，通过将乙醇溶解的脂质与酸性水缓冲液混合生成PFV，然后将其透析到柠檬酸盐缓冲液（pH值4.0）中。通过随后的微流控混合，将mRNA装载到PFV中。最后，中和pH值以稳定颗粒。这种PFV-LNP策略产生了尺寸均匀（约200纳米）且具有多层结构的纳米颗粒，通过cryo-TEM确认。值得注意的是，尺寸在mRNA捕获后增加，翻倍。然而，这些结果是Eygeris等人的研究所特有的，并有利于他们的应用。其他使用mRNA PFV的研究小组报告生成了更小的LNP，突显了工艺开发的关键作用。重要的是，该过程在mRNA处理过程中不需要乙醇暴露或加热。所得方法证明了与按需和去中心化mRNA配方的兼容性。在体内，与常规配制的LNP对照颗粒相比，PFV-LNP在静脉注射后实现了较低的蛋白质表达水平。值得注意的是，在视网膜下给药后，PFV-LNP将EGFP转染增加了高达50%，代表了局部给药的显著益处。该方法被Duffrène等人进一步调整和简化，他们通过微流控混合制备PFV，随后在单独的步骤中添加mRNA，通过微流控或手动混合。这种方法最大程度地减少了mRNA损失，证明了其对于小规模或资源受限应用的有用性。所得纳米颗粒始终表现出良好的特性，尺寸小于150纳米，低多分散性（PDI < 0.2），包封效率高于90%。体外转染和体内蛋白质表达都与常规配制的LNP相当。该方法揭示了在不同缓冲液和可电离脂质类型中的广泛适用性。值得注意的是，PFV在4°C下保持稳定至少四周，实现了灵活的、按需的mRNA装载。总的来说，这种方法为mRNA-LNP生产提供了一个稳健的模块化平台，非常适合个性化应用和高通量筛选工作流程。Wang等人最近的一项研究进一步采用了涡旋混合法，其中将mRNA溶液添加到预先形成的空LNP中。作者系统地研究了不同缓冲系统和pH条件如何影响mRNA与LNP的结合。所得颗粒保持较小（< 150纳米），多分散性低（< 0.3），mRNA在4°C下稳定结合至少一周。在体外，基于S-Ac7-DOG的LNP在HEK293T和MC38细胞中实现了高转染效率（> 90%），与常规配制的LNP性能相当。共聚焦显微镜证实了有效的细胞摄取和内体逃逸。在体内，在肌肉中注射负载荧光素酶mRNA的LNP在小鼠中在注射部位产生了强烈的局部生物发光，几乎与标准LNP配方匹配。Akita小组开发了一种使用即用型冻干配方用于mRNA负载LNP的形成后包封方法。在该方法中，首先通过微流控将乙醇溶解的脂质与酸性缓冲液混合来生产空LNP。随后进行缓冲液交换和冻干。然后，最终用户能够通过用mRNA溶液重新水化冻干的LNP并将混合物在75°C下孵育5分钟来包封mRNA。该过程实现了高包封效率（> 90%），并产生了物理化学和功能特性与常规制备配方相当的LNP。原则上，加热促进脂质流动性和颗粒内重组，模拟溶剂介导的包封机制。这种模块化策略消除了最终使用点对乙醇或专门设备的需求，为核酸递送提供了一个可扩展、可及的替代方案。此外，与先前Kulkarni等人描述的方法不同，该过程现在侧重于mRNA而不是siRNA，这拓宽了其潜在应用。在他们最近的研究中，Tanaka等人介绍了一种改进的mRNA-LNP配方形成后包封方法，无需加热。这解决了他们早期冻干方法的一个关键限制。先前的方法需要将温度控制在≥75°C以实现脂质重排和mRNA包封。相比之下，新的液体基系统能够在室温下通过简单混合将mRNA装载到预先形成的、无乙醇的LNP中。这种方法在机制上依赖于mRNA在带正电荷的LNP上的静电吸附，然后是mRNA桥接的颗粒间融合。该过程在pH值约为6.0时最佳发生。这与2023年描述的方法中热触发的颗粒内重组形成对比。作者证明，该过程实现了高包封效率（> 80%），无需高温，且所得LNP保持了良好的物理化学特性，如尺寸约100纳米，PDI < 0.2。在体内，这些LNP实现了高效且肝脏特异性的荧光素酶表达，与乙醇配制的对照相当。重复给药疫苗候选物诱导了强烈的抗原特异性IgG反应。这些结果证实，精细化的液相形成后包封方法为mRNA-LNP生产提供了一种简单、稳健且生物相容性的替代方案。Streiber等人通过引入一种新的、基于水性缓冲液的无有机溶剂LNP配方策略，称为“蓝色脂质纳米颗粒”（BLNP），推进了该领域的发展。该策略使得能够在不使用乙醇、胆固醇或加热的情况下，将mRNA和pDNA高效地形成后包封到预先形成的纳米结构中。该方法使用超声辅助的水混合来生成预形成的纳米结构（PFN）。然后在酸性pH值下通过静电吸附和基于融合的包封装载核酸。最后，通过中和稳定颗粒。该配方产生了均匀的纳米颗粒（170至190纳米），具有高包封效率（> 75%）和强大的转染性能，达到超过90%的绿色荧光蛋白（GFP）表达和94%的CRISPR-Cas9敲除效率。有趣的是，BLNP方法在体内被证明增强了肝外和脾脏递送。这可以通过胆固醇的缺失来解释，胆固醇在常规LNP中诱导载脂蛋白E（ApoE）的附着。ApoE通过肝脏中的LDL受体介导颗粒在肝细胞中的特异性摄取。与先前描述的方法相比，该过程避免了乙醇作为有机溶剂，并完全在水性环境中生成预形成的结构。该研究证明了用于个性化应用的小规模、模块化生产的可行性，是形成后包封方法开发中最新的例子之一。然而，该过程依赖于脂质的超声处理以形成PFN。尽管超声处理是一种成熟的、有效的纳米颗粒形成方法，但需要审慎考虑，因为超声处理可能导致脂质的氧化和降解。因此，必须仔细控制该过程以避免损害脂质完整性。此外，省略胆固醇可能与降低的转染效率有关。然而，创新的脂质，如研究中展示的CHEMS-PMeOx52，可能有助于克服这些缺点。该脂质具有更高的水溶性，并能提供类似的结构功能。它也与无溶剂配方策略兼容，并可以作为结合胆固醇样和隐形特性的双功能脂质。总而言之，形成后方法提供了若干优势，特别是在整合核酸的灵活性和模块化的“一刀切”概念方面。这些优势可能使得能够使用一个经过充分表征的LNP批次，随后通过形成后混合与不同的核酸结合，以创建个性化的、患者特异性的疗法。然而，不能忽视关键参数，如颗粒大小、PDI和包封效率。这些方法需要进一步优化，以持续实现低于0.2的PDI值。同时，实现高包封效率仍然是一个挑战，因为已建立的制造流水线通常达到约95%的值，这是此处讨论的所有方法尚未达到的水平。此外，尽管许多方法采用了溶剂关键性的叙述，但许多PFV仍然是从乙醇脂质溶液中常规制备的。
5.2. 钙依赖性DNA-脂质体形成
2002年，Mozafari等人是首批重新考虑阴离子脂质体作为广泛使用的阳离子LNP配方替代品的研究者之一。2007年，Mozafari研究小组改进了他们制备用于质粒DNA递送的阴离子脂质体的方法，避免了挥发性溶剂和去垢剂的使用。由DPPC、DCP和胆固醇以70:20:10摩尔比组成的脂质体采用改进的加热技术制备。将脂质分散在PBS（pH 7.4）中并在氮气下水化。首先，在3%甘油存在下，在120°C溶解胆固醇。然后，在60°C加入DPPC和DCP。搅拌后，将所得脂质体悬浮液冷却至室温，并在4至5°C下在氮气中储存。pDNA通过Ca2+诱导的与膜融合被包封在这些阴离子脂质体中。与早期在脂质体形成后将DNA和Ca2+加入导致主要表面结合和囊泡聚集的方法相比，改进的加热方法在脂质体组装过程中结合了基因装载。在该方法中，DNA在45°C时加入，此时脂质结构仍具有流动性或未完全形成。这个时机有利于DNA的有效内化，从而实现了81%的包封效率。这种增强的包封可归因于脂质灵活性的提高和囊泡在超过相变
