基于结构理解的视网膜解缠技术揭示了眼部疾病和系统性疾病背后的遗传机制

《PLOS Digital Health》：Structure-aware retinal disentanglement reveals the genetic architecture of ocular and systemic diseases

　　摘要：深度学习能够有效提取视网膜表型，但往往作为一个复杂的“黑箱”运作，掩盖了具体的遗传机制，阻碍了临床解释。为了解决这个问题，我们提出了无监督眼科特征提取（Unsupervised Ophthalmic Feature Extraction，简称UOFE）框架。我们的方法将完整的视网膜图像、视盘掩膜和血管掩膜输入到三个独立的、具有结构感知能力的自动编码器中。关键在于，这些编码器之间不共享参数，并分别进行优化，以明确编码黄斑背景、视盘和视网膜血管。模型在53,600张EyePACS图像上进行了训练，使用中值平滑核来分离背景、视盘/杯部和视网膜血管，并在15个公共数据集上严格验证了其泛化能力。与一个旨在重建整个视网膜图像的基线方法相比，UOFE在生物学分离方面表现出色，实现了左右眼之间的高结构一致性。在对75,010名英国生物银行（UK Biobank）参与者的全基因组关联研究（GWAS）中，应用严格的连锁不平衡聚类方法，UOFE识别出了255个独立的基因位点，这一数量是基线方法（31个位点）的8倍，并且揭示了与现有全局方法相比高度新颖的信号。从生物学角度来看，出现了双重分离：青光眼主要与视盘特征相关，而年龄相关性黄斑变性则与背景特征相关。在临床上，血管嵌入为糖尿病视网膜异常提供了强大的预后价值（风险比2.38，95%置信区间：2.17–2.61）。通过成功分离特定的解剖结构，UOFE将视网膜成像转化为一个可解释的精确窗口，揭示了在传统混合表示中丢失的局部遗传信号和预后生物标志物。

作者总结：视网膜底片（Retinal Fundus，RF）图像为观察眼睛和系统性疾病提供了独特的非侵入性窗口。尽管深度学习模型能够从RF图像中提取强大的视网膜特征，但它们通常作为“黑箱”运行，产生的表示难以从生物学或临床角度进行解释。为了解决这一限制，我们开发了无监督眼科特征提取（UOFE），该方法利用三个具有结构感知能力的模型来分离视网膜背景、视盘和血管。每个组成部分都独立建模，以捕获特定于结构的特征。利用超过53,000张训练图像和来自75,010名英国生物银行参与者的庞大规模遗传数据，我们证明了这种具有结构感知能力的方法提高了生物学解释性，并揭示了不同视网膜区域的独特遗传结构。例如，与青光眼相关的遗传信号主要与视盘特征相关，而年龄相关性黄斑变性则与背景特征相关。此外，血管特征为糖尿病视网膜并发症提供了有意义的预后信息（风险比2.38，95%置信区间：2.17–2.61）。因此，我们提出的UOFE框架为发现生物学和遗传机制以及临床相关的风险分层提供了更精确的工具。

引言：人类视网膜为观察身体的血管和神经状态提供了独特的非侵入性成像窗口，使得大规模研究复杂的 eye 和系统性疾病成为可能。特别是从视网膜底片（Retinal Fundus，RF）图像中提取的视网膜表型是青光眼、白内障和糖尿病视网膜异常等主要病理学的关键生物标志物。鉴于这些特征的高度遗传性，揭示视网膜形态背后的遗传结构对于阐明疾病病因和发展预测性风险模型至关重要[1,2]。然而，大多数用于全基因组关联研究（GWAS）的现有图像衍生特征（Image-Derived Features，IDFs）基于专家定义或启发式标签。这种僵化的定义往往无法捕捉视网膜变化的连续、高维谱，限制了表型分辨率，并忽略了病理生理学的微妙指标[3]。先前的大规模GWAS已经展示了RF成像在遗传发现方面的潜力。例如，对血管迂曲[4]和视盘形态[5]的遗传分析已经识别出许多与血管和神经表型相关的位点。尽管取得了这些进展，当前方法仍面临三个主要挑战。首先，视网膜的结构异质性经常被简化[6]。其次，现有的IDFs主要描述粗粒度的解剖特征，未能捕捉与疾病相关的微结构变化[7]。第三，依赖手动注释限制了可扩展性，并引入了观察者间的变异性。为了解决这些限制，无监督深度学习提供了一种有前景的替代方案，它可以直接从原始图像中自动提取特征[8]。深度学习方法通过直接从原始图像中自动提取特征提供了有前景的替代方案。虽然像TransferGWAS[9]这样的监督方法已经取得了成功，但它们严重依赖于昂贵的专家注释，并且本质上仅限于已知的疾病特征。相反，像iGWAS[10]这样的自监督框架避免了标签的需求，但通常会产生全局混合的高维嵌入。这些表示缺乏解剖学特异性，将来自不同结构（例如视盘和背景）的信号混合到一个“黑箱”潜在空间中[11,12]，这阻碍了遗传关联的生物学解释。无监督生成模型，特别是变分自动编码器（Variational Autoencoders，VAEs）[13]，通过学习紧凑的概率表示提供了有前景的替代方案。然而，标准的VAE方法通常将视网膜底片图像视为一个不可分割的实体，我们称之为“整体方法”。通过将整个图像压缩到一个共享的潜在空间中而不进行结构区分，这种整体方法存在一个关键限制：全局重建通常受到低频背景信号的支配。因此，对于临床诊断至关重要的高频细节，如周围微血管或精确的杯盘边界，在重建过程中经常被减弱或丢失[14]。这些粗糙的混合表示缺乏检测由遗传变异驱动的微妙、局部表型变化所需的敏感性。为了解决这些挑战，我们开发了无监督眼科特征提取（UOFE）框架，该框架基于一种新颖的结构感知VAE（Structure-Aware VAE，简称SA-VAE）架构。与整体方法不同，SA-VAE采用了子结构分离策略。通过明确地将视网膜分割成不同的解剖域（血管、视盘/杯部和背景），模型学习了专注于每个结构的专用、生物学上有意义的表示。通过使用超过53,000张训练图像和来自75,010名英国生物银行参与者的庞大规模遗传数据，我们证明了这种具有结构感知能力的方法提高了生物学解释性，并揭示了不同视网膜区域的独特遗传结构。例如，与青光眼相关的遗传信号主要与视盘特征相关，而年龄相关性黄斑变性则与背景特征相关。此外，血管特征为糖尿病视网膜并发症提供了有意义的预后信息。因此，我们提出的UOFE框架为发现生物学和遗传机制以及临床相关的风险分层提供了更精确的工具。

介绍：人类视网膜为观察身体的血管和神经状态提供了独特的非侵入性成像窗口，使得大规模研究复杂的 eye 和系统性疾病成为可能。特别是从视网膜底片（Retinal Fundus，RF）图像中提取的视网膜表型是青光眼、白内障和糖尿病视网膜异常等主要病理学的关键生物标志物。鉴于这些特征的高遗传性，揭示视网膜形态背后的遗传结构对于阐明疾病病因和发展预测性风险模型至关重要[1,2]。然而，大多数用于全基因组关联研究（GWAS）的现有图像衍生特征（IDFs）基于专家定义或启发式标签。这种僵化的定义往往无法捕捉视网膜变化的连续、高维谱，限制了表型分辨率，并忽略了病理生理学的微妙指标[3]。先前的大规模GWAS已经展示了RF成像在遗传发现方面的潜力。例如，对血管迂曲[4]和视盘形态[5]的遗传分析已经识别出许多与血管和神经表型相关的位点。尽管取得了这些进展，当前方法仍面临三个主要挑战。首先，视网膜的结构异质性经常被简化[6]。其次，现有的IDFs主要描述粗粒度的解剖特征，未能捕捉与疾病相关的微结构变化[7]。第三，依赖手动注释限制了可扩展性，并引入了观察者间的变异性。为了解决这些限制，无监督深度学习提供了一种有前景的替代方案，它可以直接从原始图像中自动提取特征[8]。深度学习方法通过直接从原始图像中自动提取特征提供了有前景的替代方案。虽然像TransferGWAS[9]这样的监督方法已经取得了成功，但它们严重依赖于昂贵的专家注释，并且本质上仅限于已知的疾病特征。相反，像iGWAS[10]这样的自监督框架避免了标签的需求，但通常会产生全局混合的高维嵌入。这些表示缺乏解剖学特异性，将来自不同结构（例如视盘和背景）的信号混合到一个“黑箱”潜在空间中[11,12]，这阻碍了遗传关联的生物学解释。无监督生成模型，特别是变分自动编码器（VAEs）[13]，通过学习紧凑的概率表示提供了有前景的替代方案。然而，标准的VAE方法通常将视网膜底片图像视为一个单一的、不可分割的实体，我们称之为“整体方法”。通过将整个图像压缩到一个共享的潜在空间中而不进行结构区分，这种整体方法存在一个关键限制：全局重建通常受到低频背景信号的支配。因此，对于临床诊断至关重要的高频细节，如周围微血管或精确的杯盘边界，在重建过程中经常被减弱或丢失[14]。这些粗糙的混合表示缺乏检测由遗传变异驱动的微妙、局部表型变化所需的敏感性。为了解决这些挑战，我们开发了无监督眼科特征提取（UOFE）框架，该框架基于一种新颖的结构感知VAE（SA-VAE）架构。与整体方法不同，SA-VAE采用了子结构分离策略。通过明确地将视网膜分割成不同的解剖域（血管、视盘/杯部和背景），模型学习了专注于每个结构的专用、生物学上有意义的表示。这种设计能够高保真地捕获通常在全局嵌入中隐藏的细粒度表型（例如血管迂曲）。我们通过多模态流程严格验证了该框架：通过定量指标（DCI）评估特征分离；通过多性状全基因组关联研究（GWAS）和连锁不平衡得分回归（LDSC）揭示潜在的遗传结构；并通过使用Lasso惩罚的Cox比例风险模型评估主要眼部和系统性疾病（青光眼、白内障和糖尿病视网膜异常）的临床效用。总体而言，这项研究表明UOFE在实现卓越的重建保真度的同时，揭示了新的遗传关联和稳健的预测生物标志物，建立了一个可扩展的、无需标签的精确视网膜表型分析范式。

结果：研究人群和数据特征。为了确保特征学习的稳健性，主要训练数据集来自EyePACS数据集，这是一个大规模（N > 88,000）且高度异质的队列，提供了训练稳定无监督表示所需的基本结构变异[15]。经过严格的质量控制（QC）后，从EyePACS数据集中保留了53,600张高质量图像。我们将训练好的模型应用于英国生物银行（UKB）[16]，进行大规模特征提取（N = 130,329）。为了严格验证重建保真度和跨队列的泛化能力，我们从15个独立的公共数据集中编译了约170,000张图像的多样化池。由于某些定量指标（例如LPIPS和分离评分）的计算密集型特性，样本外评估是在从这个完整复合数据集中随机抽取的1,000张图像的代表测试集上进行的。对于基因组关联分析，UKB人群被特别精炼为75,010名拥有配对的高质量视网膜成像和基因型数据的参与者。经过严格的基因型插补和过滤后，保留了5,261,211个遗传变异用于GWAS。

人口统计异质性。如表1所示，在所有基线特征方面，英语母语者和非英语母语者之间存在统计学上的显著差异（显著性阈值α = 0.05）。值得注意的是，英语母语者的年龄略高（56.01岁 vs 53.68岁），吸烟率也更高。这些人口统计差异强调了在后续的遗传和临床分析中进行严格协变量调整（包括年龄、性别和BMI）的必要性，以减轻潜在的混杂效应。

结构感知分离增强了重建保真度。为了严格验证子结构分离策略，我们在相同的1,000张外部验证集上将SA-VAE框架与整体VAE基线进行了基准测试。定量评估（见S3文件中的表B和S2文件中的图K–图P）显示，SA-VAE模型的重建保真度优于整体基线。为了确保统计稳健性，所有指标都是在10次独立重采样迭代中平均得出的；由此产生的异常低的标准差证实了学习到的表示的高稳定性和可重复性（图1）。

具体来说，视盘和背景子模型展示了近乎完美的感知质量，LPIPS得分始终低于0.04，SSIM超过0.96，这比整体基线有了显著改进，后者在全局优化方面遇到了困难（例如，整体LPIPS约为0.21）。虽然专门的视网膜血管模型产生的基于像素的指标较低（SSIM ≈ 0.30，PSNR ≈ 13–15 dB）。然而，这种明显的性能差距是这些标准指标评估非常细小、分支结构的预期结果。与广阔而密集的背景区域不同，毛细血管网络仅占图像像素的一小部分。因此，传统的像素匹配指标（如MSE或SSIM）会因为即使是微小的（亚像素）空间位移而严重惩罚模型，即使血管的整体生物形状、分支和迂曲度得到了完美保留。重要的是，感知LPIPS指标仍然具有很高的竞争力（≈0.49–0.54），证实了SA-VAE框架成功捕获了在整体信息瓶颈中通常被减弱或模糊的细粒度血管复杂性和迂曲度（图2a）。

此外，DCI分析（图2b和补充数据中的表C）定量确认了特征分离的成功。雷达图显示了三个解剖子模型的不同和功能适当的指标轮廓。特别是，视盘/杯部特征实现了非常高的信息度得分（>0.80）。这表明该子模型内的潜在维度有效地捕获了与已知几何临床生物标志物（例如杯盘比率或神经视网膜边缘宽度）的密集、高度预测性的映射。相反，背景和血管特征展示了高度稳健的分离得分，左右眼输入之间的得分几乎相同（例如，左血管D得分：0.417 vs 右：0.421）。这种结构独立性和高眼间一致性证实了SA-VAE框架成功地将各自的模型强制分离为稀疏的血管拓扑和光度纹理到正交的潜在维度。通常在标准的混合、整体架构中是无法实现的。虽然我们模型和整体基线之间的重建目标不同，不能将卓越的重建保真度完全归因于解剖学分隔，但这些发现强烈表明，我们提出的SA-VAE模型结合了明确的结构分离和生成VAE目标，有效地保留了真正的生物学特异性。

为了补充定量评估，我们进行了潜在空间扰动实验，以检查个别IDFs的生物学语义（图3；S2文件中的图H–图J）。我们评估了SA-VAE模型是否能够将视网膜信息分解为连贯且功能上有意义的组成部分。下载：PNG（更大图像）/ TIFF（原始图像）

图3. 通过空间扰动对潜在特征的定性解释。注释：图3展示了三个SA-VAE子模型中各个潜在维度调节的具体视网膜区域。黄色/红色区域表示当单个相应潜在特征被系统性地扰动时，像素级别的方差最大的区域。(a) 视网膜血管：特定于血管的特征，显示出对血管拓扑结构的区域控制。不同的特征独立编码局部微血管区域，例如弓形路径（例如，特征1，46）或周边拱廊（例如，特征4，69）。(b) 背景：特定于背景的特征，捕捉光度特性。扰动映射到空间分布的非血管区域，反映了對全局照明梯度、黄斑色素沉着和背景镶嵌模式的独立控制。(c) 视神经盘/杯：特定于视神经盘的特征，显示出高度局部化的几何特异性。扰动响应严格限制在视神经头的结构边界内，表明精确编码了局部形态（例如，杯盘比和神经视网膜边缘），而不会与周围的血管或背景成分混淆。

https://doi.org/10.1371/journal.pdig.0001376.g003

视网膜血管（拓扑特异性）。对与血管相关的潜在维度进行扰动后，显示出对血管拓扑结构的明显区域控制。例如，特征1和46主要影响弓形路径和视神经盘周围的血管，增加或减少视神经盘周围的血管拥挤，而不会在眼底其他地方引起广泛变化。其他维度，如特征4和69，在更外围的血管拱廊中显示出更强的效果；检查相应的重建图像表明这些远端区域的血管迂曲度和口径发生了协调变化。

视神经盘和杯（几何特异性）。在SA-VAE潜在空间中的扰动主要调节了几何参数。这些IDF的变化改变了杯盘比、神经视网膜边缘宽度以及视神经盘的椭圆形，而周围的血管和背景外观基本保持稳定。相应的显著性图显示响应仅限于视神经盘和杯区域，表明该模块编码的是局部几何形态，而不是全局图像风格。

背景（光度特异性）。与背景相关的IDF主要捕捉光度和纹理特性。扰动导致全局照明梯度、黄斑色素沉着密度和背景镶嵌模式的平滑变化。在几个背景显著性图中，视神经盘显示为高强度区域，反映了其在中值过滤输入中的高反射率。然而，这些扰动主要调节了视神经盘周围的局部亮度和反射率，并没有系统性地重塑视神经盘或杯的边界。这一观察结果支持了模块之间的功能分离：VAEBackground将视神经盘编码为整体亮度场中的高反照率区域，而VAEdisc-cup则将其表示为具有临床相关几何参数的结构标志。

为了表征学习到的表型的遗传结构，我们进行了多性状C-GWAS分析。我们严格地将我们的结构感知UOFE框架的发现能力与两个不同的基线进行了基准测试：一个是最先进的Vision Transformer（ViT），另一个是基于整体未分割图像训练的单一VAE基线。所有比较都是在相同的预处理图像集上进行的。首先，我们将提出的框架与标准ViT架构进行了基准测试。至关重要的是，为了确保比较不受表示大小的影响，两个模型都被配置为从完全相同的右眼血管图像中提取相同大小的128维潜在空间（详细的ViT架构和训练设置在S1文件中提供）。如图4a所示，在这些匹配的条件下，UOFE展示了显著的优势。它恢复了比ViT基线更丰富的关联景观，具有更尖锐的峰值和更广泛的基因组覆盖范围，从而证明了其卓越的整体遗传发现能力。

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图4. 基因组发现：对结构感知（SA-VAE）框架的基准测试。注释：(a) 与ViT的比较。Miami图展示了从右眼血管图像中提取的128维潜在特征空间的全基因组关联结果。上面板显示了来自单一ViT基线的关联景观，而下面的倒置面板显示了我们提出的SA-VAE框架使用相同数量的变量恢复的显著富集信号。红色虚线表示全基因组显著性的阈值（P < 5 × 10^-8）。(b) 结构解耦的验证。为了表示完整的SA-VAE框架，将三个独立流的潜在向量连接成一个统一的特征向量。这与单一VAE基线进行了比较。数字表示每个模型唯一捕获的独立基因组位点（经过严格的LD聚类后）。(c) UpSet图详细展示了这三个SA-VAE子模型和单一VAE基线之间这些独立位点的具体交集。矩阵点表示交集集，顶部条形显示每个交集的独立位点数量。红色虚线表示全基因组显著性的阈值（P < 5 × 10^-8）。灰色虚线仅作为视觉辅助，指示y轴断点的位置。

为了验证这种性能提升确实源自我们的解剖学分解策略，我们首先将UOFE（SA-VAE）框架与单一VAE基线进行了基准测试。为了严格控制LD的混淆效应，所有比较都是在独立基因组位点水平上进行的（r2 < 0.1，250 kb窗口）。在这些严格的标准下，我们的框架共识别出255个独立位点，与单一基线相比增加了大约8倍，后者在同一队列中仅检测到31个位点（图4b）。值得注意的是，这两组位点完全不重叠。这种显著的分歧是由我们方法的结构特异性驱动的：如UpSet图（图4c）所示，SA-VAE发现的255个位点中的绝大多数（>93%）主要由单一解剖学领域驱动（83个与背景相关，76个与视神经盘相关，79个与视网膜血管相关），在不同结构之间的多效性重叠最小。为了进一步将我们的发现与当前最先进的方法进行对比，我们正式将UOFE与已建立的iGWAS方法进行了基准测试。虽然iGWAS在同一数据集中识别出了113个独立位点，但与我们255个位点的重叠非常少，只有4个共享信号（S1文件中的图A）。这些定量结果共同表明，SA-VAE模型成功分离出了高频的、结构特定的遗传信号，这些信号在将整个图像合并到标准单一全局分析中时会被掩盖。

通过按解剖学领域对GWAS结果进行分层，揭示了不同的、生物学上连贯的遗传谱型，证实了学习到的表型捕获了非冗余的生物学信息（图5，S3文件中的表D-表L和S2文件中的图U）。首先，视神经盘/杯特征强烈富集了参与神经视网膜发育的位点，成功复制了在TGFBR3、SIX6和ATOH7上的已知关联。诚然，明确训练用于量化特定临床指标（如垂直杯盘比（VCDR）[17]的监督模型，对于这些隔离的性状具有更高的统计能力，识别出超过140个位点，而我们的无监督视神经盘模块仅识别出53个位点。然而，传统的汇总统计量如VCDR本质上将各种复杂的形态因素合并为一个比率。相比之下，我们的潜在特征分析允许对视神经盘的遗传结构进行更细致的剖析。例如，尽管ATOH7通常与整体视神经盘大小相关[18]，但我们的模型分离出了其对几何边缘参数的具体影响，这与杯深度完全独立。

同时，视网膜血管和背景模块中出现了不同的遗传信号（S2文件中的图U）。视网膜血管特征具体映射到血管生成和内皮路径，其特征在MEF2C、C14orf39和FGF5处有明显的峰值。相反，背景特征与色素沉着和代谢基因相关，如TYR和HERC2。如图5所示，这些色素沉着信号严格限制在背景模型中，并且在血管或视神经盘图中明显缺失。这种清晰的解剖学分隔表明UOFE框架有效地解析了眼睛的遗传结构，解决了在“全图像”或全局嵌入分析中通常被掩盖的细粒度关联。为了验证提取的IDF的生物学相关性，并展示每个解剖学流的不同效用，我们采用了连锁不平衡得分回归（LDSC）分析。这项分析揭示了遗传相关性的显著双重分离（S3文件中的图F和表M），完美地将我们的无监督结构分解与已知的临床病理学相一致。具体来说，青光眼与视神经盘IDF显示出强烈的、广泛的相关性（例如，潜在特征31），与其作为视神经病变的临床特征一致。相比之下，年龄相关性黄斑变性（AMD）与背景IDF（例如，潜在特征4）和血管IDF显示出名义上的显著相关性，但与视神经盘特征没有重叠，这与其在视网膜色素上皮和脉络膜中的主要病理学特征相匹配。此外，系统性高血压与血管衍生的IDF显示出显著的遗传重叠，这一点在MEF2C位点上的共享信号得到了支持。总的来说，这些结果不仅验证了潜在特征的生物学基础，还清楚地展示了我们多流架构的强大能力：通过分离视网膜，我们可以将复杂的系统性和眼部疾病映射到它们的具体解剖学起源。此外，我们通过基于SNP的遗传率（）估计验证了潜在特征的生物学基础。如表2所详述，背景IDF显示出最广泛的遗传率（高达76.2%显著），而杯/盘IDF产生了最强的单个遗传信号（最大 = 0.26），反映了高度可遗传的结构标记的捕获。基因组膨胀因子（）在所有类别中都接近1.0，证实这些估计代表了不受人群分层影响的真实生物学变异（图6）。

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表2. 来自视网膜表型的潜在特征的基于位点的遗传率估计摘要。

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图6. 遗传相关性分析（LDSC）的气泡热图。注释：气泡的大小对应于相关性的大小（），颜色表示方向（红色：正；蓝色：负）。P值使用Bonferroni方法进行了多重检验调整，星号表示统计显著性（* Padj < 0.05，** Padj < 0.01，*** Padj < 0.001）。

潜在特征的预测有效性和临床效用。当作为连续生物标志物进行建模时，潜在风险分数在所有表型中都显示出显著的预测能力（Padj），如森林图（图7b）所示。在血管领域，预测信号尤为显著：血管衍生的IDF产生了2.38（95% CI：2.17–2.61）的危险比（HR），每增加一个标准差（SD）的DRA。这表明，血管异常分数每增加一个SD，发生糖尿病并发症的风险就会有效翻倍——这种效应的大小突显了模型对早期微血管病理的敏感性。同样，背景和视神经盘特征与白内障和青光眼显示出稳健的关联（HR ≈ 2.0–2.1），证实了IDF捕获了疾病风险的连续谱，而不是粗略的二元类别。

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图7. 结构特定潜在特征的预测有效性和临床效用。注释：(a) 增量预测性能。箱形图显示了五种交叉验证中三种比较Cox模型的一致性指数（C-index）分布：临床基线（灰色），仅结构特定IDF的模型（蓝色），以及组合模型（红色）。(b) 使用Lasso惩罚的Cox比例风险比模型，按疾病结果划分的结构特定潜在特征的预测效应大小。森林图显示了每增加1个标准差（SD）的连续潜在风险分数的危险比（HR）。(c) 按结构特定潜在风险分数分层的Kaplan-Meier生存曲线（高风险：顶部25%；低风险：底部75%）。阴影区域代表95%置信区间（CI）。对数秩检验确认了所有疾病-结构对之间的显著分离（P < 0.0001），证明了强大的临床分层能力。

为了严格量化我们学习到的表示的临床效用，我们将其预测性能与标准临床因素和单一模型基线进行了基准测试。所有性能指标（C-index）都是使用5折嵌套交叉验证框架进行评估的。提出的SA-VAE模型在所有表型上的判别能力上均显示出一致且显著的提升（见表3和图7）。对于青光眼，视盘IDFs带来了最大的改进，C指数从临床基线的约0.714–0.727提高到了约0.764–0.767（ΔC约为0.04–0.05）。鉴于在慢性疾病预测中改进基于年龄的模型的难度，这一净提升尤为显著。在血管领域，血管IDFs显著提高了糖尿病视网膜病变（DRA）的预测能力，C指数从约0.700–0.707提高到了约0.732–0.750（ΔC约为0.03–0.04）。下载：PNG（更大图像）/ TIFF（原始图像）。表3. 通过5折交叉验证得出的眼部及系统性疾病预测性能增量总结。https://doi.org/10.1371/journal.pdig.0001376.t003。即使对于白内障，尽管其临床基线非常高（约0.76），背景IDFs也带来了统计学上显著的性能提升（ΔC约为0.01，最终C指数约为0.77），这可能是由于捕捉到了年龄单独编码无法体现的视网膜模糊的微妙信号。关键的是，与单一模型基线的比较证实了我们这种结构感知策略的必要性。如表3所示，提出的SA-VAE模型在所有疾病结果上均一致且显著优于单一模型（配对t检验，P<0.05）。这证实了明确的解剖学分离能够提取出比整体、未分割的图像嵌入更清晰、更具预测性的生物信号。风险分层能力。Kaplan-Meier分析（图7c）进一步验证了这些风险评分的临床适用性。高风险组（前25%）的生存轨迹与低风险组有显著差异（P<0.0001）。重要的是，这种分离在左右眼之间高度一致，增强了特征的生物学稳健性。对于DRA，尽管其基线发病率低于白内障，但血管特异性模型成功识别出了一个疾病进展明显加速的高风险亚群。总体而言，这些发现表明UOFE衍生的特征提供了稳定的、具有临床意义的风险梯度，超越了传统的风险因素。

讨论
在这项研究中，我们引入了UOFE，这是一种结构感知的深度学习框架，旨在克服传统“黑箱”视网膜分析中固有的可解释性和敏感性瓶颈。通过明确地将视网膜图像分解为生物学上不同的组成部分——血管、视盘和背景——我们的方法不仅实现了高保真的表型提取，还显著提高了基因发现的效率，相比单一模型基线有了显著提升。我们工作的一个核心见解是，表型分辨率决定了基因发现的效率。单一模型常常受到“掩盖效应”的影响，即主导的解剖学特征（例如视盘）会抑制来自周围毛细血管或背景纹理的微妙信号。我们的比较分析证实，UOFE有效地恢复了这些被掩盖的信号。通过采用“分而治之”的策略，为每个子结构学习独立的潜在空间，我们最大化了信噪比，从而发现了数千个标准全图像方法无法识别的独特位点。我们无监督方法的一个关键验证在于学习到的特征的生物学可解释性。针对重叠结构（例如血管穿过视盘）可能导致的潜在纠缠问题，我们的LDSC分析揭示了一个显著的基因双重分离：青光眼的遗传因素主要由视盘特征驱动，而年龄相关性黄斑变性（AMD）的遗传因素则特定于背景特征。这种清晰的区分表明，该模型在潜在空间中成功地将神经退行性疾病与代谢/色素性病理区分开来，而无需依赖监督的疾病标签。此外，尽管在重建稀疏血管网络方面存在固有挑战（如SSIM等像素级指标所反映的），我们的血管模型的生物学保真度得到了其特定映射到血管生成通路（例如MEF2C、FGF5）以及其与系统性高血压的独特关联的强有力支持。这进一步强化了“视网膜作为窗口”的假设，即视网膜血管口径和系统循环健康的共同遗传驱动因素。除了基因发现之外，UOFE框架在疾病风险预测方面也展示了强大的转化应用价值（见表3）。以往基于成像的风险模型通常依赖于主观的、手工设计的标记或缺乏解剖学特异性的“黑箱”深度学习特征。在我们严格控制的5折交叉验证基准测试中，添加结构特定的SA-VAE特征相比标准临床协变量带来了显著的预测价值增量（例如，对于青光眼，ΔC约为0.05）。关键的是，SA-VAE在所有评估的疾病中系统性地优于单一模型基线。这证实了明确编码不同结构域（如糖尿病并发症的血管拓扑或青光眼的视盘几何形状）可以防止这些关键的高频信号被全局背景所掩盖。因此，这些分离出的潜在评分作为高度敏感的生物标志物（每标准差增加HR约为1.8–2.0），为大规模人群队列中的疾病风险分层提供了可扩展、可解释的工具。

本研究有几个局限性。首先，需要将我们的无监督基因发现能力与传统的、基于假设的GWAS进行对比。在严格定义的临床指标上训练的监督模型自然会对这些孤立特征产生更高的统计功效。这是一个预期的权衡。虽然我们的SA-VAE将整个解剖区域的复杂形态压缩成一个综合表示，可能会稀释任何单一传统指标的基因信号，但其总体优势在于无假设的全局发现能力。这种无偏见的方法独特地揭示了未标注的微血管和背景结构之间的新关联，而这些是监督算法固有忽略的。其次，虽然我们的CoxPH模型证明了UOFE嵌入的强大预测效用，但我们缺乏与单一ViT或监督基线在生存背景下的直接对比。未来的研究应正式量化这种增量预测价值，并探索（半）监督学习范式——例如用疾病标签指导潜在空间——以可能进一步提高性能。第三，关于黄斑区域，我们的框架在背景模型中采用了隐式编码策略，而不是显式的结构分割。虽然这种方法有效捕获了与AMD遗传学高度相关的光度表型（例如TYR、HERC2）[22]，但它限制了对几何中心区域（如黄斑无血管区）的直接量化。未来的迭代可以加入专门的黄斑注意力模块来明确解决这些细粒度边界。最后，尽管我们的模型在多种外部成像数据集上得到了验证，但主要的基因发现和预后评估是基于欧洲血统的。大规模的跨血统复制对于确保这些结构特定基因架构的全球通用性至关重要。

结论
UOFE代表了从单一的、黑箱表示向结构感知AI在眼科领域的范式转变。通过提供一个可扩展的、可解释的、经过基因验证的框架，该工具为下一代数字生物标志物的发现和精确风险分层铺平了道路。

材料与方法
UOFE框架概述
无监督眼科特征提取（UOFE）框架（见图1）旨在通过分离精细的结构特征（视盘/杯状结构、血管和视网膜背景）来识别新的、“数据驱动”的生物标志物，并确定它们与眼部及系统性疾病和遗传结构的关联。该框架分为三个阶段：（1）结构感知特征编码，将原始图像分解为血管、视盘/杯状结构和背景成分；（2）多维验证，利用定量指标和视觉扰动来确保特征的可解释性；（3）转化应用，利用提取的特征进行眼部及系统性疾病预测和基因发现。

数据资源和研究人群
EyePACS数据集[15]是模型训练的主要资源。经过严格的质量控制[23]后，保留了53,600张高质量图像。为防止数据泄露，数据集在参与者层面被分为训练集（75%，N=40,200）和内部验证集（25%，N=13,400），确保同一参与者的图像保持在同一分区。对于大规模特征提取和基因发现，我们处理了来自UK Biobank（UKB）队列[项目ID：151140]的130,329张图像。我们的基因分析集中在75,010名具有配对的高质量成像和基因型数据的UKB参与者上（类别100315）。为了评估人口统计的稳健性，我们进一步进行了白人和非白人人群的亚组分析。为了评估模型的泛化能力，我们从大约170,000张图像的多样化池中随机抽取了1,000张图像，构建了一个独立的外部测试集（见S3文件中的表A）。

第一阶段：结构感知特征编码
成像预处理和结构分割
对EyePACS、UKB和15个公共验证数据集的RF图像进行了初步的质量控制[23]，使用Swin-MCSFNet12[23]进行处理。为了实施我们的结构感知策略，我们使用了Automorph模块[24]为特定的形态结构生成精确的二值掩码：视盘/杯状结构和视网膜血管。我们的方法将完整的视网膜图像、视盘掩码和血管掩码输入到三个独立的结构感知自编码器中。重要的是，这些流不共享参数，并分别优化以明确编码黄斑背景、视盘和视网膜血管。为了确保背景流能够准确捕捉视网膜的纹理和色素特征，我们对完整的视网膜图像应用了17×17的中值平滑核[14]。该核有意减弱了高频血管细节，同时保留了全局照明和色素密度固有的低频变化。尽管宏观地标（如视盘和黄斑）仍可作为亮度梯度识别，但这种过滤成功地将视网膜的光度特征与尖锐的几何边界分离。最终，这确保了纹理学习与结构约束解耦，迫使每个独立流仅捕获严格非冗余的生物信息。

结构特定的VAE架构和单一VAE基线
为了编码这些分离的输入，我们设计了包含三个独立VAE流的SA-VAE：VAEvessel、VAEdisc-cup和VAEbackground。所有流都采用了由5层编码器和5层解码器组成的基础卷积架构（详见S1文件中的方法）。然而，针对每个子结构实施了特定领域的修改以优化特征提取。例如，VAEvessel模型包含了锐度感知的损失项和编码阶段的dropout层，以减轻对稀疏二值血管掩码的过拟合。为了评估SA-VAE模型的性能，我们在原始的完整视网膜图像上训练了一个单一的VAE基线（VAEMonolithic）。VAEMonolithic使用与UOFE流相同的编码器-解码器架构和潜在空间维度，但优化了全局重建目标。这个基线作为对照，用于评估模型在没有显式结构分解的情况下捕捉细粒度表型（如血管细节）的能力。

模型训练和维度选择
模型在EyePACS数据集上使用NVIDIA 3090Ti GPU进行训练。我们优化了标准的变分自编码器目标函数，该函数最小化了图像重建的均方误差（MSE）和Kullback-Leibler（KL）散度，以规范潜在空间分布。我们根据验证集上的重建质量饱和点经验性地选择了每个子结构的潜在维度，从而在模型紧凑性和信息保留之间取得了平衡。最终维度设置为：[具体数值见S2文件中的图1–6]。

独立特征提取
我们提取了三组不同的潜在子模型，并将它们连接起来形成三个潜在特征。这些结构特定的集合统称为图像衍生特征（IDFs）。

第二阶段：潜在特征的多维验证
定量评估：分离和重建
为了验证UOFE是否有效分离了不同的视网膜表型，我们在UK Biobank数据集上计算了严格的定量指标。鉴于视网膜特征之间的内在生理相关性，我们首先对真实形态指标进行了主成分分析（PCA），以得出变化的正交轴[25]。我们计算了分离度、完整性和信息量（DCI）得分[26]，以评估潜在维度与真实生物因素之间的映射 exclusivity，并在10次独立重采样迭代中平均结果（每次迭代N=1,000次）以确保稳健性；以及互信息差距（MIG）[27]，它量化了特征表示的紧凑性。此外，还使用SSIM、PSNR和LPIPS评估了15个公共验证集的重建质量。

特征可解释性的定性评估
为了补充我们的定量指标，我们进行了潜在空间扰动实验，以定性解码各个IDF的生物学语义。我们在保持其他维度不变的情况下，系统地遍历了每个潜在维度。通过生成差异图（t图），空间上突出了每个特征调节的特定解剖区域。这种方法允许将抽象的潜在特征直接映射到视网膜中的局部结构变化。

第三阶段：下游临床和基因应用
为了评估学习到的表示的临床效用，我们使用Cox比例风险模型对主要的眼部和系统性疾病结果（青光眼、白内障和糖尿病视网膜病变）进行了建模。模型分别针对左右眼运行，并调整了年龄、性别、BMI、收缩压和2型糖尿病状态。同时，我们采用了5折嵌套交叉验证框架。在每次迭代中，都会训练一个带有Lasso惩罚的Cox模型，并在训练数据上优化超参数。然后将得到的模型应用于保留的测试数据，以生成无偏的样本外风险评分。预测性能仅通过这些样本外评分来评估，使用的方法包括一致性指数（C-index）、每标准差增加的危险比（HR）以及Kaplan-Meier生存分析。

**遗传关联和结构分析**
首先，我们使用GCTA [28]估计每个潜在特征的基于SNP的遗传率（），以确认提取的IDFs能够捕捉可遗传的生物变异，而不是成像噪声。接着，我们使用fastGWA工具（GCTA）[28]对提取的IDFs进行单性状GWAS分析，并结合英国生物银行提供的前10个主成分（PCs）、年龄、性别和基因分型阵列来推断遗传祖先。为了提高统计功效并捕捉相关潜在特征之间的多效性效应，我们采用了多性状GWAS框架（C-GWAS）[13]。为了全面评估整个UOFE框架，从三个独立的SA-VAE流中提取的个体潜在向量在关联测试之前被合并为一个统一的特征表示（见图4）。对于特定流的分析（见图5），则分别在C-GWAS流程中独立评估每个解剖学流的潜在向量。最后，为了验证我们的IDFs的生物学相关性（而不仅仅是定位发现），我们利用连锁不平衡评分回归（LDSC）来估计与已知临床表型（例如青光眼、AMD）之间的遗传相关性（）。这项分析确定了我们的无监督特征的遗传结构是否与已知的疾病生物学特征有重叠，从而为其功能重要性提供了稳健的独立验证。

**支持信息**
**参考文献**