综述：通过化学启发式酶促转化拓展生物合成的化学空间

《Current Opinion in Biotechnology》：Expanding the chemical space of biosynthesis through chemistry-inspired enzymatic transformations

　　

本综述重点介绍化学启发式酶催化的近期进展，尤其聚焦于依赖血红素（heme）、黄素（flavin）、烟酰胺（nicotinamide）、硫胺素焦磷酸（thiamine diphosphate, ThDP）及磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate, PLP）的酶所介导的转化反应。研究人员探讨了有机化学原理如何被应用于拓展酶的催化反应性，使其超越天然生物学功能，从而实现自然界中不存在的多种转化。此外，近期研究表明，这些反应可被整合至代谢途径中，实现天然代谢范围之外的分子合成。上述进展共同表明，化学启发式酶促转化能够拓展通过生物合成可获得的化学空间。

Introduction

酶在生物合成中占据核心地位，其调控复杂的代谢网络，使生物体能够在生理条件下合成结构多样的分子。基因组测序与生物信息学的进步揭示了自然界中庞大的酶资源库，凸显了生物系统编码的卓越催化潜力。然而，天然代谢中的酶促反应范围反映的是进化必要性而非化学可能性——尽管酶具有极高的效率与选择性，其天然反应性并未涵盖现代合成化学的全部范畴，许多当代有机合成的核心成键反应在经典代谢途径中并无直接对应。这一局限推动了研究范式向“拓展酶反应性至天然代谢边界之外”转变：传统观点认为酶是代谢途径中仅介导单一特定反应的专用催化剂，但受有机化学原理启发的近期研究挑战了这一认知，证实许多酶拥有超出其天然生物学功能的潜在催化能力。早期代表性工作来自Dawson团队，其受铁-卟啉催化研究启发，发现兔肝微粒体来源的细胞色素P450可催化氮宾转移反应，证明血红素辅因子能够介导其经典单加氧活性之外的化学反应。当前学界日益将酶视为可实现目标化学转化的可调平台，而将上述化学启发式酶促转化整合至代谢网络中，最终有望实现天然细胞代谢范围之外的非天然分子生物合成。本综述将“化学空间”定义为通过生物合成可获得的分子结构与转化范围，涵盖键型、官能团与反应机制的多样性；化学启发式酶促转化通过实现天然代谢途径中不存在的新结构与转化，具备拓展该空间的潜力。本综述将围绕支撑此类转化的辅因子骨架，系统讨论拓展生物合成化学空间的关键近期进展，重点关注依赖heme、flavin、nicotinamide、ThDP与PLP的酶相关研究，并进一步探讨将这些转化整合至代谢途径、构建拓展生物合成网络的新兴工作，阐明酶在获取新化学空间、实现超天然代谢分子生物合成方面的潜力。

Advances in chemistry-inspired enzymatic transformations

Carbene- and nitrene-transfer reactions catalyzed by heme proteins

血红素依赖酶是化学启发式酶促转化的最典型代表，尤其在卡宾与氮宾转移反应中表现突出。继Dawson团队的奠基性工作后，Frances H. Arnold团队建立了利用定向进化改造天然血红素蛋白以实现非生物转化的通用策略：2013年，受铁-卟啉卡宾转移化学启发，该团队报道了经工程改造的Priestia megaterium来源细胞色素P450 BM3变体，可催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯的立体选择性环丙烷化反应——野生型酶仅表现出极低催化活性与较差立体选择性，经多轮定向进化获得的变体则实现了活性显著提升与高立体选择性。此后该团队进一步拓展了细胞色素P450 BM3变体的催化谱，实现包括卡宾C–H插入、C–H胺化与氮丙啶化在内的多种卡宾与氮宾转移反应；近期计算与机器学习引导的定向进化策略进一步优化了序列空间探索效率，加速了催化非天然反应酶的设计进程。后续研究证实该催化能力可拓展至更广泛的血红素蛋白：Fasan团队证明工程化抹香鲸肌红蛋白变体可催化系列卡宾与氮宾转移反应；Hilvert团队通过引入遗传编码非天然氨基酸修饰血红素近端配体，进一步拓展了该平台；Arnold团队则工程化了嗜热生物的细胞色素c与原珠蛋白等耐热血红素蛋白，其中Rhodothermus marinus来源细胞色素c的工程化改造实现了C–Si与C–B等非天然键的形成，拓展了生物催化的化学空间。除天然酶骨架外，近期研究证实de novo设计的人工血红素蛋白也可催化环丙烷化反应，凸显了蛋白质设计在构建全新化学启发式生物催化平台方面的潜力；本团队提出的数据库挖掘策略则为拓展非生物酶反应性提供了蛋白质工程之外的补充路径，通过系统筛选数据库中多样化的血红素蛋白，无需大量定向进化即可鉴定出可催化立体发散性环丙烷化的未表征微生物球蛋白。除卡宾与氮宾转移反应外，血红素蛋白还被重新用于更广泛的非生物转化：Yang团队证实工程化P450 BM3变体可催化卤原子转移反应，凸显了血红素酶在非天然自由基过程中调控自由基加成与卤反弹步骤的能力；Ward团队证明重编程肌红蛋白可作为非生物不对称酮还原酶，并将Fe–氢化物化学拓展至不对称氢原子转移反应，确立了血红素蛋白作为自由基氢官能化平台的地位；本团队则证实Nocardioides simplex来源醛肟脱水酶可催化非活化环状酮肟的自由基开环，揭示了一种不寻常的亚胺基自由基化学催化模式。上述研究共同表明，血红素蛋白可支持远超天然代谢范围的化学反应，极大拓展了酶催化的可及化学空间。

Photoredox reaction catalyzed by flavin- and nicotinamide-dependent enzymes

黄素依赖酶已成为化学启发式酶促转化的多功能平台。黄素辅因子可参与单电子转移（single-electron transfer, SET）过程与光诱导氧化还原反应，能够实现类似合成化学中光氧化还原反应的 non-natural 催化模式。Hyster团队基于该特性开发了黄素依赖酶的光氧化还原化学，可在温和条件下实现具有高化学、区域与立体选择性的多种自由基转化，其中工程化烯还原酶被证实可在光化学与基态条件下催化对映选择性氢原子转移、不对称自由基环化与分子间自由基加成，确立了黄素依赖酶作为不对称自由基生物催化核心平台的地位；Xiaoqiang Huang与Huimin Zhao团队也证实黄素依赖的光酶催化可支持广泛的自由基转化，证明光激发黄素辅因子可在温和条件下介导多种非天然反应。除黄素辅因子外，Hyster团队还探索了NADH等烟酰胺辅因子作为酶促自由基转化中的光活性氧化还原介质，证实光激发NADH可在酶活性位点生成活性自由基中间体，实现温和条件下的非天然转化，进一步拓展了光氧化还原驱动酶催化的工具箱。

Radical acylation catalyzed by thiamine-dependent enzymes

硫胺素焦磷酸（ThDP）依赖酶是另一类可被拓展至经典羰基转化之外的多功能生物催化剂。天然代谢中，ThDP酶通常催化涉及Breslow中间体的两电子反应；但有机化学近期研究证实，在合适的一电子氧化剂辅助下，Breslow中间体也可参与自由基化学。受此启发，Xiaoqiang Huang团队证实Pseudomonas fluorescens来源苯甲醛裂合酶经工程改造后，可与伊红Y、Ru(bpy)₃等光催化剂协同，通过对酶结合Breslow中间体的一电子氧化实现不对称自由基酰化；Yang团队也报道了结合荧光素光催化剂的Pseudomonas putida来源苯甲酰甲酸脱羧酶光酶平台，用于不对称自由基酰化。本团队则证实同为ThDP依赖酶且活性位点同时含有黄素腺嘌呤二核苷酸的乙酰乳酸合酶，可催化α-溴羰基化合物与N-酰氧基邻苯二甲酰亚胺的自由基酰化反应，该体系中自由基生成由固有黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子介导，无需外加光催化剂即可实现短寿命自由基在酶活性位点的可控偶联。

Noncanonical amino acid synthesis catalyzed by pyridoxal phosphate-dependent enzymes

磷酸吡哆醛（PLP）依赖酶是天然代谢中催化多种转化的核心酶类之一。Arnold团队的早期工作已开发出可合成多样非经典色氨酸类似物的色氨酸合酶β亚基（TrpB）工程变体，奠定了PLP依赖酶合成应用的基础；2023年，Yang团队为拓展PLP依赖酶的经典反应性，通过将光氧化还原化学与酶促吡哆醛催化融合，开发了TrpB的新型自由基模式：光氧化还原活化生成的自由基可被PLP结合的氨基酸中间体捕获，实现非经典氨基酸合成中的立体选择性C–C成键。后续研究进一步拓展了这一概念，通过工程化PLP依赖酶介导的自由基偶联反应，获得了包括α-、β-、γ-与δ-取代手性氨基酸在内的更广泛产物谱。

Other enzymatic platforms for chemistry-inspired transformations

除上述主要辅因子类酶外，多个其他酶家族也被重编程以拓展酶促转化的化学空间。非血红素铁酶已成为自由基介导成键反应的重要平台：Xiongyi Huang团队证实Streptomyces avermitilis来源4-羟基苯丙酮酸双加氧酶经工程改造后，可通过可控氢原子转移与自由基反弹过程催化非天然自由基接力C–H官能化，后续研究进一步将该概念拓展至非血红素铁酶介导的更广泛自由基转化。钴胺素依赖酶也可作为非生物自由基反应的催化平台：受钴四吡咯配合物自由基化学启发，Lewis团队证实钴胺素依赖酶CarH可通过Co–C键均裂催化非生物自由基加成反应。近期研究还显示I型醛缩酶可被重编程催化非天然自由基偶联反应，进一步丰富了可用于化学启发式转化的酶骨架多样性。上述研究共同表明，超出主要辅因子类的酶骨架正越来越多地被开发为化学启发式非生物催化的载体。

Construction of non-natural biosynthetic pathways

将非生物酶促反应整合至细胞代谢中是拓展生物合成系统化学空间的有力策略。天然生物合成途径受限于生物学进化出的反应，而引入化学启发式转化可使细胞系统获得全新类别的分子与生物合成途径。前述多数工作主要从合成化学视角开发非生物酶催化，而近期研究已开始将这些化学启发式反应直接整合至细胞代谢网络：通过将此类转化嵌入生物合成途径，工程化细胞可直接从简单原料生产非天然化合物，极大拓展生物制造的可及化学空间。Hartwig、Keasling团队报道了将卡宾转移化学完全整合至微生物生物合成的重要进展：通过在Streptomyces albus中重构天然重氮化合物氮丝氨酸的生物合成途径，实现了胞内卡宾前体的生成，随后通过工程化细胞色素P450-T2催化的环丙烷化反应，将其与生物合成的苯乙烯偶联——该非生物转化所需的卡宾供体、底物与催化剂均由微生物宿主自身产生，无需外源试剂，建立了可将非生物卡宾转移反应完全嵌入细胞代谢的可扩展平台。Zhao团队则证实光酶反应也可整合至微生物生物合成途径：设计的工程化Escherichia coli菌株可将黄素依赖酶的光酶催化与烯烃底物的胞内生物合成耦合，在蓝光照射下实现包括加氢烷基化、加氢胺化与加氢磺酰化在内的多种自由基转化，生成多样非天然产物；该团队还进一步展示了基于发酵的光生物合成，并在生物反应器系统中实现了放大，凸显了光驱动酶反应在微生物生产中的应用潜力。这两项研究清晰展示了化学启发式转化如何从体外酶催化转化为代谢编码的生物合成途径。尽管这些概念验证研究是该领域的重要进展，但面向实用化生物合成系统的进一步发展仍需应对体内实施特有的挑战：其中一个核心是酶活性、底物特异性与底物亲和力的匹配——体外研究通常在高底物负载下追求广谱底物兼容性，而体内代谢网络要求低底物浓度下的高底物特异性与高效催化（体现为低K_m值），以减少与天然酶的竞争。弥合体外研究与体内性能之间的差距，对推动化学启发式转化走向稳健生物合成应用至关重要；提升酶的选择性与催化效率（k_cat/K_m），可优化非天然生物合成途径的性能，缓解重氮化合物或自由基前体等高活性、高毒性非天然试剂带来的挑战。

Conclusion and outlook

长期以来，酶被视为仅在天然代谢范围内发挥作用的催化剂，但本综述讨论的研究表明，酶的催化反应性可超越生物途径中的已知反应。通过基于有机化学原理重释酶辅因子的内在化学性质，研究人员已发现酶可催化的广泛化学启发式转化，证实heme、flavin、nicotinamide、ThDP与PLP等多种辅因子均具备可被开发的潜在催化能力，以实现“新到自然”（new-to-nature）的反应。另一个重要的新兴前沿是将这些化学启发式转化整合至代谢网络：近期将非生物卡宾转移与光酶反应嵌入微生物代谢的研究已表明，构建融合天然代谢反应与新到自然酶化学的非天然生物合成途径正逐渐成为可能，此类杂合代谢网络可使微生物从简单原料生产具有多样键型与官能团的新型分子，极大拓展生物合成的化学空间。展望未来，蛋白质工程、计算酶设计与机器学习引导酶发现的持续进展，将加速能够介导日益多样化学转化的酶开发；与此同时，合成生物学与代谢工程的进步将实现更复杂的细胞内代谢嵌入策略。此外，过去二十年探索的非天然金属辅因子引入等替代策略，也为拓展生物合成化学空间提供了多元路径。上述发展共同指向一个未来：化学启发式酶催化将成为拓展生物合成系统的核心组成部分，实现远超出天然代谢化学空间的分子生产。