《Journal of Proteome Research》：Offline Two-Stage SEC and LC-MS/MS for Comprehensive Characterization of Yeast Ribosomal Populations
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安德鲁·J·斯皮特里（Andrew J. Spiteri）|乔舒亚·J·哈米（Joshua J. Hamey）|马克·R·威尔金斯（Marc R. Wilkins）系统生物学研究小组，生物技术与生物分子科学学院，澳大利亚新南威尔士州悉尼市，邮编2052我们介绍了一种二维尺寸排阻色
安德鲁·J·斯皮特里（Andrew J. Spiteri）|乔舒亚·J·哈米（Joshua J. Hamey）|马克·R·威尔金斯（Marc R. Wilkins）
系统生物学研究小组，生物技术与生物分子科学学院，澳大利亚新南威尔士州悉尼市，邮编2052
我们介绍了一种二维尺寸排阻色谱串联质谱（2D-SEC MS/MS）技术，该技术将两种兼容质谱分析的尺寸排阻色谱步骤与自下而上的蛋白质组学方法相结合，用于快速、高分辨率地分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的核糖体。在现有的Ribo Mega-SEC协议基础上，我们发现使用1000 ?柱子进行的尺寸排阻色谱分析能够将完整的多聚核糖体与80S/60S/40S混合颗粒分离；将分离得到的80S/60S/40S混合物重新注入到500 ?柱子中后，可以进一步分离出单体的60S和40S亚基组分。因此，该方法能够在90分钟内获得四种不同的核糖体亚群。对2D-SEC分离得到的组分进行自下而上的液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析显示，该方法能够识别多聚核糖体组分中的79种核心核糖体蛋白中的78种，平均序列覆盖率为93%；同时还能区分并定量38对同源蛋白中的36对，揭示了不同亚型的特异性结合偏好。此外，该方法还能定位所有12个已知的酵母核糖体甲基化位点以及两个典型的磷酸化位点，从而实现针对这些位点的翻译后修饰研究。将该技术应用于研究营养匮乏条件下的核糖体以及RPL7A基因敲除后的核糖体变化，我们发现2D-SEC MS/MS能够检测到多聚核糖体的快速解体及其组成比例的变化，证明了该方法在将核糖体组成与功能变化联系起来方面的有效性。
