基于纳米孔长读长宏条形码技术的宿主寄生线虫群落全景表征：开发与诊断验证研究

《The Lancet Microbe》：Nanopore long-read metabarcoding for comprehensive characterisation of parasitic nematodes in humans and animals: a development and diagnostic validation study

　　

背景：脊椎动物寄生线虫对人类与动物健康构成沉重负担，但现有精准鉴定工具仍十分匮乏。宏条形码（metabarcoding）技术可通过单次检测实现样本中全部寄生线虫的群落表征，即线虫组（nemabiome）分析，然而早期版本无法覆盖粪类圆线虫属（Strongyloides）和毛首线虫属（Trichuris）等重要类群。为此，研究人员旨在开发一种可覆盖所有寄生线虫的新型线虫组检测方法，以支持人与动物的精准防控。 方法：在这项开发与诊断验证研究中，研究人员采用比较分子靶点策略筛选最优条形码基因，构建可同时检测样本中全部脊椎动物寄生线虫的新型线虫组检测体系。检测体系开发阶段使用来自10个国家的154份阳性对照样本的DNA；诊断验证阶段使用亚太地区生物样本库中190份现场粪便样本，包括瓦努阿图采集的95份人源样本与柬埔寨采集的95份犬源样本。研究依托牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）的长读长测序能力保障高分类分辨率，并以定量PCR（qPCR）为参照，采用Cohen’s kappa（κ）统计量及诊断灵敏度、特异度评估检测性能。 结果：研究人员筛选出适用于线虫演化支Ⅰ和Ⅳ的18S核糖体DNA（18S rDNA）以及适用于演化支Ⅲ和Ⅴ的内部转录间隔区（ITS）作为条形码区域。阳性对照验证证实该体系可覆盖全部寄生线虫演化支的24个不同属。现场样本检测显示，该线虫组检测体系共检出72份阳性犬样本（76%）与57份阳性人样本（60%），并识别到多种跨宿主的人兽共患类群。与qPCR相比，该体系的诊断特异度为99.6%（95% CI 98.8–99.9），诊断灵敏度为86.0%（95% CI 81.4–89.9），一致性达到高度一致（κ≥0.81）或基本一致（κ≥0.69）。此外，该体系检出的寄生线虫物种数（11种）显著高于传统分子方法。 解读：该线虫组检测体系为精准表征感染人与脊椎动物的寄生虫群落（混合感染）提供了系统性解决方案。与目标特异性分子方法（如qPCR）不同，该方法可发现此前未被识别的寄生虫，包括人兽共患类群与隐存种，并可解析宿主间传播路径与动物储存宿主。将该技术拓展至更多宿主类群与地理区域，有望强化寄生虫防控规划，提升对新发与再现寄生虫威胁的应对能力。

本研究由Lucas G Huggins、Neil D Young等学者完成，发表于《The Lancet Microbe》，针对寄生线虫诊断工具不足的现状，开发了基于纳米孔长读长测序的新型线虫组（nemabiome）检测体系，实现了人与动物粪便样本中全谱系寄生线虫的高分辨率同步检测。

研究背景方面，寄生线虫引发的土壤传播蠕虫病影响全球超15亿人，尤其在低收入国家造成营养不良、贫血与认知发育受损等严重健康负担；在畜牧业中则导致巨大的生产力与经济损耗。当前防控高度依赖少数驱虫药，而传统显微镜法灵敏度与特异性不足，难以区分形态相似的虫种，尤其无法鉴别人兽共患类群；常规或定量PCR（qPCR）虽性能较好，但仅能检测预设靶标，无法发现未知或新发病原体。自2015年起发展的短读长线虫组测序技术仅覆盖有限类群，且未在人类样本中优化验证，无法检测粪类圆线虫属、毛首线虫属等关键病原体，严重限制了其在公共卫生领域的应用。因此，开发一种可全面、精准表征人与动物寄生线虫群落的检测工具具有重要科学与防控价值。

关键技术方法上，研究人员首先基于公开数据库比较18S rDNA与ITS区域的种间核苷酸多样性，针对不同线虫演化支选择最优扩增靶点并设计通用引物。研究使用154份经形态学与分子方法确认的阳性对照样本（含粪便与成虫组织）进行引物筛选与体系优化。诊断验证阶段采用亚太地区现场样本队列，包括瓦努阿图95份人源粪便与柬埔寨95份犬源粪便。测序使用牛津纳米孔MinION或PromethION 2平台，结合双轮PCR与样本条码化实现多重文库构建。生物信息分析采用NanoCLUST流程校正测序错误并生成一致性序列，基于自建分类数据库进行物种注释，最终以qPCR为参照计算诊断性能指标。

研究结果部分，分子靶点筛选显示：18S rDNA在演化支Ⅰ和Ⅳ中变异适中，适合作为该类群标记；ITS区域在演化支Ⅲ和Ⅴ中种间差异显著，更适合精细分类。最终确定的引物组合可实现600–1600 bp片段的稳定扩增，覆盖全部寄生线虫演化支。阳性对照验证证实，该体系可准确识别24属39种寄生线虫，包括此前难以检测的粪类圆线虫属与毛首线虫属，且与参考序列一致性普遍高于99%。现场样本检测显示，人类样本中检出7种线虫，总感染率为60%，其中22%为混合感染，最多同时存在4种虫种；犬样本中检出8种线虫，总感染率达76%，43%为混合感染，最多共存5种虫种。人犬样本中均检测到人兽共患类群，如马来布鲁克线虫（Ancylostoma ceylanicum）与粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）。与qPCR的一致性分析表明，该体系对多数虫种的κ值达0.81以上，诊断特异度普遍超过95%，整体特异度为99.6%，灵敏度为86.0%，并能额外检出qPCR未覆盖的管形线虫（Eucoleus aerophilus）与狼旋尾线虫（Spirocerca lupi）等物种。

讨论与结论部分，研究人员指出，该新型线虫组检测体系首次实现了对全部寄生线虫演化支的全面覆盖，突破了既往技术无法检测关键人兽共患类群的瓶颈。通过结合18S与ITS双靶点，体系兼顾了广谱覆盖与精细分类能力，可有效解析混合感染结构，支持人兽共患传播链追踪。相较于WHO推荐的显微镜法，该体系可准确区分形态相似的钩虫与鞭虫，尤其对粪类圆线虫等漏检率高的病原体具有高灵敏度。尽管成本高于qPCR，但其无偏检测能力可发现未知或隐存种，避免因漏诊导致的防控失效。研究人员同时指出，该体系受宿主饮食、扩增偏好等因素影响，读数比例不能直接反映原始群落组成，且对低载量感染的灵敏度仍有提升空间。总体而言，该研究为寄生线虫流行病学调查提供了强有力的工具，可在“同一健康（One Health）”框架下解析宿主-寄生虫互作、动物储存宿主作用与新发病原风险，为精准防控策略制定提供关键科学依据。