综述：迈向可持续的基于酵母的异戊酸异戊酯生产：生物技术策略、生物质价值化及下游工艺强化

《Bioresource Technology Reports》：Towards sustainable yeast-based isoamyl acetate production: Biotechnological strategies, biomass valorisation, and downstream process intensification

　　埃马纽埃尔·奥马乔科·安东尼 | 安娜·卡伦·桑切斯-卡斯塔涅达 | 克莱尔·索卢-贝里翁 | 马尔文·穆萨
巴黎萨克雷大学，INRAE，AgroParisTech，UMR SayFood，法国帕莱索91120

**摘要**
异戊基醋酸酯是食品工业中最广泛使用的芳香化合物之一，以其特有的香蕉或梨香味而闻名。它主要通过三种方法生产：化学合成、酶促合成以及微生物发酵或生物转化。尽管被归类为天然方法，但基于生物技术的发酵途径尚未在工业上得到应用。然而，对生物基化学品的需求不断增加，以及针对人类相关应用（食品、化妆品、药品、个人护理产品等）中合成添加剂的严格工业法规，重新激发了对高价值芳香化合物微生物生产途径的兴趣。本综述汇总了利用酵母生产异戊基醋酸酯的现有研究，并探讨了通过基因工程改良酵母以提高目标分子的产量和纯度的方法。旨在识别阻碍这一生产途径大规模应用的关键挑战，并提出未来研究方向以克服这些限制。此外，还探讨了将农业工业废弃物作为可持续原料的利用价值，并强调了它们作为L-亮氨酸的替代来源的重要性，L-亮氨酸是通过Ehrlich途径合成异戊基醋酸酯的关键但成本较高的前体。最后，讨论了基于膜技术的原位/在线产品回收（ISPR）和强化技术，这些技术有助于克服产品损失和毒性问题，这是微生物发酵过程中的主要瓶颈。

**1. 引言**
芳香化合物在提升食品、饮料和香水的感官品质方面起着至关重要的作用。根据Research and Markets的数据，2024年全球芳香化合物市场价值为72.2亿美元，年复合增长率（CAGR）为6.8%，预计到2030年将达到107.3亿美元（Global industry analysts, 2024）。这些有机分子要么天然存在于多种植物中，要么通过石油基产品化学合成。由于产量低、原材料限制以及工艺和产品成本问题，从天然来源获取芳香化合物的商业化受到限制。目前，全球80%的芳香化合物是通过主要依赖石油基原料的化学途径生产的（Karaalio?lu和Yüceer, 2021; Melini和Melin, 2024）。当芳香化合物来源于生物质和自然过程时，被称为生物芳香化合物（Felipe等人, 2017）。消费者和监管机构越来越倾向于选择生物基产品，因为它们被认为比化学合成产品更可持续。这推动了针对这些芳香化合物生物技术生产途径的研究。这些化合物通常是挥发性酸、醇、醛、酯、酮和萜烯（Kocharekar和Dukhande, 2021）。其中，酯类因其宜人的花香或果香而在工业中尤为重要（Sen, 2015）。异戊基醋酸酯（也称为异戊基醋酸）是一种无色液体，微溶于水，具有香蕉或梨的香味，属于这类酯类（Abbas, 2006; Burdock, 2010; Yusoff Azudin等人, 2020）。它广泛应用于工业和消费领域：在食品工业中作为调味剂，其甜美的果香可提升糖果、烘焙食品和饮料的风味（Bianchi Pedroni Medeirosa等人, 2022; Kocharekar和Dukhande, 2021; Quilter等人, 2003; Swiegers等人, 2005）；在化妆品和个人护理产品中用于香水、身体乳液和护肤配方（Quintero-Arias等人, 2023）；在制药行业中作为掩味和调味剂，改善药物的味道和口感（Rentería-Martínez等人, 2021）。除了这些消费用途外，它还作为多种工业过程中的多功能溶剂，用于清漆、涂料和粘合剂，以及提取天然化合物（如硝化纤维素）（American Chemical Society, 2007; Felli等人, 2023）。其无毒且可生物降解的特性使其成为这些应用中的理想成分（NCBI, 2025）。2023年异戊基醋酸酯的全球市场规模估计为8.837亿美元，预计到2030年将达到11亿美元，年复合增长率为2.5%（Global industry analysts, 2025）。

异戊基醋酸酯可通过三种主要途径生产：化学合成、酶促合成和微生物发酵。这些方法在前体要求、产品标签状态、工艺复杂性、下游处理负担和工业成熟度方面存在差异。化学合成（最常用的方法）基于Fischer酯化反应，其中异戊基醇和乙酸在可逆的酸催化下反应生成异戊基醋酸（图1）（Burdock, 2010; Zare等人, 2020）。常用的强无机酸（如硫酸）作为催化剂，但会导致设备腐蚀和产品选择性差的问题。与均相催化剂相比，非均相（固体酸）催化剂具有较低的腐蚀性、更高的选择性和更容易从反应体系中分离（Fattahi等人, 2023; González等人, 2017）。

然而，这一过程相对较慢且成本较高，需要额外的产品和催化剂分离步骤。此外，由于法规限制，化学合成生产的异戊基醋酸酯不能标注为“天然”产品，这在食品应用中构成了商业障碍。目前，异戊基醋酸的工业生产主要采用酶促途径，使用脂肪酶（Azudin等人, 2013; Romero等人, 2007）。酶促方法可以在溶剂存在或无溶剂的情况下在温和条件下进行，具有比化学合成更高的选择性和纯度。使用有机溶剂可以防止酯化反应过程中产生的水分引起的副反应，便于产品回收并防止微生物污染（?nidar?i?-Plazl和Plazl, 2009）。使用Candida antarctica Lipase B（Novozyme 435）等脂肪酶催化的酯化反应在优化条件下可实现高达100%的转化率，反应时间取决于酶的负载量和底物浓度（Yusoff Azudin和Rizal Abd Shukor, 2019）。根据原料来源，酶促途径可分为天然型（使用生物基异戊基醇或杂醇油和乙酸）或合成型（使用石油基原料），介于化学合成和发酵途径之间。尽管具有优势，但酶促途径受到溶剂毒性、酶对温度的敏感性、对高纯度前体的需求以及酶、有机溶剂和产品分离的高成本的影响（Bianchi Pedroni Medeirosa等人, 2022; Yusoff Azudin等人, 2020）。

除了传统的化学和商业酶促生产途径外，还可以利用酵母细胞进行发酵生产（Hernández-Carbajal等人, 2013; Torres等人, 2011）。这种生物技术方法利用微生物的天然代谢能力合成异戊基醋酸酯，具有多种优势，包括使用可再生原料（如废弃生物质和农业工业废弃物）、减少对有害化学物质的依赖，以及生成可标注为“天然”的产品。此外，发酵过程无需分离酶或化学催化剂，从而简化生产流程并可能降低生产成本（Jankovi?等人, 2025）。发酵途径的一个关键优势是在温和且环保的条件下高选择性地生产目标产物（Hua和Xu, 2011; Yang等人, 2007）。某些酵母菌株在发酵过程中会自然产生异戊基醋酸酯作为代谢副产物，尤其是在存在异戊基醇或L-亮氨酸作为前体的情况下（Gamero等人, 2016; Rentería-Martínez等人, 2021）。需要调整pH值、温度、前体浓度、搅拌速率和通气速率等发酵参数以提高芳香化合物的产量（Mitri等人, 2022）。此外，代谢工程已成功应用于酵母和细菌菌株，以提高目标代谢产物的产量并改善整体发酵性能（Asano等人, 1999; Jeffries和Jin, 2004; Liu等人, 2020; Yuan等人, 2017）。虽然三种途径都能生产异戊基醋酸酯，但其最终产品的应用直接决定了其工业化的可行性。深入比较这些途径对于理解基于发酵的生产方式在更广泛工业环境中的定位以及确定其竞争优势至关重要。发酵是唯一能够明确标注为“天然”产品的途径，并在底物选择方面具有最大灵活性，包括潜在利用农业工业废弃物。然而，在体积生产率和工艺成熟度方面，它目前落后于其他两种途径；同时，在发酵过程中管理活性细胞也增加了复杂性。从复杂的发酵液中回收稀释且易挥发的产品也面临技术和经济挑战，这些问题在工业规模上尚未解决。因此，选择哪种途径不仅取决于技术因素，还受到目标市场和监管框架的影响，使得基于发酵的异戊基醋酸酯生产的发展既必要又在战略上具有合理性。

先前的研究主要集中在从合成和农业基碳源生产天然芳香化合物（如2-苯乙醇、乙酸乙酯、香兰素、芳樟醇、甲硫醇、2,3-丁二醇、法尼烯等）（Aprotosoaie等人, 2014; Bi等人, 2022; Brewster等人, 2024; Fan等人, 2019; Liu等人, 2022; Nitta等人, 2021; Sales等人, 2018; Sun等人, 2024）。鉴于对天然和可持续生产途径的需求不断增加，以及对其生产和使用的法规要求日益严格（Hua和Xu, 2011），进一步研究和优化微生物异戊基醋酸酯生产途径非常重要。最近关于微生物异戊基醋酸酯生产的研究集中在优化上游发酵条件以提高产量上，但这些研究大多忽略了从发酵液中回收芳香化合物的步骤。据我们所知，使用合成葡萄糖培养基获得的异戊基醋酸酯最高实验产量（Koshiba等人, 2024），这表明农业工业废弃物作为低成本碳源的潜力尚未得到充分开发。因此，本综述汇总了利用酵母生产异戊基醋酸酯的现有研究，其新颖之处在于整合了三个关键但常被分离的视角：（i）通过代谢工程和途径优化提高酵母中的异戊基醋酸酯生物合成；（ii）将农业工业废弃物作为可持续的碳和氨基酸来源进行利用；（iii）基于膜技术的原位/在线产品回收策略，以克服产品毒性和提高酯类回收率。通过整合这些视角，本综述提供了对整个异戊基醋酸酯生产链的全面评估，并为未来实现基于生物的异戊基醋酸酯工业化生产指明了方向。

**2. 酵母中异戊基醋酸酯的生物生产**
酵母中高级醇醋酸酯的生产可以通过中央碳代谢从头合成糖类产生，或者通过使用氨基酸前体的Ehrlich途径产生（Mitri等人, 2022; Zhu等人, 2024）。在从头合成途径中，简单的糖类（如葡萄糖、木糖和果糖）被代谢成α-酮酸中间体，随后进入Ehrlich途径。这一过程的效率取决于酵母菌株向L-亮氨酸生物合成的代谢通量和Ehrlich途径的效率，因此优化前体形成和酶促转化至关重要（Hazelwood等人, 2008）。在实践中，从头合成产生的异戊基乙酸产量通常非常低，这反映了在标准发酵条件下酵母细胞向支链氨基酸生物合成方向输送的通量有限，此时氮不是限制因素，而其他竞争性途径会将碳从L-亮氨酸和异戊醇的形成中转移开。Ehrlich途径（图2）是L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸等支链氨基酸（BCAAs）以及芳香族氨基酸（L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸）和含硫氨基酸（如L-甲硫氨酸）分解的关键代谢途径。这些氨基酸被转化为相应的醇类，随后通过醇乙酰转移酶（AATs），主要是ATF1和ATF2，进一步酯化为相应的乙酸酯（Badura等人，2023；Hazelwood等人，2008）。最终的酯浓度取决于其通过AATs合成与通过酵母酯酶水解之间的平衡，后者可以将酯重新水解为其前体醇（Torres等人，2011）。这种酯化-水解平衡不仅仅是一个生化细节，而是一个决定性过程，因为发酵液中的异戊基乙酸积累量取决于这两种酶类的综合和相互竞争的活性，这会显著影响最终产品的产量。关于Ehrlich途径及其基因调控的详细综述，请参见Hazelwood等人（2008）、Saerens等人（2010）、Pires等人（2014）和Badura等人（2023）的研究。

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图2. 酵母中异戊基乙酸和乙酸乙酯的代谢途径。（改编自Baptista和Domingues，2022；Sánchez-Casta?eda等人，2018）

即使浓度较低，醇类酯类，包括异戊基乙酸，也对葡萄酒、啤酒和其他发酵食品的香气特征和感官质量有显著贡献（I?iguez-Mu?oz等人，2018；Lytra等人，2013；Meng等人，2021；Zhu等人，2024）。在酵母中，这些化合物（醇类和酯类）主要通过Ehrlich途径形成，该途径已被广泛研究用于生物技术中的醇类和酯类生产（Pires等人，2014）。特别是在异戊基乙酸生产方面，当L-亮氨酸作为发酵培养基中唯一的氮源时，异戊醇和异戊基乙酸的产量显著增加（Pires等人，2014）。L-亮氨酸首先通过线粒体和细胞质中的支链氨基酸氨基转移酶（BAT1和BAT2）转氨化为α-酮异己酸（α-KIC）。生成的α-KIC通过丙酮酸脱羧酶（PDCs）或α-KIC脱羧酶（ARO10）脱羧生成异戊醛，然后通过醇脱氢酶（ADHs）进一步还原为异戊醇（Kobashi等人，2024；Swiegers等人，2005）。最后，异戊醇通过醇乙酰转移酶（AATs），主要是ATF1和ATF2，与乙酰辅酶A（acetyl-CoA）酯化生成异戊基乙酸（Quilter等人，2003；Vadali等人，2004；Saerens等人，2010）。需要注意的是，这一途径涉及在线粒体和细胞质中发生的反应，其中L-亮氨酸向α-KIC的转氨化发生在线粒体中，而下游的脱羧和还原步骤则发生在细胞质中。这种区室分离可能会限制整个途径的通量，并代表了酵母中天然异戊基乙酸生物合成的内在代谢限制之一（Yuan等人，2017），这一点将在本综述的第5节中进一步讨论。

与从头合成相比，前体驱动的生物合成依赖于外源性添加L-亮氨酸或异戊醇来增强异戊基乙酸的产量。这种补充绕过了L-亮氨酸生物合成中的代谢瓶颈，支持了更高且更稳定的酯类生产（Dzialo等人，2017；Quilter等人，2003；Rentería-Martínez等人，2021）。然而，这两种前体途径都受到重要限制。L-亮氨酸的补充受到饱和效应的限制，即当前体浓度超过一定水平时，酯类产量不会成比例增加，如第4节所讨论的。直接补充异戊醇虽然更有效地促进酯类形成，但其高浓度对酵母细胞的毒性限制了可以应用的最大前体剂量，而不影响细胞活力和发酵性能。这些限制意味着仅靠前体补充不足以实现高产量，必须结合菌株水平和工艺水平的优化策略，如下一节所述。

3. 产生异戊基乙酸的酵母种类

细菌、酵母和真菌已被用于生物香气的生产。然而，由于酵母的耐受性更强，包括对温度和pH变化的耐受性、高底物浓度以及乙醇积累能力，以及它们的代谢多样性，因此通常更倾向于使用酵母（Medeiros等人，2000）。在用于生物香气生产的微生物中，只有少数酵母种类获得了G.R.A.S.（普遍认为安全）认证，这是食品、饮料和个人护理行业工业应用的额外前提条件。据报道，几种酵母种类（包括传统和非传统酵母）能够产生不同量的异戊基乙酸，详见表1。

表1. 不同发酵条件下各种酵母菌株产生的异戊基乙酸量

**生产策略** | **酵母菌株** | **碳源** | **前体** | **条件** | **产量** | **观察结果** | **参考文献**
--- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | ---
**从头合成** | Pichia membranaefaciens B-11 | 合成葡萄汁 + 250 mg/L葡萄糖 | 一种培养瓶，28°C，pH 3.5 | 0.04 mg/L | 从头合成产生的产量通常较低。通气和搅拌可以提高产量，但仍低于前体补充策略下的产量 | Plata等人（2003）
**Candida guilliermondii CECT 102** | 0.05 mg/L |
**Hansenula subpelliculosa CECT 111** | 0.14 mg/L |
**Kluyveromyces marxianus CECT 112** | 0.10 mg/L |
**Torulaspora delbrueckii MYA-4** | 0.12 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae MYA-4** | 0.15 mg/L |
**Kloeckera apiculata B-1** | 0.60 mg/L |
**Pichia fermentans ITD001** | 合成培养基（葡萄糖） | 生物反应器，28°C，pH 5.0 | 0.070 ± 0.004 mg/L | Rentería-Martínez等人（2021）
**Sugar cane molasses** | 生物反应器，28°C，pH 5.0，1 vvm空气，120 rpm | 18 mg/L | Rentería-Martínez等人（2016）
**Williopsis saturnus HUT 7087** | 甜菜糖蜜（10 Brix） | 生物反应器，25°C，初始pH 5，0.05 vvm空气，100 rpm | 118 mg/L | Yilmaztekin等人（2013）

**前体驱动的生物合成**
**L-亮氨酸** | Pichia kluyveri PK-19 | 合成葡萄汁培养基（SM200E） | 200 mg/L混合氨基酸和氮源 | 圆柱形发酵罐，28°C，pH 3.3，120 rpm | 5.74 ± 0.72 mg/L | 大多数测试菌株中，多种氮源降低了产品产量，可能是由于非亮氨酸氨基酸对Ehrlich途径的竞争 | Zhu等人（2024）
**Saccharomyces cerevisiae SC-19** | 0.34 ± 0.05 mg/L |
**Pichia fermentans Z9** | 0.33 ± 0.05 mg/L |
**Hanseniaspora uvarum Yun2** | 0.5 ± 0.03 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae 5610** | Ale Wort | 4 g/L | 不锈钢罐，21°C，pH 4.9 | 11.0 mg/L | 即使有前体补充，S. cerevisiae的产量通常也较低 | Quilter等人（2003）
**Sugar beet Molasses** | 9 mg/L | Pichia fermentans ITD00165 | 甜菜糖蜜 | 生物反应器，28°C，pH 5.0，1 vvm空气，120 rpm | 与从头合成条件相比，L-亮氨酸补充使产量增加了约30倍，表明前体可用性对酯类生产有显著影响 | Rentería-Martínez等人（2016）

**异戊醇/杂醇油补充**
**Hanseniaspora guilliermondii 11,104** | GPYM培养基（40 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g酵母提取物和3 g麦芽提取物） | 8 mL 1%异戊醇在正癸烷中 | 一种培养瓶，30°C，pH 6，120 rpm | 3.37 mg/L | 尽管工艺条件相似，不同菌株间报告的产量差异很大，突显了代谢能力的固有差异 | Rojas等人（2001）
**Hanseniaspora uvarum 144** | 0.15 mg/L |
**Pichia anomala 10,59** | 10.21 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae T73** | 0.75 mg/L |
**Hanseniaspora guilliermondii 11,104** | 双耦合系统，30°C，pH 6 | <0.5 mg/L |
**Hanseniaspora uvarum 144** | Pichia membranaefaciens 10,11** |
**Pichia anomala 10,59** | 2.11 ± 0.12 mg/L |
**Candida diversa ITD007** | 双耦合系统，28°C，pH 6，120 rpm | 0.1348 ± 0.01 mg/L | Hernández-Carbajal等人（2013）
**Candida pseudointermedia ITD001** | 10.1458 ± 0.02 mg/L |
**Decker anomala ITD000** | 150.1219 ± 0.02 mg/L |
**Hanseniaspora uvarum ITD001** | 80.0822 ± 0.00 mg/L |
**Kluyveromyces marxianus ITD002** | 10.3280 ± 0.01 mg/L |
**Pichia fermentans ITD001** | 0.3829 ± 0.05 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae ITD002** | 0.0903 ± 0.01 mg/L |
**Torulaspora delbrueckii ITD002** | 30.2399 ± 0.05 mg/L |
**Williopsis saturnus HUT 7087** | 甜菜糖蜜 + 1%杂醇油（23.7% v/v异戊醇） | 一种培养瓶，25°C，pH 5，100 rpm | 354.1 ± 1.2 mg/L | 杂醇油甚至比L-亮氨酸补充更能提高产量 | Yilmaztekin等人（2009）
**Saccharomyces cerevisiae 5610** | Ale Wort | 杂醇油（54.5% v/v异戊醇） | 不锈钢罐，21°C，pH 4.9 | 21.12 mg/L | Quilter等人（2003）
**Sugar beet Molasses** | 9 mg/L | Pichia fermentans ITD00165 | 甜菜糖蜜 | 生物反应器，28°C，pH 5.0，1 vvm空气，120 rpm | 550 ± 140 mg/L |

**直接补充异戊醇**
**Hanseniaspora guilliermondii 11,104** | GPYM培养基（40 g葡萄糖，5 g蛋白胨，3 g酵母提取物和3 g麦芽提取物） | 8 mL 1%异戊醇在正癸烷中 | 一种培养瓶，30°C，pH 6，120 rpm | 报告的产量在不同菌株间差异很大，突显了代谢能力的固有差异 | Rojas等人（2001）
**Hanseniaspora uvarum 144** | 0.15 mg/L |
**Pichia anomala 10,59** | 10.21 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae T73** | 0.75 mg/L |
**Hanseniaspora guilliermondii 11,104** | 双耦合系统，30°C，pH 6 | <0.5 mg/L |
**Hanseniaspora uvarum 144** | Pichia membranaefaciens 10,11** |
**Pichia anomala 10,59** | 2.11 ± 0.12 mg/L |
**Candida diversa ITD007** | 双耦合系统，28°C，pH 6，120 rpm | 0.1348 ± 0.01 mg/L | Hernández-Carbajal等人（2013）
**Candida pseudointermedia ITD001** | 10.1458 ± 0.02 mg/L |
**Decker anomala ITD000** | 150.1219 ± 0.02 mg/L |
**Hanseniaspora uvarum ITD001** | 80.0822 ± 0.00 mg/L |
**Kluyveromyces marxianus ITD002** | 10.3280 ± 0.01 mg/L |
**Pichia fermentans ITD001** | 0.3829 ± 0.05 mg/L |
**Saccharomyces cerevisiae ITD002** | 0.0903 ± 0.01 mg/L |
**Torulaspora delbrueckii ITD002** | 30.2399 ± 0.05 mg/L |
**Williopsis saturnus HUT 7087** | 甜菜糖蜜 + 1%杂醇油（23.7% v/v异戊醇） | 一种培养瓶，25°C，pH 5，100 rpm | 354.1 ± 1.2 mg/L | 杂醇油比L-亮氨酸补充更能提高产量 | Yilmaztekin等人（2009）
**Saccharomyces cerevisiae 5610** | Ale Wort | 杂醇油（54.5% v/v异戊醇） | 不锈钢罐，21°C，pH 4.9 | 21.12 mg/L | Quilter等人（2003）
**Sugar beet Molasses** | 9 mg/L | Pichia fermentans ITD00165 | 甜菜糖蜜 | 生物反应器，28°C，pH 5.0，1 vvm空气，120 rpm | 860 ± 110 mg/L | 直接补充异戊醇使产量比L-亮氨酸补充提高了约1.6倍，证实了直接前体途径的优越效率 | Rentería-Martínez等人（2016）

**合成培养基（葡萄糖）** | 0.5 g/L异戊醇（持续前体供应） | 生物反应器，28°C，pH 5.0，0.75 vvm空气，175 rpm，KLa = 11.3/h | 2.138 ± 0.046 mg/L | 报告的非工程化酵母菌株中的最高产量。控制前体供应并结合优化的通气条件对于实现这一性能至关重要，过度通气会负面影响产量 | Rentería-Martínez等人（2021）

多项筛选研究表明，异戊基乙酸的产生在酵母种类和菌株中普遍存在，但变化很大。在回顾的研究中观察到的一个主要问题是，不同生产途径下的报告产量无法直接比较，因为前体类型和可用性、系统配置以及发酵设置的不同从根本上影响了可实现的产量，这与酵母菌株的固有代谢能力无关。Hernández-Carbajal等人（2013）使用双耦合系统筛选了从Agave duranguensis自发发酵中分离出的50种酵母菌株用于 mezcal生产。双耦合系统由在葡萄糖、酵母提取物、麦芽提取物和蛋白胨（GYMP）琼脂板上生长的酵母组成，琼脂板上覆盖着异戊醇在正癸烷中的溶液，既作为前体（异戊醇）来源，也作为异戊基乙酸的捕获器。固体-液体界面处的酵母细胞将异戊醇转化为异戊基乙酸，后者同时被分配到正癸烷中。该设置鉴定出Pichia fermentans、Candida diversa、Torulaspora delbrueckii、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces marxianus和Hanseniaspora uvarum为异戊基乙酸产生菌株。同样，Rojas等人（2001）使用相同的双耦合系统观察到Hanseniaspora guilliermondii、Hanseniaspora uvarum、Pichia anomala和Pichia membranaefaciens产生异戊基乙酸。Plata等人（2003）在合成葡萄汁培养基中报告了P. membranaefaciens、Candida guilliermondii、Hansenula subpelliculosa、Kluyveromyces marxianus、Torulaspora delbrueckii和Saccharomyces cerevisiae产生异戊基乙酸。此外，Williopsis saturnus HUT7087也被报道可以从含有23.7% v/v异戊醇的杂醇油中产生异戊基乙酸（Yilmaztekin等人，2009）。这些筛选研究表明，异戊基乙酸的产生广泛分布于不同的酵母属中，并不限于单一的系统发育群。然而，由于这些研究中使用了不同的筛选方法、底物和发酵条件，使得不同物种之间的生产能力难以直接定量比较。此外，根据一项研究对物种进行异戊基乙酸产量的排名可能在不同的实验条件下不可重复。

尽管具有广泛的系统发育分布，但菌株间的生产率通常较低，限制了它们的直接工业应用（Rossi等人，2017；Sánchez-Casta?eda等人，2018）。更重要的是，在相同的发酵条件下培养的酵母菌株也观察到不同的结果。Hernández-Carbajal等人（2013）显示，在相同的发酵条件下，P. fermentans ITD00165在六小时内实现了其总异戊基乙酸产量的75%，而K. marxianus ITD00211在同一时间内仅实现了其总产量的33%。这种生产动力学的差异不仅仅是数量上的区别，还反映了物种间代谢动态的根本差异，这对生物反应器操作、发酵时间和下游加工计划有影响。

除了固有的代谢能力外，酵母菌株的来源、培养条件和发酵历史也显著影响它们合成异戊基乙酸的能力（Plata等人，2003）。Steensels等人（2014）筛选了301种来自野生和工业来源的Saccharomyces菌株，发现用于酿造、酿酒和其他发酵过程的工业菌株通常比野生菌株产生更高浓度的异戊基乙酸。这表明，无论是通过有意选择还是适应性进化，反复暴露于工业发酵条件都有利于酵母中与更高酯类生产相关的特征的富集。进一步支持这一点的是，Quilter等人（2003）报告称，重复使用先前发酵的酵母（re-pitching）使异戊基乙酸产量增加了2.25倍，这强化了酵母适应性和先前发酵历史在香气化合物生物合成中的重要作用。这些发现共同表明，选择用于异戊基乙酸生产的菌株应不仅考虑其固有的代谢能力，还应考虑其适应性和对重复发酵周期的响应，因为这些因素会显著影响工业条件下的生产结果。

在报告产生异戊基乙酸的酵母种类中（表1），四种非传统酵母，包括Pichia fermentans、Pichia anomala、Williopsis saturnus和Kluyveromyces marxianus，表现出比其他菌株更高的天然生产力，因此可以被视为潜在的候选者。特别是P. anomala和P. fermentans显示出最高的报告产量，表明它们具有有利于异戊基乙酸生物合成的代谢背景。然而，菌株的选择不应仅基于产品产量和生产力，还必须考虑其工业相关性、监管状态以及遗传和工艺工程工具的可用性。

Pichia和Williopsis属的酵母通常用于食品、饮料和酒精生产，并且在实践中被认为是安全的。尽管它们在异戊基醋酸酯生产方面的代谢性能更优越，但它们仍然缺乏正式的GRAS（通用安全认证）或QPS（安全性的合格推定） status，并且在监管和工艺开发方面的了解仍然不足（EFSA，2023年）。在这一组高异戊基醋酸酯生产者中，只有K. marxianus获得了这样的监管认可。然而，对于所有这些非传统物种来说，监管不确定性、基因工程工具的有限可用性以及在工业相关条件下的生理特性描述不完整，仍然是大规模应用的主要障碍。因此，尽管S. cerevisiae的产量较低，但它仍然在工业和学术研究中占据主导地位，这突显了天然代谢性能与工业成熟度之间的基本权衡。

4. 影响酵母中异戊基醋酸酯生产的因素
除了菌株选择之外，操作条件如pH值、温度、搅拌速度和通气速率，以及培养基组成，都对异戊基醋酸酯的生产有显著影响（Hernández-Carbajal等人，2013年；Quilter等人，2003年；Rentería-Martínez等人，2021年；Yilmaztekin等人，2013年；Yoshimoto和Bogaki，2023年）。这些参数不仅影响酵母细胞的生理状态，还影响前体的可用性和转化率、关键酶的活性以及生物合成与降解途径之间的平衡。优化这些条件对于提高工业发酵过程中的异戊基醋酸酯产量至关重要。然而，对现有文献的仔细审查表明，最佳条件高度依赖于菌株，使用特定酵母菌株或发酵配置获得的结果不能直接推广到其他菌株。这使得定义一个通用的工艺条件变得困难，并强调了系统化、特定于菌株的优化的必要性。以下小节将探讨培养基组成和前体添加，以及发酵参数（pH值、温度、搅拌速度和通气速率）对异戊基醋酸酯生产的影响。

4.1. 前体类型和发酵培养基组成的影响
前体的选择和培养基组成是决定酵母发酵中异戊基醋酸酯产量和生产力的最重要因素之一。文献中探讨了两种主要的前体途径，即L-亮氨酸补充和直接添加异戊基酒精。比较现有数据发现，异戊基酒精作为前体的表现始终优于L-亮氨酸，尽管其代价是增加了细胞毒性。异戊基酒精作为前体的优越性能在多个物种中得到了很好的支持。Quilter等人（2003年）报告称，在添加了含有54.5% v/v异戊基酒精的糠醛油的Saccharomyces cerevisiae 5610中，异戊基醋酸酯的产量增加了4.4倍，而使用L-亮氨酸时仅增加了2.3倍。Rentería-Martínez等人（2016年）在Pichia fermentans ITD00165中观察到了更明显的差异，异戊基酒精添加后的产量为860 mg.L?1，而使用L-亮氨酸时为550 mg.L?1，通过从头合成途径仅产生18 mg.L?1。这些结果与Plata等人（2003年）的研究一致，他们认为异戊基醋酸酯的生产更受异戊基酒精可用性的影响，而不是受酒精乙酰转移酶（AAT）活性的影响。这意味着当前体供应受限时，酯化步骤不是主要的瓶颈。这一观点进一步得到了L-亮氨酸补充超过一定浓度阈值后效果递减的发现的支持。Quilter等人（2003年）在S. cerevisiae 5610中观察到，当L-亮氨酸浓度超过4 g.L?1时，酯产量没有显著增加。Sánchez-Casta?eda等人（2018年）使用数学模型进一步证实了这一点，他们确定1.6 g.L?1的L-亮氨酸足以实现63 mg.L?1.h?1的最大理论异戊基醋酸酯生产力，而且增加L-亮氨酸浓度到4 g.L?1以上并不会显著提高产量。这些发现共同表明，L-亮氨酸补充存在饱和效应，这可能反映了从L-亮氨酸到异戊基酒精的Ehrlich途径的有限通量能力，而不是下游酯化能力的限制。

与这些结果相反，Asano等人（1999年）和Hirooka等人（2005年）在突变清酒酵母菌株（Kyokai 701和2NF）中的研究发现挑战了前体可用性总是主导因素的观点。这两项研究都报告了异戊基醋酸酯产量的增加，但没有伴随异戊基酒精浓度的相应增加，他们将这种改进归因于更高的AAT酶活性。这些菌株是基于对econazole和1-法尼基吡啶inium（FPy）的抗性筛选出来的，这两种化合物可以调节细胞膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例，从而影响AAT的结合和活性（Inoue等人，1997年；Asano等人，1999年；Hirooka等人，2005年）。这些结果表明，在前体已经充足供应的菌株中，酯化能力可能成为限制因素，前体供应与AAT活性的相对重要性取决于菌株和具体环境。这对工艺设计具有重要意义，因为它表明没有一种单一的优化策略，无论是前体补充还是AAT上调，都是普遍适用的，必须首先确定每个菌株的主要瓶颈才能进行有针对性的改进。

尽管异戊基酒精作为前体具有明显优势，但由于其对酵母细胞的毒性，其在发酵中的使用受到显著限制。Yilmaztekin等人（2009年）报告称，在糠醛油浓度逐渐增加的情况下，Williopsis saturnus HUT7087细胞的存活率逐渐下降，从1% v/v时的95%降至3% v/v时的73%，对应的异戊基酒精浓度分别为约1.9 g.L?1和5.8 g.L?1。在P. fermentans ITD00165中，毒性阈值更低，Rentería-Martínez等人（2021年）报告称，在0.5、1.5和2.5 g.L?1的异戊基酒精浓度下，24小时培养后细胞浓度分别下降了65%、80%和96%。这些结果表明，异戊基酒精补充的有效浓度窗口很窄且依赖于物种，保持前体浓度低于毒性阈值是一个关键的过程限制，这直接限制了使用异戊基酒精作为前体时可实现的最大产量。因此，开发有效的异戊基酒精输送方法或在酵母菌株中工程化以提高其对异戊基酒精的耐受性变得至关重要。

已经提出了几种策略来解决这种毒性限制。Rentería-Martínez等人（2021年）证明，在24小时发酵过程中逐渐添加异戊基酒精以保持浓度低于0.5 g.L?1，使异戊基醋酸酯的产量增加了30倍，达到2.138 ± 0.046 g.L?1（在P. fermentans ITD00165中）。这是非工程化酵母菌株中报告的最高产量之一，表明受控的前体输送可以显著扩大实际操作窗口并提高产量。在此基础上，Paredes-Ortíz等人（2022年）没有直接添加异戊基酒精，而是通过连续模式的生物反应器中的进气流连续引入异戊基酒精。这种设置利用了前体的挥发性，实现了缓慢、可控的输送，特别是在0.25 h?1的稀释率下，最大限度地减少了抑制积累。虽然这种方法很巧妙，但它受到异戊基酒精的蒸气压和挥发性的限制，这限制了通过通气可以输送的最大前体通量。此外，增加通气速率以改善前体输送可能会超过酯生产的最佳氧气转移条件，因为过度通气已知会通过促进产物挥发和将代谢通量重新导向生物质形成而负面影响异戊基醋酸酯的积累，这一点在第4.2节中进一步讨论。这些研究共同表明，前体输送策略不仅仅是工艺考虑因素，还与生产菌株的代谢有关，优化前体供应需要同时考虑毒性阈值、代谢能力和发酵配置。

除了前体类型外，培养基组成也在决定异戊基醋酸酯产量方面起着重要作用。Rentería-Martínez等人（2016年）使用Plackett-Burman设计确定CaCl2、异戊基酒精和MgSO4是P. fermentans ITD00165中异戊基醋酸酯生产的最重要培养基成分。尽管ZnSO4在该菌株中未被确定为主要贡献因素，但Quilter等人（2003年）报告称，在S. cerevisiae 5610中添加0.12 g.L?1 ZnSO4后，异戊基醋酸酯的产量增加了1.5倍。这表明矿物质补充的效果也依赖于菌株。这些差异可能反映了不同酵母物种之间的酶需求和膜组成的差异，进一步强调了特定于菌株的培养基优化的必要性。

4.2. 操作参数的影响：pH值、温度、搅拌速度和通气速率
操作参数对异戊基醋酸酯生产的影响是相互关联的，不能单独考虑。这些参数影响生产酵母的生理状态以及参与酯生物合成和降解的酶的活性。现有数据的分析表明，这些参数的最佳值因酵母菌株和物种而异，这对工艺设计和放大是一个重大挑战。

温度和pH值主要通过调节AAT酶活性来影响异戊基醋酸酯的生产，据报道AAT酶活性的最佳范围在25–30°C和pH 7–8之间（Minetoki等人，1993年；Quilter等人，2003年；Vadali等人，2004年）。偏离这些条件会改变酯合成与水解之间的平衡，从而降低异戊基醋酸酯的产量（Vadali等人，2004年）。然而，AAT活性的最佳条件并不总是与酵母生长或前体生物合成的最佳条件一致，这引入了必须仔细考虑的固有权衡。Quilter等人（2003年）观察到，在S. cerevisiae 5610中，随着pH值的增加，异戊基醋酸酯的产量稳步增加，在pH 8.5时达到最大值后开始下降，而Rentería-Martínez等人（2016年）在P. fermentans ITD00165中报告称，在pH 5和28°C时产量最大。这两种酵母物种之间的最佳pH值差异（8.5对比5）突显了最佳工艺条件的菌株特异性，并进一步证实了一个酵母系统中建立的条件不能可靠地应用于另一个酵母系统。

温度对异戊基醋酸酯生产的影响特别复杂。虽然AAT活性在25至30°C之间是固定的，但温度与最终产量的相关性并非线性。Yilmaztekin等人（2013年）报告称，在W. saturnus HUT7087中，最大异戊基醋酸酯浓度在15°C时达到（29.4 mg.L?1，大约216小时后），而不是在25°C时（20.72 mg.L?1，50小时后）。一个可能的解释是，在较低温度下，产物挥发性降低，减少了发酵液中的异戊基醋酸酯损失，而延长的发酵时间允许更多的酯积累。Inoue等人（1997年）也观察到了类似的温度依赖性模式，他们发现Hansenula mrakii IFO0895在30°C的对数阶段和早期稳定阶段产生了更多的异戊基醋酸酯，但在15°C的稳定阶段积累更多。这些发现表明，温度不仅影响酯的生产速率，还影响最大酯积累发生的生长阶段，以及通过挥发造成的产物损失。

此外，温度还影响前体的可用性，因为通过Ehrlich途径的异戊基酒精生物合成是温度依赖的（Yoshimoto和Bogaki，2023年）。因此，温度和pH值的变化同时影响前体的可用性和酵母的酯化能力。

搅拌速度和通气速率的优化是挥发性化合物生产中最重要的权衡之一。这些参数通过至少三种竞争机制影响异戊基醋酸酯的生产：它们影响氧气转移和生物质形成，通过影响呼吸代谢与发酵代谢来调节乙酰-CoA的可用性，并直接影响通过从发酵液中去除挥发性酯而造成的产物损失。Yilmaztekin等人（2013年）报告称，在半厌氧条件（0.05 vvm，100 rpm）下，W. saturnus HUT7087的异戊基醋酸酯产量最高（0.703 mg.L?1.h?1）和最大浓度。这些发现与Plata等人（2005年）的研究一致，他们发现半厌氧条件有利于Saccharomyces cerevisiae MYA 425中的异戊基醋酸酯生产。然而，Rojas等人（2001年）观察到，虽然Saccharomyces cerevisiae T73在最小通气条件下产生了更多的异戊基醋酸酯，但非Saccharomyces酵母（Hanseniaspora guilliermondii 11,104、Hanseniaspora uvarum 1444和Pichia anomala 10,590）在高度通气条件下（120 rpm）表现出更高的产量。这种对通气响应的差异反映了不同酵母物种在呼吸能力和代谢调节方面的根本差异。

总之，酵母中异戊基醋酸酯生产没有普遍的最佳条件。温度、pH值、搅拌速度和通气速率对异戊基醋酸酯生产的影响高度依赖于菌株，并且与特定于物种的代谢调节密切相关。因此，必须针对每个酵母菌株和生产过程单独优化发酵条件。这在考虑放大和工业实施时尤为重要，因为操作条件的微小变化可能会对产量和过程稳定性产生显著影响。**通过代谢和基因工程提高酵母中异戊基乙酸的产量**

文献中报道的主要遗传和代谢工程策略可以分为三类，以改善异戊基乙酸的产量：前体供应（来自L-亮氨酸或通过异戊基醇的生物合成）、酯化能力（AAT过表达或删除）以及产物稳定性（酯酶控制和途径优化）。这些策略已应用于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和脂肪酵母（Yarrowia lipolytica），每种酵母对这些改性的反应各不相同。表2总结了这些改性措施。

**表2. 用于提高异戊基醇和异戊基乙酸产量的酵母改性**

| 工程目标 | 酵母菌株 | 改性措施 | 结果 | 含义 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| ATF1过表达/删除 | S. cerevisiae BY4742 | ATF1（编码醇乙酰转移酶）过表达 | 异戊基乙酸产量增加180倍 | ATF1过表达是迄今为止报道的对S. cerevisiae中异戊基乙酸产量影响最大的遗传修饰，证实当前体供应充足时，酯化能力是主要瓶颈 | Verstrepen等人（2003） |
| ATF2过表达 | S. cerevisiae BY4742 | ATF2过表达 | 异戊基乙酸产量增加25倍 | 同源物之间的酯化能力差异显著，ATF1是更有效的目标 | Verstrepen等人（2003） |
| Lg-ATF1过表达 | S. cerevisiae BY4742 | Lg-ATF1过表达 | 相较于ATF1和ATF2过表达，增幅较小 | Lg-ATF1不能有效替代S. cerevisiae中的ATF1，进一步证实了AAT酯化能力的同源物依赖性 | Verstrepen等人（2003） |
| ATF1和ATF2删除 | S. cerevisiae BY4742 | ATF1和ATF2删除 | 几乎完全消除了酯的形成 | ATF1和ATF2主要负责S. cerevisiae中的异戊基乙酸生物合成，其他酶的酯化活性很少或没有补偿作用 | Verstrepen等人（2003） |
| 多拷贝ScATF1整合 | Yarrowia lipolytica PO1f Δku70Δku80 | 多拷贝异源ScATF1整合，增强乙酰辅酶A供应，并优化培养基以异戊基醇为直接前体 | 异戊基乙酸产量达到3.4 g/L，这是迄今为止酵母中报道的最高产量 | Koshiba等人（2024） |
| 前体途径工程 | S. cerevisiae KY1058 | BAT2（编码胞质支链氨基酸氨基转移酶）删除 | 异戊基醇产量减少40%，异戊基乙酸产量减少58% | BAT2对于通过Ehrlich途径的前体形成是必需的；然而，BAT2过表达的改善效果有限（异戊基醇和异戊基乙酸分别增加1.3倍和1.5倍） | Yoshimoto等人（2002） |
| α-IPM生物合成途径重定位 | S. cerevisiae BY4741 | 通过修改ILV2、ILV3和ILV5重新定位α-IPM生物合成途径，并过表达LEU1、LEU2、ARO10和ADH7 | 异戊基醇产量达到522.76 ± 38.88 mg/L，同时产生异丁醇（540.30 ± 48.26 mg/L）和2-甲基-1-丁醇（82.56 ± 8.22 mg/L）作为副产物 | Zhang等人（2022） |
| 酶共定位 | Yarrowia lipolytica Po1g KU70 | 过表达Ehrlich途径基因ScBAT1、ScARO10和ScADH2，并使用混合启动子库优化表达水平 | 异戊基醇产量达到11.57 mg/L | 中等表达水平的ScARO10表现优于高表达水平 | Yuan等人（2017） |

**酯酶控制和产物稳定性**
- **S. cerevisiae BY4742**：删除编码异戊基乙酸水解酶IAH1 | 使包括异戊基乙酸在内的酯类相对丰度增加 | 酶介导的降解是限制异戊基乙酸产量的因素 | Dank等人（2018） |
- **K. marxianus DU3**：使用CRISPRi下调IAH1 | 异戊基乙酸产量没有显著增加 | 与S. cerevisiae中的IAH1相比，K. marxianus中的IAH1具有更广泛的底物特异性，减少酯水解通常不会改善异戊基乙酸积累 | Mu?oz-Miranda等人（2024） |

**中间体运输**
酵母中天然异戊基醇生产的一个主要限制是中间体在线粒体和细胞质之间的运输。从丙酮酸到α-异丙基马来酸（α-IPM）的途径上游发生在线粒体中，而从α-IPM到α-酮异己酸（α-KIC）的途径下游发生在细胞质中。这种细胞内区室分离会限制途径的通量，从而限制异戊基醇的总体产量（Yuan等人，2017）。Yuan等人（2017）尝试通过将α-IPM生物合成途径重新定位到细胞质中来解决这一限制，他们修改了ILV2、ILV3和ILV5，并过表达了下游基因LEU1、LEU2、ARO10和ADH7。虽然这种方法使异戊基醇产量增加了522.76 ± 38.88 mg/L，但也产生了异丁醇（540.30 ± 48.26 mg/L）和2-甲基-1-丁醇（82.56 ± 8.22 mg/L）等副产物。这表明改善途径通量可能会在代谢分支点引入竞争。这项研究首次成功重新设计了α-IPM生物合成途径，以提高酵母中的异戊基醇产量，证明酶共定位策略可以提高催化效率和产物特异性。尽管这项研究并非专门针对异戊基乙酸的生产，但它为提高异戊基醇产量提供了宝贵的代谢工程策略见解。

**共培养策略**
Zhao等人（2021）将前体途径工程扩展到非传统酵母脂肪酵母（Yarrowia lipolytica），他们过表达了Ehrlich途径基因ScBAT1、ScARO10和ScADH2，并确定ScARO10催化的脱羧步骤是关键限制步骤。使用混合启动子库进一步优化后，发现ScARO10的低表达水平可以提高异戊基醇产量，最高产量为11.57 mg/L。这表明ScARO10的过度表达可能会引入代谢负担或破坏途径平衡，而中等表达水平可以更有效地促进Ehrlich途径的通量。

**生物质作为可持续底物**
农业和农工业部门在生物精炼领域发挥着关键作用，其中废物和副产品被重新用作生物过程的宝贵原料（Chikezie Ogbu和Nnaemeka Okey，2023）。这种方法旨在最大化经济、社会和环境效益，同时最小化工业废物及其生态影响（Wagh等人，2024）。通过整合循环经济原则，农工业残渣可以转化为有价值的生物分子，减少资源消耗并促进可持续性。异戊基乙酸生物合成的生物质价值化不仅需要从可持续性的角度进行评估，还需要考虑其供应关键代谢前体的能力。与通用发酵产品不同，异戊基乙酸生物合成依赖于（i）可发酵碳源（用于细胞生长和前体生产）、（ii）支链氨基酸（特别是L-亮氨酸）以及（iii）乙酰辅酶A的可用性，这些因素共同决定了异戊基醇形成和酯化途径的通量。

从代谢角度来看，生物质衍生的底物可以根据它们在两条主要生物合成途径中的作用进行分类（图3）。富含糖的残渣如乳清、糖蜜和木质纤维素水解物主要支持从头合成途径（途径A），为酵母生长、异戊基醇生产和乙酰辅酶A生成提供碳。更复杂的底物如富含醋酸和甘醇的残渣可以通过促进中心碳代谢和增强乙酰辅酶A的可用性来支持途径A（Ding等人，2015；Martynova等人，2016）。相比之下，富含蛋白质的生物质和残渣，包括啤酒糟、油籽粕、苜蓿叶、玉米浸出液和农工业蛋白质水解物，对于基于前体的途径（途径B）更为相关，因为它们提供了包括L-亮氨酸在内的支链氨基酸，这些氨基酸可以直接进入Ehrlich途径（Mitri等人，2022年；Robertson等人，2010年；Wang等人，2020年；Giner-Chavez等人，1997年；Chiang等人，1999年）。（见图4。）下载：下载高分辨率图片（290KB）下载：下载全尺寸图片图3. 生物质增值途径的概念概述、挑战及异戊基醋酸生物合成的解决方案。下载：下载高分辨率图片（152KB）下载：下载全尺寸图片图4. 使用正癸烷在发酵过程中原位液-液萃取异戊基醋酸。这种集成设置实现了同时发酵和产品回收，其中有机溶剂（正癸烷或油醇，如Koshiba等人，2024年；Sánchez-Casta?eda等人，2018年所述）作为萃取相，选择性地从水相中分离异戊基醋酸。富含蛋白质的生物质作为异戊基醋酸生物合成中L-亮氨酸来源的潜力得到了成分数据的支持。据报道，苜蓿叶蛋白每千克干物质含有约67.6克L-亮氨酸（Giner-Chavez等人，1997年），而大豆蛋白每千克蛋白质含有约70克L-亮氨酸（Chiang等人，1999年）。这些数值表明，这样的底物可以提供足够的前体量，而无需昂贵的氨基酸补充。然而，这些数值反映了原始生物质中的总L-亮氨酸含量，而不是在发酵条件下实际可被酵母利用的部分。大多数蛋白质在其天然形式下不能被酵母直接吸收，需要通过水解释放游离氨基酸和短肽。通常需要酶处理或热处理将蛋白质转化为酵母可吸收的氮源（YAN）（Hadidi等人，2024年）。这增加了工艺成本和复杂性，在评估富含蛋白质的生物质作为异戊基醋酸生产前体的经济性时必须考虑这一点。此外，还必须考虑与现有高价值蛋白质来源（如大豆粕和苜蓿）的竞争，以避免与已建立的食物、饲料和工业价值链发生冲突。尽管生物质提供了L-亮氨酸的另一种来源，但它还含有其他几种氨基酸和YAN。这在选择性方面可能带来挑战，因为酵母的新陈代谢可能会由于竞争性生物途径将碳流导向不同的芳香和非芳香化合物（Gobert等人，2017年；Mitri等人，2022年）。复杂性源于氮代谢产物的抑制作用，即酵母优先消耗最易吸收的氮源，然后再利用不太理想的氮源（Gobert等人，2017年；Procopio等人，2015年）。这可能导致多种Ehrlich途径衍生的芳香化合物的共生产，降低异戊基醋酸的选择性并使下游纯化变得复杂。除了这些挑战之外，生物质水解物可能含有抑制性化合物，包括呋喃、酚类和有机酸，这些化合物会对酵母生长和酯类生产产生负面影响（J?nsson等人，2013年；Mussatto，2004年）。据报道，这些化合物会抑制关键酶，特别是Ehrlich途径中的醛脱氢酶和丙酮酸脱氢酶（Dack等人，2017年）。因此，当使用木质纤维素水解物作为底物时，耐受抑制剂的能力成为酵母菌株选择的重要标准。此外，农工业生物质的异质性和可变性使得工艺的可重复性变得复杂，因为其组成会因原料来源、季节和栽培方法的不同而显著变化。这些因素共同表明，生物质增值不应被视为简单的底物替代策略，而应视为一个系统级别的设计挑战，需要全面的原料表征、稳健的菌株选择和工艺级别的调整。总体而言，虽然生物质为天然异戊基醋酸生产提供了潜力，但上述挑战在实验上大多尚未得到解决。因此，将生物质作为异戊基醋酸生产的前体来源应被视为一种有前景但尚未得到充分验证的策略，在确定其实际可行性之前需要进一步研究。7. 原位产品回收（ISPR）技术用于提高异戊基醋酸的生产效率下游分离过程约占工业生物过程总成本的20-50%（Jankovi?等人，2025年）。为了提高成本效益和整体可持续性，探索在保持生产力的同时降低工艺成本的策略非常重要。在这方面，工艺强化通过整合或重新设计单元操作提供了优化生物过程的解决方案，从而提高效率，并减少能源和空间需求（Cordero-Soto等人，2021年）。随着对生物芳香化合物生产的兴趣日益增加，需要高效的提取、纯化和浓缩技术来提高回收率并最小化损失。在基于酵母的生物芳香化合物生产中，多种因素影响产品产量和整体工艺效率，包括培养基组成、中间产物和最终产物对生产酵母菌株的毒性、由于通气导致的芳香化合物损失以及转化为其他不希望的化合物（Sánchez-Casta?eda等人，2018年）。此外，产生的芳香化合物存在于含有其他代谢物的复杂培养基中，浓度非常低。这些挑战可以通过工艺强化来缓解，特别是通过原位或在线产品回收（ISPR）策略，该策略能够在目标化合物产生时连续去除和浓缩它们（Brewster等人，2024年；Karaalio?lu和Yüceer，2021年；Salas-Villalobos等人，2021年；T?njes等人，2025年）。对于异戊基醋酸而言，ISPR具有多个优势。作为一种亲脂性酯类，异戊基醋酸倾向于在细胞膜中积累，干扰细胞生长和酶活性（Saerens等人，2010年）。其挥发性（表3）也会导致通过通气而损失，从而降低其回收效率。ISPR通过实现异戊基醋酸的连续提取，确保了酵母细胞的存活并保持了酶的功能。此外，异戊醇和乙酰辅酶A酯化为异戊基醋酸是一个平衡限制反应（图1）。从发酵液中去除异戊基醋酸可以将平衡向产物形成方向移动，从而提高产量。表3. 异戊基醋酸的物理化学性质（NCBI（2025））。属性分子量（g·mol^-1）130.1825°C时在水中的溶解度（g·L^-1）2疏水性（Log Ko/w）2.2525°C时的蒸气压（mmHg）5.6相对于水的相对挥发性0.24亨利定律常数（atm·m^3·mol^-1）5.87×10^-4更重要的是，快速回收异戊基醋酸可以防止其被细胞内的IAH1酯酶水解回异戊醇（Verstrepen等人，2003年）。尽管通过基因删除IAH1可以减少这种逆反应，但ISPR通过将酯从发酵液中去除，防止其积累并接触水解酶，从而可能提高发酵性能。此外，异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应是一个平衡限制反应（图1）。从发酵液中去除异戊基醋酸可以将平衡向产物形成方向移动，从而提高产量。表3. 异戊基醋酸的物理化学性质（NCBI（2025））。更重要的是，快速回收异戊基醋酸可以防止其被细胞内的IAH1酯酶水解回异戊醇（Verstrepen等人，2003年）。尽管通过基因删除IAH1可以减少这种逆反应，但ISPR通过将酯从发酵液中去除，防止其积累并接触水解酶，从而可能提高发酵性能。此外，异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应是一个平衡限制反应（图1）。从发酵液中去除异戊基醋酸可以将平衡向产物形成方向移动，从而提高产量。更重要的是，快速回收异戊基醋酸可以防止其被细胞内的IAH1酯酶水解回异戊醇（Verstrepen等人，2003年）。虽然通过基因删除IAH1可以减少这种逆反应，但ISPR通过将酯从发酵液中去除，防止其积累并接触水解酶，从而可能提高发酵性能。此外，异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应是一个平衡限制反应（图1）。从发酵液中去除异戊基醋酸可以将平衡向产物形成方向移动，从而提高产量。更重要的是，快速回收异戊基醋酸可以防止其被细胞内的IAH1酯酶水解回异戊醇（Verstrepen等人，2003年）。此外，ISPR通过实现异戊基醋酸的连续提取，确保了酵母细胞的存活并保持了酶的功能。此外，异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应是一个平衡限制反应（图1）。从发酵液中去除异戊基醋酸可以将平衡向产物形成方向移动，从而提高产量。更重要的是，快速回收异戊基醋酸可以防止其被细胞内的IAH1酯酶水解回异戊醇（Verstrepen等人，2003年）。此外，ISPR通过实现异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应的连续提取，确保了酵母细胞的存活并保持了酶的功能。此外，ISPR通过实现异戊醇和乙酰辅酶A的酯化反应的连续提取，提高了产量、产量和可扩展性，使其成为工业规模异戊基醋酸生产经济可行性的关键组成部分（Cordero-Soto等人，2021年；Jorge等人，2025年）。7.1. 传统的液-液萃取（LLE）用于异戊基醋酸回收在LLE中，溶剂的生物相容性至关重要，因为与发酵介质的直接接触会影响酵母的存活和芳香化合物的生产（T?njes等人，2025年）。除了生物相容性外，萃取溶剂应对目标化合物具有高选择性、高分配系数以实现高效提取、低水相溶解度以及对人类和环境无毒（Chadni等人，2023年；Combes等人，2021年）。这些标准突显了从发酵过程中应用溶剂的复杂性。已有直接证据表明使用正癸烷和油醇作为萃取溶剂可以回收异戊基醋酸（Koshiba等人，2024年；Rentería-Martínez等人，2021年；Sánchez-Casta?eda等人，2018年）。这些研究没有明确报告由于异戊基醋酸积累导致的酵母抑制，可能是因为其疏水性和对有机相的亲和力使其易于分配到萃取溶剂中，从而防止在水相中与酵母细胞积累。Sánchez-Casta?eda等人（2018年）证明，使用Pichia fermentans和4 g·L^-1亮氨酸作为前体，通过正癸烷进行ISPR可以提高甘蔗糖蜜中的异戊基醋酸产量。LLE配置防止了异戊基醋酸的积累，因为在高浓度下异戊基醋酸可能对酵母有毒（Ando等人，2015年；Zimmermann等人，1985年）。此外，它通过剥离（由于通气）最小化了异戊基醋酸的损失，并能够直接量化正癸烷相中的总异戊基醋酸含量。在这些条件下，实现了26 mg·L^-1·h^-1的产量，远高于Yilmaztekin等人（2013年）在没有正癸烷提取的情况下报告的0.703 mg·L^-1·h^-1的产量，清楚地证明了原位提取对异戊基醋酸回收的好处。选择生物相容的有机相是任何基于溶剂的过程设计中的关键步骤，因为萃取溶剂与生产微生物之间的直接或间接接触会显著影响细胞存活和生产力。Sánchez-Casta?eda等人（2020年）系统地证明了这一点，他们进行了结构化的有机相筛选，用于Lactobacillus reuteri产生的3-羟基丙酸的在线反应性提取，评估了多种候选溶剂的生物相容性和提取性能。他们的结果表明，不能仅基于物理化学性质来假设溶剂的生物相容性，必须在发酵相关条件下进行直接实验评估，以确定结合适当提取性能和对生产微生物最小毒性的溶剂。虽然这项研究是用细菌宿主而不是酵母菌株进行的，并且目标化合物与异戊基醋酸在化学上不同，但该方法论框架可以直接应用于酵母中异戊基醋酸生产的ISPR系统设计。值得注意的是，尚未有针对用于异戊基醋酸回收的溶剂（正癸烷和油醇）与异戊基醋酸生产酵母菌株的生物相容性筛选（Koshiba等人，2024年；Rentería-Martínez等人，2021年；Sánchez-Casta?eda等人，2018年）。这是一个重要的空白，因为这些溶剂在长时间发酵条件下的生物相容性可能与短期批次研究或其他微生物系统中的研究结果不同，在这些ISPR策略能够可靠放大之前应解决这一问题。尽管LLE在小规模上显示出有希望的结果，但其大规模实施面临重大挑战。主要问题是在较大体积和较长时间内保持有效的相分离（Brewster等人，2024年）。在小规模下，相分离很容易发生，但在较大规模下，乳化和传质限制成为主要瓶颈。需要有效的混合以最大化提取同时最小化剪切应力，这可能会损害酵母细胞（Combes等人，2022年）。此外，溶剂回收和回收在较大规模下变得更加复杂，增加了工艺成本和操作复杂性。7.2. 基于膜的溶剂萃取（MBSE）用于异戊基醋酸回收将膜与生物反应器结合（图5）是一种有前景的工艺强化策略，可以解决LLE遇到的一些挑战。基于膜的溶剂萃取（MBSE）引入了一种多孔膜，作为发酵液和萃取溶剂之间的选择性屏障。这种配置提供了两个相之间的稳定界面，提高了传质效率，并保护酵母免受萃取相的直接暴露。与LLE不同，MBSE可以连续操作，并具有更大的工业化潜力（Cordero-Soto等人，2021年）。然而，值得注意的是，到目前为止，还没有研究直接证明MBSE用于从发酵系统中回收异戊基醋酸。因此，这种技术用于异戊基醋酸回收的潜力是从其在其他化合物中的应用推断出来的，在解释以下讨论时应记住这一点。下载：下载高分辨率图片（231KB）下载：下载全尺寸图片图5. 使用农工业残渣作为原料的潜在集成发酵-提取系统示意图，用于异戊基醋酸的生产和回收，突出了关键的上游和下游瓶颈。所提出的过程将微生物发酵与基于膜的溶剂萃取（MBSE）相结合，用于连续去除目标酯类，展示了旨在提高产量、减少抑制和改善下游回收的工艺强化方法。Cordero-Soto等人（2021年）使用中空纤维膜模块（2.5×8×50 Liqui-Cel?）在K. marxianus ITD0090发酵葡萄糖并使用L-苯丙氨酸作为前体、油醇作为溶剂的情况下，实现了2-苯乙醇（2-PE）的回收。他们报告称，产量从1.49 g·L^-1（无MBSE）增加到3.02 g·L^-1（56小时）。MBSE系统能够从生物反应器中提取2-PE，减轻了芳香化合物对酵母细胞的毒性，并提高了最终产品的浓度。类似地，Combes等人（2022年）使用MBSE和油醇从工程化的Saccharomyces cerevisiae AGB010菌株中提取了对香豆酸，实现了2.7±0.1 mg.L?1.h?1的最终产量，大约是未使用MBSE时的89%。然而，在MBSE过程结束时，只有15%的细胞保持存活，而对照组为53%，细胞活力的损失归因于泵将发酵介质通过膜模块时产生的剪切应力。尽管细胞活力有所下降，酵母仍保持了相当的生产能力，作者建议在未来基于MBSE的发酵过程中使用机械冲击较小的泵系统可以减轻细胞损伤。虽然这些结果令人鼓舞，但在将这些发现推广到异戊基醋酸回收时必须承认几个限制。首先，2-PE和对香豆酸在物理化学性质上与异戊基醋酸不同，特别是在疏水性方面，这直接影响了它们的分配行为（Athès等人，2024年）。此外，用于异戊基醋酸回收的中空纤维MBSE系统的放大引入了与压力降、流动分布和维持膜模块无菌性相关的额外工程挑战。这些差距表明，尽管MBSE在概念上是一种有前景的连续异戊基醋酸回收策略，但其在该特定应用中的直接可行性仍有待实验验证。

7.3. 异戊基醋酸的渗透蒸发（PV）回收和浓缩
渗透蒸发（PV）之前已被用于异戊基醋酸的回收，特别是在专注于脂肪酶辅助异戊基醇和乙酸酯化的研究中（Gómez-García, Dobrosz-Gómez和Taquez, 2016; Gómez-García, Dobrosz-Gómez和Osorio Viana, 2017; Osorio-Viana等人, 2014; Quintero-Arias等人, 2023）。在这些研究中，主要使用亲水膜去除酯化过程中产生的水，从而将反应平衡向异戊基醋酸的形成方向转移而不是其水解。鉴于异戊基醋酸的物理化学性质（表3），疏水性PV能够选择性地从发酵介质中回收这种芳香化合物，代表了一种有前景的ISPR技术，用于增强生物生产。Rossi等人（2017年）证明了这一潜力，他们成功地将PV作为单步下游工艺用于异戊基醋酸的回收和浓缩。PV在三种不同温度（30、45和60°C）下使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜（PERVAP? 4060，Sulzer）从用Pichia fermentans发酵甘蔗糖蜜获得的发酵液中回收异戊基醋酸，以L-亮氨酸为前体。在最佳条件下（进料流速1.5 mL min?1，45°C，渗透压0.1 kPa），PV在13小时内实现了异戊基醋酸浓度的6.68倍增加（从9.26 mg.L?1增加到61.8 mg.L?1），并在两小时后增加了32倍。6小时后，异戊基醋酸占渗透物的66.66%，13小时后占49.54%，表明该膜对这种化合物相对于发酵液中的其他成分具有显著的选择性。同样，Bianchi Pedroni Medeirosa等人（2022年）使用与Rossi等人（2017年）相同的发酵程序、PV膜和操作条件，在13小时的提取过程中获得了两个富含异戊基醋酸的组分。第一组分（在前6小时内收集）和第二组分（从第7小时到第13小时收集）分别含有66.7%和51.7%的异戊基醋酸。这进一步证实了PDMS膜对异戊基醋酸的选择性。然而，应该注意的是，这两项研究都使用了相同的酵母菌株和碳源，这限制了这些发现对其他发酵系统的普遍性。PDMS膜在不同酵母菌株、底物或发酵条件下的性能尚未报道，这是一个需要进一步研究的重要空白。

尽管这些结果很有希望，但在将这些发现推广到异戊基醋酸回收时必须考虑几个限制。首先，2-PE和对香豆酸在物理化学性质上与异戊基醋酸不同，特别是在疏水性方面，这直接影响它们的分配行为（Athès等人，2024年）。此外，用于异戊基醋酸回收的中空纤维MBSE系统的放大引入了与压力降、流动分布和维持膜模块无菌性相关的额外工程挑战。这些差距表明，尽管MBSE在概念上是一种有前景的连续异戊基醋酸回收策略，但其在该特定应用中的直接可行性仍有待实验验证。

7.3. 异戊基醋酸的渗透蒸发（PV）回收和浓缩
渗透蒸发（PV）之前已被用于异戊基醋酸的回收，特别是在专注于脂肪酶辅助异戊基醇和乙酸酯化的研究中（Gómez-García, Dobrosz-Gómez和Taquez, 2016; Gómez-García, Dobrosz-Gómez和Osorio Viana, 2017; Osorio-Viana等人, 2014; Quintero-Arias等人, 2023）。在这些研究中，主要使用亲水膜去除酯化过程中产生的水，从而将反应平衡向异戊基醋酸的形成方向转移而不是其水解。鉴于异戊基醋酸的物理化学性质（表3），疏水性PV能够选择性地从发酵介质中回收这种芳香化合物，代表了一种有前景的ISPR技术，用于增强生物生产。Rossi等人（2017年）成功地将其作为单步下游工艺用于异戊基醋酸的回收和浓缩。PV在三种不同温度（30、45和60°C）下使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜（PERVAP? 4060，Sulzer）从用Pichia fermentans发酵甘蔗糖蜜获得的发酵液中回收异戊基醋酸，以L-亮氨酸为前体。在最佳条件下（进料流速1.5 mL min?1，45°C，渗透压0.1 kPa），PV在13小时内实现了异戊基醋酸浓度的6.68倍增加（从9.26 mg.L?1增加到61.8 mg.L?1），并在两小时后增加了32倍。6小时后，异戊基醋酸占渗透物的66.66%，13小时后占49.54%，表明该膜对这种化合物相对于发酵液中的其他成分具有显著的选择性。同样，Bianchi Pedroni Medeirosa等人（2022年）使用与Rossi等人（2017年）相同的发酵程序、PV膜和操作条件，在13小时的提取过程中获得了两个富含异戊基醋酸的组分。第一组分（在前6小时内收集）和第二组分（从第7小时到第13小时收集）分别含有66.7%和51.7%的异戊基醋酸。这进一步证实了PDMS膜对异戊基醋酸的选择性。然而，应该注意的是，这两项研究都使用了相同的酵母菌株和碳源，这限制了这些发现对其他发酵系统的普遍性。PDMS膜在不同酵母菌株、底物或发酵条件下的性能尚未报道，这是一个需要进一步研究的重要空白。

尽管这些结果很有希望，但将PV与活性酵母发酵结合引入了一个重要的操作权衡。Rossi等人（2017年）证明，在45°C下异戊基醋酸的富集因子显著更高，而异戊基醋酸的最佳生物合成发生在25–30°C的较低温度范围内（Minetoki等人，1993; Quilter等人，2003; Vadali等人，2004）。发酵和提取条件之间的温度差异是设计耦合发酵-PV系统的主要挑战。一种潜在的方法是在过程中包括过滤器（以保留生物反应器内的细胞）、加热器和冷却器，使发酵液在进入膜模块之前澄清并加热到最佳提取温度，然后在回收到生物反应器之前冷却回发酵温度。这种配置将有效地分离两个单元操作的温度要求，而不会使酵母细胞暴露在与其生存能力不相容的温度下。此外，发酵液组成对膜性能的长期影响，包括污染、选择性损失和膜在长时间运行下的老化，对于异戊基醋酸回收来说仍然是一个关键限制。来自使用PDMS膜的PV耦合丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵的证据说明了实际发酵系统中膜污染的性质和严重性。Liu等人（2011年）报告称，PDMS/陶瓷复合膜与ABE发酵的直接耦合导致膜性能波动，原因是污染。微生物细胞被认为是性能下降的主要原因，而发酵液中的无机盐意外地提高了膜的选择性。重要的是，污染源于活性细胞和细胞衍生物质（包括脂质和细胞碎片）在膜表面的吸附。这一点通过扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱分析得到了证实。尽管通过简单的水冲洗可以部分恢复膜性能，但污染效应足够显著，促使开发了具有增强抗生物污染特性的氟化PDMS膜。这些改进的膜在耦合发酵-PV系统中显示出明显更高和更稳定的通量和分离因子（Zhu等人，2020年）。尽管这些研究使用的是不同的目标化合物和发酵系统，但识别的污染机制，即细胞粘附和细胞衍生物质在疏水膜表面的沉积，并不是特定于化合物的。这些机制也可能影响异戊基醋酸发酵过程中PDMS膜的性能，特别是在使用复杂农工业底物时。因此，解决这些挑战以及评估不同酵母菌株和底物下的膜性能对于成功开发异戊基醋酸生产的强化发酵-分离系统至关重要。

8. 挑战和前景
对生物芳香化合物生产的兴趣日益增长，这是因为消费者更喜欢天然来源的化合物，这些化合物在食品、制药和个人护理应用中越来越受欢迎。其中，异戊基醋酸因其特有的香蕉香味而成为最广泛使用的风味化合物之一。虽然已经证明了通过发酵进行微生物生产，但它仍然不如脂肪酶催化的异戊基醇和乙酸酯化在商业上受欢迎。此外，尽管这种芳香化合物在工业上有多种应用，但大多数基于发酵的生产进展仍然停留在实验室规模。为了促进从实验室研究向大规模生产的过渡，需要解决几个研究空白：
- 基于L-亮氨酸的途径优化：大多数研究都集中在异戊基醇作为异戊基醋酸生产的直接前体上，主要是因为它产生的产量和转化速率高于L-亮氨酸作为前体。然而，异戊基醇的使用受到其对酵母细胞毒性的限制，限制了其最佳性能。虽然L-亮氨酸补充量超过4 g.L?1的饱和效应表明从L-亮氨酸到异戊基醇的Ehrlich途径通量本质上是有限的，但尚未系统地研究针对L-亮氨酸转化为异戊基醋酸的最佳菌株工程和工艺参数组合。通过改进L-亮氨酸特异性的酵母菌株工程可以增强其转化为异戊基醋酸的能力，最大化这种相对昂贵的前体的价值。解决这一空白不仅需要工艺参数优化，还需要有针对性的代谢干预，以缓解L-亮氨酸转化为异戊基醇步骤中的通量瓶颈，并允许更全面地评估两种前体路线之间的实际和经济权衡。
- 基因改造酵母菌株的开发：迄今为止，大多数基因工程努力都集中在Saccharomyces cerevisiae上，尽管该物种本身产生的异戊基醋酸量相对较低。几种非传统酵母，包括Pichia fermentans、Pichia anomala、Williopsis saturnus和Kluyveromyces marxianus，表现出显著更高的内在异戊基醋酸生产能力，但从代谢工程的角度来看仍很大程度上未被探索。考虑到在Yarrowia lipolytica中过表达S. cerevisiae的ATF1基因已经导致了最高的异戊基醋酸产量，因此在这些高产物种中表达同源或异源ATF基因可能在Y. lipolytica中进一步提高异戊基醋酸的产量和生产力。
- 共培养策略：代谢劳动的分工是异戊基醋酸生产的一个有前景但尚未充分探索的方向，有可能将前体生物合成和酯化步骤分开。然而，共培养系统的实际实施面临几个挑战，包括维持菌株之间的稳定比例、管理竞争性相互作用、控制代谢中间体的交换以及确保大规模设置下的过程稳健性。这些是重要的工程和操作挑战，尚未在异戊基醋酸生产的背景下得到解决，不能仅基于其他生物合成系统的共培养演示来假设可以解决。
- 对下游处理的关注有限：虽然上游生物反应器优化已被广泛研究，但对下游分离和回收技术的关注相对较少。从复杂的发酵液中回收和浓缩异戊基醋酸仍然是一个重要的且未充分解决的瓶颈，考虑到通常实现的稀释浓度、化合物的挥发性和发酵基质的复杂性。需要进一步研究高效提取方法，以提高完整异戊基醋酸生产链的可行性和可行性。
- 原位产品回收（ISPR）：将发酵与基于膜的ISPR或其他回收技术结合用于高效异戊基醋酸回收的研究尚未充分探索。目前这些技术的应用依赖于重组的二元模型进料溶液，而使用复杂的农工业残渣作为发酵底物的研究仍然很少。农工业残渣（水解物和提取物）的复杂性和异质性可能会显著影响ISPR系统的性能、选择性和长期稳定性，这些通常不可适应，但必须根据具体情况进行优化。尽管存在这些挑战，ISPR也提供了过程强化的潜力，因为同时进行发酵-提取可以增加产量并通过防止损失来提高发酵性能，同时减轻中间产品和最终产品的毒性。

总体而言，解决这些挑战和空白将需要跨学科的研究努力，结合基因工程、生物过程优化和集成回收策略。这些进步对于使基于发酵的异戊基醋酸生产在经济上可行并与当前的传统方法竞争至关重要。

9. 结论
本综述提供了基于酵母的异戊基醋酸生产的批判性概述，整合了菌株多样性、代谢工程策略、生物质增值和下游回收考虑。它强调，尽管包括Pichia fermentans、Pichia anomala、Williopsis saturnus和Kluyveromyces marxianus在内的几种非传统酵母在异戊基醋酸生物合成方面表现出强大的内在潜力，但它们的报告性能在很大程度上依赖于前体补充，其工业应用目前受到监管和遗传限制。在工程化的酵母中，Yarrowia lipolytica作为一个有前景的生产宿主脱颖而出，通过协调的途径工程和过程优化实现了最高的异戊基醋酸产量。这些结果表明，有效的异戊基醋酸生产不仅需要增强单个途径步骤，还需要综合控制前体供应、乙酰辅酶A的可用性和酯化能力。除了菌株工程之外，下游处理也成为工业可行性的关键决定因素。在这方面，原位产品回收（ISPR）策略显示出过程强化的潜力，可以减轻产品毒性并提高回收效率。然而，它们与复杂发酵系统的集成在异戊基醋酸方面尚未得到充分证明。最后，尽管异戊基醋酸生产的发酵路线在天然产品标签和原料灵活性方面具有优势，但在产量、生产力、前体供应和下游回收方面仍需要显著进步，才能在工业规模上与现有的化学和酶法路线竞争。

cRediT作者贡献声明
Emmanuel Omachoko Anthony：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化、调查、概念化。
Ana Karen Sánchez-Casta?eda：撰写——审阅与编辑、验证、监督。
Claire Saulou-Bérion：撰写——审阅与编辑、验证、监督。
Marwen Moussa：撰写——审阅与编辑、验证、监督。