基于自扩增CRISPR技术的单步超灵敏检测方法，用于快速检测SARS-CoV-2及其变种

《Biosensors and Bioelectronics》：Self-amplifying CRISPR-based one-pot ultrasensitive testing for rapid SARS-CoV-2 and its variant detection

　　

Jayeon Song | Mikyung Kang | Baekdong Cha | Jeong-Chan Lee | Sunjoo Kim | Eun-Kyung Lim | Juyeon Jung | Sung Woon Lee | Ho Chul Nam | Cesar M. Castro | Hakho Lee | Taejoon Kang

韩国生物科学及生物技术研究院（KRIBB）生物纳米技术研究中心，大田，大韩民国

摘要

能够快速检测病毒变异体的分子检测方法仍然是一个亟待解决的关键需求。我们报道了一种基于CRISPR/Cas13a技术的单管检测方法，该方法将目标识别与T7启动子驱动的自我扩增环结合在一起，从而在37°C的温度下40分钟内实现指数级的荧光扩增。无需单独的预扩增步骤，该检测方法可以检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的开放阅读框1a（ORF1a）、核衣壳（N）、刺突（S）和包膜（E）RNA，检测限（LoDs）为0.32–0.96拷贝/μL，相当于阿托摩尔级别的灵敏度。一个紧凑的16孔读数器和智能手机应用程序支持实时定量和现场操作。该系统能够区分S基因的多种突变（D614G、H69-70del、D80A、L452R、P26S、A67V和A27S），并在混合变异体样本中保持特异性。在一项临床研究（n = 105例，75例阳性，30例阴性）中，该检测结果与常规逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）一致。这些结果建立了一种操作简便、无需提取的流程，能够定量检测SARS-CoV-2并识别关键突变，为即时检测（POC）核酸检测提供了一种通用架构。

引言

快速、便捷的分子诊断方法在疫情应对和常规传染病管理中仍然至关重要。公共卫生控制依赖于及时识别和隔离感染者，包括病毒载量较低的个体，而变异体鉴定对于监测和患者管理也变得十分关键。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）刺突（S）基因的突变（如D614G、H69–70del、D80A、L452R、P26S、A67V和A27S）与病毒传播能力和免疫逃逸能力的变化有关，这凸显了开发能够检测特定突变的检测方法的必要性（Carabelli等人，2023年；Harvey等人，2021年；Tao等人，2021年）。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）仍是临床金标准，但需要集中式实验室、受过培训的人员以及多步骤的操作流程，这使得其在现场应用变得复杂（De Felice等人，2022年）。这些限制促使人们开发出能够在最小基础设施条件下提供实验室级性能的即时检测（POC）核酸检测方法（Cho等人，2025年；Kim等人，2023年）。

基于簇状规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的诊断方法作为一种有前景的等温检测技术应运而生，它们利用可编程核酸酶识别功能（Guan等人，2025年；Kaminski等人，2021年；Li等人，2022年；Schalper等人，2025年；Weng等人，2023年）。特别是CRISPR/Cas13a技术将序列特异性结合与单链RNA的切割功能相结合，能够在恒定温度下产生信号（Chandrasekaran等人，2022年；Gootenberg等人，2017年；Moon等人，2025年；Patchsung等人，2020年）。然而，许多现有实现方法仍存在限制POC应用的因素：（i）依赖于单独的上游核酸预扩增步骤（例如RT重组酶聚合酶扩增（RPA）或RT环介导的等温扩增（LAMP）；（ii）半定量的侧向流式读数；（iii）对单核苷酸变异体的识别能力有限（Tang等人，2023年；Wang等人，2021年；Yin等人，2021年；Zhao等人，2015年）。

我们之前的研究已经展示了利用CRISPR/Cas13a技术检测细胞外囊泡（EVs）中mRNA突变的方法，用于癌症诊断（Song等人，2025年）。虽然我们的初步工作建立了一个自我扩增的信号生成框架，但主要限于纯化的核酸样本和受控的分析条件。将这种方法扩展到临床样本中的直接病毒RNA检测需要在更为复杂的环境中操作。特别是，样本中存在酶抑制剂、异质性样本基质以及无需提取的要求带来了巨大的技术挑战。因此，简单的概念调整是不够的，系统级的重新设计是必要的。为了解决这些问题，我们重新设计了反应缓冲液，以确保在裂解成分存在的情况下Cas13a和T7 RNA聚合酶的活性，并系统地优化了反应成分、裂解条件和信号探针的设计。这些努力表明，将自我扩增的CRISPR策略转化为实用的传染病诊断方法需要重大的方法学进步。

基于这一基础，为了满足快速、分散式病毒检测的迫切需求，我们开发了自我扩增的CRISPR基单管超灵敏病毒RNA检测（SCOUT）方法，该方法将目标识别、扩增和定量荧光读数整合到一个单管、单温度的工作流程中。由于该方法针对的是病毒RNA，因此只需进行基于裂解的预处理，无需离心或单独提取核酸。SCOUT的核心是一个经过合理设计的信号探针，它将Cas13a的切割作用与T7启动子驱动的目标模拟转录过程连接起来。当Cas13a被相应的CRISPR RNA（crRNA）-目标RNA双链激活时，切割作用会释放探针的荧光团，并同时激活T7 RNA聚合酶生成额外的目标模拟转录本，从而形成自我扩增循环。这种架构使得每个目标分子都能转化为指数级的信号增长，而无需单独的预扩增步骤。一个紧凑的16孔POC读数器和蓝牙连接的智能手机应用程序使得SCOUT方法可以在现场操作。我们实现了SCOUT作为无需提取（仅裂解）的37°C等温检测方法，40分钟内即可获得四个SARS-CoV-2基因目标（开放阅读框1a（ORF1a）、核衣壳（N）、刺突（S）和包膜（E）的定量结果。进一步地，我们使用针对七个S基因突变的特异性crRNA配置了SCOUT方法，以区分单核苷酸水平的变异体，在混合变异体样本中验证了其特异性。在105份样本（75例阳性，包括野生型（WT）、Delta和Omicron谱系；30例阴性）的临床评估中，检测结果与常规RT-qPCR一致。结合每次检测的试剂成本2.92美元（基于我们的采购和配方假设），这些结果表明这是一种可行的低成本POC实现方案。

章节片段

SCOUT方法的架构和工作流程

图1展示了SCOUT如何将样本制备、目标识别、扩增和读数整合到一个单管检测过程中。临床样本在含有RNase抑制剂的RNA裂解缓冲液中孵育10分钟，无需离心或核酸提取，然后加入SCOUT反应混合物并在37°C下孵育30分钟（图1a）。SCOUT通过将CRISPR/Cas13a的切割作用与T7启动子驱动的转录过程结合，将目标识别转化为自我增强的信号增长。

讨论

快速准确的诊断是有效传染病管理的基石（Markov等人，2023年；Zhang等人，2022年）。尽管基于CRISPR的诊断技术最近取得了进展，成功地将预扩增和Cas介导的检测整合到单管反应中，但从复杂的临床样本中直接实现阿托摩尔级别的灵敏度和单核苷酸变异体识别仍然是一个重大挑战（Arizti-Sanz等人，2020年；Ding等人，2020年；Feng等人，2021年；Joung等人）

结论

在这项工作中，我们开发了SCOUT检测方法，这是一种单管、等温（37°C）的CRISPR/Cas13a诊断平台，它将目标识别、自我扩增信号生成和定量荧光读数整合到一个步骤、无需提取的工作流程中。该平台对四个SARS-CoV-2基因目标的检测限为0.32–0.96拷贝/μL，能够区分七个S基因的单核苷酸突变，并在105份临床样本中与RT-qPCR结果完全一致。

材料和试剂

LwaCas13a蛋白购自GenScript（美国新泽西州皮斯卡特韦）。所有寡核苷酸（包括crRNA、信号探针和引物）由Integrated DNA Technologies, Inc.（美国爱荷华州科拉尔维尔）和Bioneer（韩国大田）合成。具体序列列在补充表7中。Monarch? RNA裂解缓冲液、小鼠RNase抑制剂、HiScribe? T7高产RNA合成试剂盒和Luna?通用一步RT-qPCR试剂盒购自New England BioLabs（美国马萨诸塞州贝弗利）。

CRediT作者贡献声明

Cesar M. Castro：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理。Hakho Lee：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理。Sung Woon Lee：软件开发。Ho Chul Nam：软件开发。Baekdong Cha：初稿撰写、验证、数据管理、概念设计。Jeong-Chan Lee：验证、方法学设计。Taejoon Kang：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金筹集。Jayeon Song：初稿撰写、验证、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国政府（MSIT或MOE）资助的NRF和NST项目（2023R1A2C2005185、RS-2024-00348576、RS-2024-00459749、RS-2025-00554718、2020R1A5A1018052、RS-2025-24523474、RS-2025-25423622和GTL25061-000），韩国政府（MOTIE）资助的KEIT项目（RS-2022-00154853、RS-2024-00432382和RS-2024-00403563），韩国政府（MOHW）资助的KHIDI项目（RS-2025-02213315和RS-2025-02213358），以及韩国政府（MAFRA）资助的IPET项目（RS-2024-00401639）的支持（2023R1A2C2005185、RS-2024-00348576、RS-2024-00459749、RS-2025-00554718、2020R1A5A1018052、RS-2025-24523474、RS-2025-25423622和GTL25061-000）的支持。