基于AlphaFold的结构引导方法，识别针对Kyasanur森林病病毒的NS5 RdRp蛋白的抗病毒先导化合物

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：AlphaFold-Driven Structure-Guided Identification of NS5 RdRp-Targeting Antiviral Leads Against Kyasanur Forest Disease Virus

　　K. Ajith Kumar | Niranjana Rajesh | Leona Dcunha | Jaya Bisht | R. Jasmine | Divyanshu Mishra | T.K. Varun | J. Abhithaj | Dileep Francis
分子建模设施，生命科学系，生物与法医科学学院，Kristu Jayanti（被认定为大学），班加罗尔，印度 – 560077

**摘要**
目前尚无批准的抗病毒治疗方法，Kyasanur森林疾病病毒（KFDV）仍然是一种严重且被忽视的蜱传黄病毒，对印度公共卫生构成重大威胁。为解决这一治疗空白，我们采用了基于AlphaFold的结构建模技术，并结合基于结构的先导化合物识别方法，针对病毒NS5蛋白的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）结构域进行研究。预测的NS5模型具有较高的结构可信度，pLDDT得分接近90，pTM得分为0.8，并通过Verify3D、PROCHECK和ERRAT进行了进一步验证。结构分析显示，该蛋白具有保守的MTase–RdRp组织结构，包含典型的A–G基序和必需的催化天冬氨酸残基，与蜱传脑炎病毒等相关黄病毒的结构非常相似。我们使用Schr?dinger Maestro实现了基于结构的虚拟筛选流程，评估了来自DrugBank和MedChem库的1,388种化合物。初步筛选采用Glide Extra Precision（XP）对接方法，随后通过Induced-Fit Docking（IFD）方法筛选出与关键催化残基结合的高亲和力化合物。通过200纳秒的分子动力学模拟以及模拟后的MM/GBSA结合自由能计算，评估了选定复合物的稳定性和动力学特性。在鉴定出的化合物中，Enoxaparin表现出较低的构象偏差（RMSD约为2.80 ?；RMSF约为1.32 ?）、增强的活性位点刚性以及有利的结合自由能（?63.12 kcal/mol），表明其能有效限制病毒复制所需的RdRp灵活性。尽管这些化合物的药物特性尚不理想，但它们为进一步优化提供了有希望的骨架。总体而言，本研究提出了一个稳健的计算框架和候选先导化合物，以支持针对KFDV的实验验证和抗病毒药物开发。

**引言**
Kyasanur森林疾病病毒（KFDV）是一种被忽视的人畜共患病黄病毒，属于Flaviviridae科Orthoflavivirus属，被归类为新兴传染性病原体。由于其高致病性、缺乏有效的治疗措施以及最近的再次出现，KFDV目前被列为生物安全等级4的病原体。在过去十年中，随着基因相关病毒变体的出现，KFDV在全球范围内的公共卫生重要性日益增加，这些变体包括Alkhurma出血热病毒（AHFV）、Karshi病毒（KSIV）和Royal Farm病毒（RFV），这些病毒在沙特阿拉伯、埃及、乌兹别克斯坦和阿富汗等国家出现，凸显了该病毒的全球地理扩散和多样性。KFDV是印度的一种地方性病毒，1957年首次在卡纳塔克邦Shivamogga区的Kyasanur被发现。此后，该病毒已悄然扩散到其他邦，包括马哈拉施特拉邦、喀拉拉邦、泰米尔纳德邦、果阿邦和西孟加拉邦，基因组分析证实了这一点。尽管发现已有68年，但由于缺乏治疗基础设施和监测不足，KFDV仍然构成重大威胁。该病毒主要由Haemaphysalis spp.（主要是H. spinigera）感染蜱虫传播，形成动物和人类之间的循环传播，其中受感染的动物作为次级传播媒介，而人与人之间的传播尚未观察到。感染通常表现为急性发热病（AFI），其特征是高烧、前额头痛、严重虚弱、结膜炎、肝肿大、肌肉疼痛、脾脏中的红细胞吞噬作用以及黏膜出血，在后期可能出现严重的神经系统并发症。报告的病例死亡率为10-20%，主要在12月至5月的干旱月份爆发。2000年至2019年间，印度每年报告近500例病例，但最近估计每年病例数减少到约100例，这可能是由于监测不足和误报所致，这种情况在KFDV主要流行的热带和地区较为常见。目前尚无针对KFDV的特异性抗病毒治疗方法。体外研究表明，几种广谱抗病毒药物（如NITD008、Sofosbuvir、Favipiravir和Remdesivir）对KFDV及相关黄病毒具有抑制作用，但临床前研究显示这些药物存在系统毒性及不良反应（包括肝毒性、胃肠道效应和中性粒细胞减少），阻碍了其作为临床治疗药物的广泛应用。疾病管理主要依赖于支持性和对症治疗，如退热药和止痛药，以及在出血情况下输注血小板。此前曾使用福尔马林灭活疫苗作为预防措施，但研究表明接种疫苗的个体仍可能被感染。鉴于这些限制，迫切需要识别和开发更安全、更有效的抗病毒干预措施来管理和治疗KFDV。

**病毒特性**
KFDV是一种有包膜病毒，含有10,774个核苷酸碱基的正链单链RNA，编码一个前体多聚蛋白，该多聚蛋白经病毒和宿主蛋白酶处理后形成三种结构蛋白和七种非结构蛋白（NS蛋白）。结构蛋白包括衣壳（C）、前膜（prM）/膜蛋白和包膜（E）蛋白，而NS蛋白包括NS1、NS3、NS2A、NS2B、NS4A、NS4B和NS5，参与病毒复制机制、免疫逃逸和多聚蛋白加工。其中，NS5是黄病毒中最大且保守性最强的蛋白，在病毒复制和免疫逃逸中起核心作用。NS5包含两个酶结构域：N端的甲基转移酶（MTase）结构域，对病毒基因组的RNA加帽至关重要；C端的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）结构域，主要负责病毒复制和病毒颗粒在宿主体内的增殖。阻断RdRp结构域可有效抑制病毒复制、翻译和免疫逃逸，使其成为理想的药物靶点。然而，目前PDB中尚无KFDV全长NS5蛋白的实验解构晶体结构。

**蛋白质结构预测的最新进展**
特别是AlphaFold2平台在蛋白质结构预测方面取得了接近实验水平的准确性，超越了传统结构预测工具。利用其高精度，可以将KFDV NS5的预测结构与先进的计算机辅助药物发现（CADD）工具结合，以识别潜在的有效且安全的药物。据我们所知，本研究首次报道了使用AlphaFold2预测的KFDV NS5全长结构，并采用基于结构的虚拟筛选策略针对RdRp结构域进行筛选，从DrugBank和MedChem库中筛选出1,388种抗病毒和候选化合物，为进一步的实验验证和KFDV特异性抗病毒药物开发提供了理论基础。

**数据与软件可用性**
本研究使用的所有序列数据均公开可用。Kyasanur森林疾病病毒（KFDV）基因组序列来自UniProt（访问ID：D7RF80），NS5编码区（2514-3416）由此序列获得，并作为结构预测的最终输入序列。我们采用这种方法是为了与Achappa等人2025年描述的参考序列保持一致，他们通过BLAST序列比对从完整基因组中鉴定出NS5编码序列。

**KFDV NS5结构的评估与分析**
KFDV NS5结构使用ColabFold进行预测，生成了五个模型及其相应的置信度指标。预测模型的排名如下：模型2（排名1）、模型5（排名2）、模型4（排名3）、模型3（排名4）和模型1（排名5）。多序列比对（MSA）显示约有1200个序列用于预测，但序列覆盖度在蛋白质长度上存在差异，前100个氨基酸的覆盖度较高。

**讨论**
KFDV及其变种的持续出现，加上治疗和管理的局限性，使得寻找针对该病毒的抗病毒候选药物变得至关重要。本研究旨在鉴定一种能抑制病毒NS5蛋白RdRp结构域的有效结构先导化合物，该结构域对病毒基因组的合成和在宿主体内的复制至关重要。

**结论**
本研究提供了KFDV NS5蛋白的高置信度AlphaFold预测结构，详细揭示了其结构组织和功能特征。预测模型显示出强烈的残基置信度和与相关黄病毒家族NS5蛋白一致的良好全局结构指标，支持其用于进一步计算分析的可靠性。综合结构分析、分子对接和MDS结果表明……

**作者贡献声明**
Ajith Kumar K：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、监督、方法学、正式分析、数据管理。
Niranjana Rajesh：撰写 – 原始草稿撰写、方法学、调查、正式分析。
Leona Dcunha：撰写 – 原始草稿撰写、方法学、正式分析。
Varun T K：方法学、正式分析。
Abhithaj J：撰写 – 审稿与编辑、项目管理。
Dileep Francis：监督、项目管理、方法学、概念构思。
Jaya Bisht：撰写 – 数据与软件管理。

**致谢**
作者感谢印度班加罗尔Kristu Jayanti（被认定为大学）生命科学系提供的分子建模设施支持，以及印度Mangalore Yenepoya（被认定为大学）CIODS计算设施提供的计算支持。