一种高效、基于荧光的病毒中和检测方法，用于检测与肝炎-心包积液综合征及包涵体肝炎相关的禽腺病毒

《Poultry Science》：A highly efficient fluorescence-based virus neutralizing test for fowl adenoviruses associated with hepatitis-hydropericardium syndrome and inclusion body hepatitis

　　白玉王|齐龙桥|明和徐|宁莉|盼盼杨|燕芳聪|冬冬杨|建丽李|克祥宇|俊赵
中国河南省郑州市450046，河南农业大学兽医学院

**摘要**
禽腺病毒（FAdVs），特别是与肝水肿综合征（HHS）相关的FAdV-4，以及与包涵体肝炎（IBH）相关的FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11，对全球禽业构成了重大威胁。目前检测针对这些病毒的中和抗体的金标准是传统的病毒中和试验（VNT），该方法依赖于对细胞病变效应的主观视觉评估。这种方法耗时、通量低且易受观察者差异的影响，因此迫切需要一种快速、客观且高通量的替代方法。利用逆转录遗传系统，我们构建了表达绿色荧光蛋白ZsGreen的FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11的重组报告病毒。这些带有荧光标记的病毒被用于开发一种基于荧光的快速病毒中和试验（F-VNT）。该试验通过感染细胞培养中绿色荧光的减弱来量化中和滴度，从而实现客观和自动化的读数。值得注意的是，这种新测试在感染后24小时内即可得出结果，比传统的VNT快得多。此外，该方法还用于研究抗FAdV-8a、-8b、-11和-4血清之间的交叉中和作用。结果表明，抗FAdV-8a和-8b抗体具有高度交叉中和活性，而抗FAdV-11抗体对FAdV-8a和-8b没有中和作用。所开发的F-VNT为检测与HHS和IBH相关的FAdVs提供了一个快速、准确且高通量的平台。这种方法相比传统VNT有显著改进，非常适合大规模血清流行病学研究和疫苗效果评估。本研究还为开发针对HHS和IBH的多价疫苗的抗原选择提供了理论指导。

**引言**
禽腺病毒（FAdVs）是导致全球禽类养殖业重大经济损失的重要病原体。根据基因组序列和血清交叉中和试验，FAdVs目前被分为五个种类（FAdV-A至FAdV-E），并进一步分为12个血清型（FAdV-1至FAdV-8a和FAdV-8b至FAdV-11）（Benk?等，2022）。在各种FAdV血清型中，FAdV-4是引起肝水肿综合征（HHS）的主要病原体，该疾病的特点是心包积水、肝炎和高死亡率（Schachner等，2018，2021）。相比之下，FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11常与包涵体肝炎（IBH）相关，这是一种急性肝脏疾病，其特征是在肝细胞中形成核内包涵体（Steer-Cope等，2017；?ahindokuyucu等，2020）。IBH和HHS都表现为幼鸟发病迅速且死亡率极高。已经开发了多种疫苗平台，包括灭活疫苗（Kim等，2014；Meng等，2019）、亚单位疫苗（Shah等，2012；Ruan等，2018；Wang和Yuan，2025）以及重组病毒载体疫苗（Wang等，2022；Song等，2023；Liu等，2025），以预防和控制HHS和IBH。然而，目前仍缺乏能够有效评估这些疫苗候选物种免疫原性和保护效果的高通量血清学或细胞学检测方法。

鉴于FAdVs共感染的发生率不断增加以及现有疫苗对不同血清型的有效性不一（Stoute等，2025），有效监测这些病毒和评估疫苗诱导的免疫力在很大程度上依赖于检测血清型特异性的中和抗体（NAbs）。可以使用多种血清学方法来检测NAbs，如病毒中和试验（VNT）和免疫荧光测定（IFA）（Feichtner等，2018；Rocha等，2023）。传统的病毒中和试验（VNT）仍然是最广泛认可的金标准方法，用于NAbs的检测和疫苗保护效果的评估。然而，传统VNT存在一些固有的局限性：其终点判断基于对病毒诱导的细胞病变效应（CPE）的主观显微镜观察，可能导致不同技术人员之间的解释不一致。此外，传统VNT是一个劳动密集型且耗时的过程，通常需要3到7天才能观察到明显的CPE。这些限制使其不适合高通量检测，而现代禽业对快速诊断和大规模监测的需求日益增加（Schachner等，2018）。

为了解决这些挑战，表达荧光或发光蛋白的报告病毒已成为开发快速和定量中和试验的强大工具。本研究的目的是开发并验证一种针对主要与HHS和IBH相关的FAdVs的高效荧光病毒中和试验（F-VNT）。利用之前构建的FAdV逆转录遗传系统，我们生成了表达ZsGreen荧光蛋白的重组FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11病毒作为报告病毒。本报告描述了这些报告病毒在快速、客观和高通量F-VNT中的应用。

**材料与方法**
**细胞、病毒、大肠杆菌菌株和质粒**
用于病毒增殖的Leghorn Male Hepatocellular（LMH）细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，培养条件为37°C和5% CO2。
FAdV-4菌株CH/HNJZ/2015（GenBank登录号KU558760）由我们的团队从中国河南省患有HHS的鸡中分离得到（Zhang等，2018）。FAdV-8b菌株CH/SDQD/2021（GenBank登录号OQ225144）和FAdV-8a菌株SDQD/2023（GenBank登录号OR901942）分别于2021年和2023年从中国山东省患IBH的鸡的肝脏中分离得到（Qiao等，2024c）。FAdV-11菌株FJSW/2021（GenBank登录号OK336458）于2021年从中国福建省患IBH的鸡的肝脏中分离得到（Qiao等，2024a）。FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11的逆转录遗传平台已在我们的先前出版物中描述（Zhang等，2018；Qiao等，2024a；c），FAdV-8a的逆转录遗传平台也是采用类似策略构建的。报告病毒rFAdV-8b-ZsGreen和rFAdV-11-ZsGreen分别使用已建立的FAdV-8b和FAdV-11逆转录遗传平台构建。在两种构建中，ORF11区域被替换为编码Zoanthus sp.绿色荧光蛋白（ZsGreen）的基因，如我们之前发表的研究中所描述（Qiao等，2024b；c）。此外，大肠杆菌菌株GB05-dir（对ccdB敏感）和GBred-gyrA462（对ccdB耐药），以及含有ampicillin-ccdB选择 cassette的质粒pR6K-Amp-ccdB由山东大学的王海龙教授提供。

**重组报告病毒的构建**
应用两步无缝DNA重组技术，使用相应的逆转录遗传平台生成了重组报告病毒rFAdV-4-ZsGreen和rFAdV-8a-ZsGreen（Wang等，2014）。将一个包含5’端CMV启动子和3’端BGH多聚腺苷酸化信号的ZsGreen表达 cassette插入FAdV-4基因组的天然1966-bp缺失位点。对于FAdV-8a，使用相同的cassette替换其ORF11区域。首先，将FAdV-4的1966-bp缺失位点或FAdV-8a的ORF11区域插入或替换到大肠杆菌GBred-gyrA462中的Amp-ccdB选择 cassette中。使用针对选定位点侧翼区域的同源引物，以及SwaI限制性酶切位点和amp-ccdB表达 cassette特有的序列（表1），从模板质粒pR6K-amp-ccdB中扩增Amp-ccdB选择 cassette。通过凝胶提取纯化后，将扩增的cassette和相应的感染性克隆（p15A-cm-FAdV-4或p15A-cm-FAdV-8a）共电穿孔到E. coli GBred-gyrA462中，通过Redα/β介导的同源重组。通过氯霉素和氨苄西林筛选出阳性克隆，得到中间构型p15A-cm-FAdV-4-1966/Amp-ccdB和p15A-cm-FAdV-8a-ΔORF11/Amp-ccdB。随后，将每个构型中的Amp-ccdB cassette替换为ZsGreen表达 cassette。为此，使用SwaI酶切上述中间质粒以切除Amp-ccdB cassette。同时，使用含有相应插入位点同源臂的引物扩增ZsGreen表达 cassette（表1）。根据制造商的协议，使用NEBuilder? HiFi DNA Assembly kit将纯化的ZsGreen扩増子和SwaI线性化的载体组装后电穿孔到GB05-dir中。用氯霉素筛选转化体，并通过ccdB毒素进行反向筛选，得到最终质粒：p15A-cm-FAdV-4-1966/ZsGreen和p15A-cm-FAdV-8a-ΔORF11/ZsGreen。两种构型均通过EcoRI限制性酶切和测序进行验证。

**表1. 报告病毒构建的引物**
| Primer | Primer序列（5′–3′） |每种抗血清均经过热灭活处理，并使用添加了1%抗生素的DMEM/F12培养基进行两倍连续稀释，最终体积为50 μL。向每种血清稀释液中加入等体积的预定最佳病毒剂量。混合后，将病毒-血清复合物在37°C下孵育1小时以进行中和，然后转移到96孔板中的LMH细胞单层上。培养板在37°C和5% CO2条件下孵育，直到24小时后观察到荧光信号。中和抗体滴度记录为完全抑制报告基因病毒诱导的荧光的最高血清稀释度的倒数。根据Archetti和Horsfall公式计算病毒血清型之间的抗原相关性（R）：R = (r1 × r2)1/2，其中r1表示异源中和（抗血清对病毒A与病毒B）与同源中和（抗血清对病毒A与病毒A）的滴度比，r2表示相应的倒数比（抗血清对病毒B与病毒A相对于其同源滴度的比值）。R值接近1表示两种病毒之间的抗原相似性很高。

与传统的VNT相比：
实验室中准备了针对FAdV-4、-8a、-8b和-11的不同抗体滴度的血清型特异性抗体。总共使用了40种抗体（每种血清型10种）来评估新的F-VNT与传统VNT之间的相关性。在传统VNT中，抗体先进行热灭活处理，然后进行两倍连续稀释，再与200 TCID50的亲本株FAdV-4、-8a、-8b和-11在37°C下孵育1小时。然后将混合物应用于LMH细胞单层。病毒吸附2小时后，吸除接种物并替换为维持培养基。在96小时时通过光学显微镜检查CPE。中和滴度定义为防止50%细胞出现CPE的最高血清稀释度的倒数，使用Reed-Muench方法确定。对于已建立的F-VNT，以相同方式稀释抗体，与相应的病毒混合，并按前述方法进行检测。使用Pearson相关系数分析两种方法获得的NAb滴度之间的吻合度。

数据分析：
通过Pearson相关性分析F-VNT与传统VNT获得的滴度之间的相关性。统计评估在GraphPad Prism（版本10.0）中进行。对于涉及多个组的比较，应用了一元方差分析（one-way ANOVA），p < 0.05被认为是统计学显著的，p > 0.05报告为不显著（ns）。每个实验的结果汇总为平均值±标准差。

重组报告基因病毒的表征：
为了建立基于荧光的FAdV不同血清型的VNT，使用无缝DNA重组技术和FAdV反向遗传平台构建了重组荧光报告基因病毒。对于FAdV-4，将ZsGreen表达 cassette插入其自然的1966-bp缺失区域；对于FAdV-8a、-8b和-11，用ZsGreen cassette替换ORF11基因（图1A）。相应的重组病毒rFAdV-4-ZsGreen、rFAdV-8a-ZsGreen、rFAdV-8b-ZsGreen和rFAdV-11-ZsGreen在LMH细胞中成功拯救，通过检测CPE和荧光信号、PCR扩增以及测序得到确认。这些报告基因病毒在LMH细胞培养中高效复制，并且早在12小时后就表现出强烈的绿色荧光，在24小时达到峰值强度（图1B）。荧光易于检测，能够清楚地区分感染细胞和未感染细胞。报告基因病毒的生长动力学与其各自的亲本株相当（图1C）。通过20次连续传代在LMH细胞中验证了报告基因病毒的遗传稳定性，随后进行基因组测序，确认了插入的ZsGreen基因的一致表达。

新型F-VNT的建立：
使用构建的FAdV重组报告基因病毒，建立了一种新型F-VNT。通过初步实验确定了检测的最佳病毒剂量。将报告基因病毒rFAdV-4-ZsGreen、rFAdV-8a-ZsGreen、rFAdV-8b-ZsGreen和rFAdV-11-ZsGreen稀释为不同剂量（每孔100至400 TCID50），分别与相应的FAdV-4、-8a、-8b和-11的鸡抗血清以及阴性对照鸡血清孵育。孵育后，将每种病毒-血清混合物加入到96孔板中的LMH细胞单层上，在多个感染后时间点（12、24和36小时）观察到绿色荧光。结果证实阳性抗血清有效中和了同源报告基因病毒，而阴性血清则没有中和活性。基于最佳条件应在阴性血清对照中产生强烈的、明显的绿色荧光，同时在阳性血清中保持明确的中和终点这一标准，选择每孔200 TCID50的病毒剂量和24小时的读取时间为F-VNT的标准化参数（图2，图3）。尽管四种重组病毒的生长动力学不同，但200 TCID50被确定为所有血清型的最佳剂量，因为它在阴性对照中始终产生明显的荧光，并且在24小时时被同源抗血清完全中和。此外，虽然荧光早在12小时就可检测到，但在24小时时200 TCID50的信号强度和一致性为中和评估提供了最可靠和可重复的终点（图2，图3）。

使用优化的F-VNT，测定了每种报告基因病毒的NAb滴度。如图4所示，FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11抗血清针对各自报告基因病毒的Log2 NAb滴度分别为13、13、14和14。这些结果表明生成的抗体具有高效且针对特定血清型的中和活性，F-VNT能够有效地定量NAb水平，并具有宽的动态范围。

新开发的F-VNT的特异性：
通过用FAdV-4、-8a、-8b和-11的相应疫苗免疫SPF鸡实验性地制备鸡抗血清，确定了血清中的中和抗体滴度。使用建立的F-VNT测定了针对FAdV-4、-8a、-8b和-11的血清抗体滴度。针对每种相应血清型的Log2 NAb滴度如下：FAdV-4，13；FAdV-8a，13；FAdV-8b，14；FAdV-11，14（比例尺=200 μm）。通过测试抗血清对其他常见禽类病原体（H9N2 AIV FJSW株、NDV VII型YN1106株、IBDV TL株和ILTV WG株）的活性，验证了新开发的F-VNT的特异性。这些异源抗血清均未显示出对FAdV荧光报告基因病毒的任何可检测的中和活性，这证实了F-VNT在区分FAdV特异性中和活性方面的特异性和可靠性（图5）。

抗FAdV-8a、-8b、-11和-4血清之间的交叉中和活性：
利用建立的F-VNT，测量了针对FAdV-4、-8a、-8b和-11的抗血清的交叉中和抗体滴度，以评估不同FAdV血清型之间的交叉反应抗体响应。不同血清型之间的抗原相关性总结在表2中。值得注意的是，针对FAdV-4的抗血清对FAdV-8a、-8b或-11没有中和作用（图6A）。针对FAdV-8a和FAdV-8b的抗血清表现出相对较高的交叉中和活性，表明这两种血清型之间存在显著的抗原交叉反应性（图6B和6C）。FAdV-11抗血清对FAdV-8a和-8b有一定的中和能力；然而，交叉中和滴度相对较低（图6D）。

与传统VNT的相关性分析：
使用实验室中准备的10种针对四种亲本病毒FAdV-4、-8a、-8b和-11的鸡抗血清，进行了相关性分析。新型F-VNT测得的NAb滴度与传统VNT获得的结果显示出强烈的正相关（图7）。这些结果表明两种方法之间有很高的一致性，并支持将新型F-VNT作为临床样本中测量NAb滴度的实用替代方法。

讨论：
FAdV-4的全球传播导致HHS，而FAdV-8a、-8b和-11导致IBH，对全球家禽产业构成了持续且经济上重大的威胁（Cizmecigil等人，2020；Hosseini等人，2020；Feng等人，2024；Zhu等人，2025；Islam等人，2026）。这些疾病通过死亡率、生产力下降以及控制措施相关的成本造成了巨大的经济损失。因此，开发一种敏感且特异的血清学检测方法来监测FAdV血清型分布、了解疾病的时空动态以及评估鸡群的免疫状态至关重要。在这项研究中，我们成功开发了一种基于荧光的新型中和测试方法，用于检测引起HHS和IBH的关键FAdV血清型。该测试基于使用重组报告基因病毒，这些病毒经过工程改造以表达ZsGreen荧光蛋白。这些报告基因病毒是利用我们之前工作中建立的FAdV反向遗传平台构建的，实现了亲本FAdV菌株的无缝和精确DNA重组，从而在一周内生成了所需的重组病毒。结果表明，重组病毒的生长动力学与其各自的亲本株相当，并且在多次传代中表现出遗传稳定性，证实了它们作为可靠和一致的工具适用于后续的中和检测。在此基础上，我们建立了一种稳健且高效的F-VNT。F-VNT能够实时、高通量地检测中和抗体，消除了传统检测方法中评分细胞病变效果所需的主观解释。该方法允许在24小时内明确确定NAb滴度。读数基于独特的荧光模式：未含有中和抗体的孔显示广泛的亮绿色荧光，而含有中和抗体的孔则表现出明显的、与剂量相关的荧光信号减弱。通过将测试时间从几天缩短到24小时，F-VNT显著提高了响应速度，这对于高效的诊断应用和现场疫苗评估至关重要。与之前使用10,000至20,000 TCID50的FA4-EGFP报告病毒来检测针对FAdV-4的中和抗体的研究（Guo等人，2022年）相比，我们的F-VNT每个孔只需要200 TCID50。这种差异归因于由CMV启动子驱动的ZsGreen产生的更强荧光，使得在较低病毒剂量下也能进行可靠检测。此外，依靠荧光检测消除了传统VNT中观察者之间的变异性，从而获得更加可重复和可靠的结果。F-VNT测得的中和抗体滴度与常规VNT测得的滴度之间的强相关性进一步证实了这种新方法的可靠性和准确性。此外，通过测试针对其他常见禽类病原体的抗血清所展示的高特异性进一步证明了F-VNT对FAdVs的高度特异性，最小化了现场应用中的交叉反应风险。

使用这种新型F-VNT，使用FAdV-4、-8a、-8b和-11的抗血清进行了交叉中和分析。观察到了这四种FAdV血清型之间的不同抗原相关性模式。虽然同源中和滴度始终很高，但异源中和作用有限，表明它们在抗原上存在显著差异。具体来说，FAdV-4抗血清对其他三种血清型没有中和能力，反之，针对FAdV-8a、-8b和-11的抗血清也无法中和FAdV-4。在FAdV-8a和FAdV-8b之间存在部分交叉中和现象，FAdV-8a、-8b和-11之间也检测到低水平的交叉中和。这些结果突显了中和抗体的强血清型特异性，并强调了开发多价疫苗以提供针对主要致病FAdV血清型的广泛保护的重要性。

总之，我们建立了一种高效、快速且高通量的基于荧光的病毒中和测试方法，适用于FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11。该方法解决了传统VNT的关键局限性，为家禽产业提供了一种强大的工具，用于快速血清学诊断和监测疫苗诱导的对HHS和IBH的免疫力。

**发表同意**：不适用。

**数据和材料的可用性**：当前研究的数据可在合理请求下从相关作者处获取。

**利益冲突声明**：作者声明没有潜在的利益冲突。

**资助**：本研究得到了中国国家自然科学基金的支持，项目编号分别为32372997和31772771。

**作者贡献**：
BW：数据整理、形式分析、研究、方法学、可视化、撰写（初稿）；
QQ：数据整理、形式分析、研究、方法学、可视化；
MX：研究、验证、数据整理；
NL：研究、验证、数据整理；
PY：研究、验证、方法学；
YC：资源支持、研究、验证；
DY：资源支持、研究、验证；
JL：研究、验证、项目管理、方法学；
KY：研究、验证、资源支持；
JZ：概念构思、方法学设计、资金筹集、监督、撰写（审阅与编辑）。

**作者贡献声明**：
Baiyu Wang：撰写（审阅与编辑）、撰写（初稿）、可视化、软件开发、方法学设计、研究、形式分析、数据整理；
Qilong Qiao：撰写（审阅与编辑）、可视化、软件开发、方法学设计、研究、形式分析、数据整理；
Minghe Xu：验证、研究；
Ning Li：验证、研究；
Panpan Yang：验证、研究；
Yanfang Cong：资源支持、研究；
Dongdong Yang：资源支持、研究；
Jianli Li：验证、研究；
Kexiang Yu：验证、资源支持；
Jun Zhao：撰写（审阅与编辑）、监督、项目管理、方法学设计、资金筹集、概念构思。