脂质体与脂质纳米颗粒：高级化学与结构表征技术教程

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Liposomes and lipid nanoparticles: a tutorial for advanced chemical and structural characterisation

　　卡特琳娜·米内利（Caterina Minelli）| 杰里米·帕罗（Jeremie Parot）| 恩里卡·阿拉索纳蒂（Enrica Alasonati）| 安妮卡·阿尔茨卡尔（Annika Altsk?r）| 大卫·J·H·坎特（David J.H. Cant）| 乔纳森·D·P·库恩塞尔（Jonathan D.P. Counsell）| 乔治亚·达尔·潘（Giorgia Dal Pan）| 瓦伦丁·德·卡尔萨拉德·杜邦（Valentin de Carsalade du Pont）| 尤里·安东尼奥·迪亚兹·费尔南德斯（Yuri Antonio Diaz Fernandez）| 拉维尼亚·丽塔·多韦里（Lavinia Rita Doveri）| 尼古拉斯·恩格尔（Nicholas Engel）| 迈克尔·贾尔斯（Michael Giles）| 马蒂厄·热尔曼（Matthieu Germain）| 克里斯蒂安·戈尔维策（Christian Gollwitzer）| 威廉·A·李（William A. Lee）| 阿丽奇亚·莫尔斯卡（Alicja Molska）| 弗朗西斯·姆潘巴尼（Francis Mpambani）| 托本·尼尔森·平格尔（Torben Nilsson Pingel）| 劳伦斯·普尔（Laurence Poul）| 弗朗切斯卡·罗达（Francesca Roda）| 彼得·谢瓦尔（Peter Sj?vall）

英国国家物理实验室，汉普顿路，泰丁顿，TW11 0LW

摘要

脂质体（Liposomes）和脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）是现代药物递送策略的核心，但由于其结构复杂性以及缺乏统一的分析标准，对其可靠性的表征仍然具有挑战性。在这项研究中，我们评估了一系列已建立和新的尺寸、结构和化学表征方法，这些方法应用于一系列定义明确的LNP配方以及两种具有不同组成和稳定机制的脂质体系统。低温透射电子显微镜（Cryogenic Transmission Electron Microscopy）直接可视化了颗粒的形态和层状结构，揭示了均质单层脂质体与异质多层脂质体之间的明显结构差异，并确认了LNP样品的结构一致性。用于流体中颗粒的尺寸方法提供了互补的尺寸指标，并突出了分辨率差异以及方法依赖的伪影，尤其是在多分散样品中。其中，小角X射线散射（Small Angle X-ray Scattering）在天然液体条件下解锁了包括双层厚度和多层间距在内的结构信息，而针对核糖核酸（RNA）的特异性检测方法提供了总RNA和封装RNA的稳健定量。先进的电子光谱和质谱技术进一步揭示了表面化学特性，并且关键的是，能够在单颗粒尺度上进行分子水平分析。这些结果共同表明，没有一种单一技术能够完全捕捉基于脂质的递送系统的复杂性。相反，一种基于计量学的多模态方法是生成可靠、可重复数据集和支持未来纳米医学配方表征和质量控制标准发展的关键。

1. 引言

脂质体和脂质纳米颗粒（LNPs）已成为现代药物递送中最常见的载体，它们能够保护并运输核酸、小分子和肽，同时提高生物利用度、降低毒性并控制释放特性。脂质体最初在20世纪60年代被描述，已经从简单的单层囊泡发展到复杂的配方，例如聚乙二醇缀合（PEGylated）系统，例如Doxil?，该系统于1995年获得了监管批准（Gabizon等人，1997年）。最近，LNPs作为RNA治疗的递送载体变得越来越重要，例如Onpattro?（siRNA，2018年）（Akinc等人，2019年）以及mRNA疫苗Comirnaty?和Spikevax?（欧洲药品管理局，2025年，Kulkarni等人，2018年，Polack Fernando等人，2020年），这证明了这些平台的临床和商业相关性（Lu等人，2024年）。LNPs和脂质体在组成、内部结构和稳定策略上有所不同：脂质体通常由磷脂和胆固醇组成，可选地添加PEG化修饰，而LNPs通常包含可电离的阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG脂质，形成可以封装核糖核酸（RNA）或其他带电大分子的异质结构（Tenchov等人，2021年）。

基于脂质的纳米颗粒的多样性推动了用于其表征的分析程序的并行扩展。尺寸和结构属性，如颗粒大小、多分散性、层状性和形态，通常通过动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）、颗粒跟踪分析（Particle Tracking Analysis, PTA）、非对称流场流分离（Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation, AF4）结合多探测器、低温透射电子显微镜（Cryo-TEM）和小角X射线散射（Small Angle X-ray Scattering, SAXS）来评估（Dao等人，2024年；Parot等人，2024年）。化学和组成分析通常涉及质谱和RNA特异性定量检测方法，如毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光（Capillary Gel Electrophoresis–Laser-Induced Fluorescence, CGE-LIF）和RiboGreen?（Parot等人，2024年），但也有先进的方法出现，如低温X射线光电子能谱（Cryo-XPS）（Cant等人，2023年）和二次离子质谱（Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS）（Fumagalli等人，2025年；Kotowska等人，2025年）。虽然每种技术都提供了互补的信息，但它们在分辨率、通量、灵敏度和可访问性方面有所不同。例如，低温TEM提供了高分辨率的结构细节，但资源密集且不适合常规质量控制（QC），而DLS和PTA快速且高通量，但不提供结构信息（Wu等人，2024年）。SAXS在天然条件下提供了集合平均结构信息，但依赖于建模假设，对于异质群体来说信息量较少。AF4能够温和地分离多分散样品，当与多探测器系统结合使用时，可以更准确地实现尺寸分辨表征，从而产生丰富但复杂的数据集（Graewert等人，2023年）。

尽管方法工具箱不断增长，制药行业在协调分析数据以支持监管和质量控制方面仍面临重大挑战。监管机构越来越期望有稳健的物理化学表征来支持配方质量、稳定性和可重复性，特别是对于像mRNA-LNPs这样的复杂制剂。现有的脂质体和LNP产品标准仍然有限：ISO/TS 4958（2024年）定义了脂质体配方的术语，而ASTM标准（例如E3297-21、E3409-24、E3482-25）描述了脂质定量、AF4分离和RNA测量的分析方法。然而，目前还没有全面的标准来关联不同方法之间的尺寸、结构和化学属性，这在监管提交过程中造成了不确定性。弥合这一差距需要基于计量学的多模态表征策略，以生成可重复、可追溯的数据集，以支持纳米医学配方的表征和质量控制的发展。

本教程论文旨在通过比较分析定义明确的类似Onpattro的LNPs、一个类似Moderna的LNP样品以及两种具有不同组成和稳定策略的脂质体系统来解决这些未满足的需求。我们的目标是：（i）展示结构、尺寸和化学分析方法的互补性；（ii）突出方法依赖的伪影、分辨率差异和局限性；（iii）提供数据整合的指导，以支持基于脂质的纳米颗粒的稳健、可重复的表征。我们不仅讨论了已建立的技术，如DLS、PTA、cryo-TEM、SAXS和多探测器场流分离（MD-FFF），还讨论了先进的方法，包括低温飞行时间SIMS（Cryo-TOF-SIMS）、低温XPS（Cryo-XPS）和FFF-SAXS。尽管这些方法由于需要专门的设备和专业知识而在工业中的应用可能有限，但它们对于方法验证和确认以及测量可追溯性非常重要，从而提高了整体测量的一致性和可重复性。我们讨论了它们对工业需求、质量保证和监管考虑的相关性。

本研究强调的关键方面包括理解不同方法之间尺寸和结构测量的关系、组成和表面化学对流体力学和电子密度测量的影响，以及封装效率和RNA定量在评估LNP质量中的关键作用。此外，这项工作强调了这些测量对监管框架的相关性：尺寸均匀性、层状性、表面组成和RNA完整性是在提交研究性新药和生物许可申请时密切监控的参数，正如美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）和欧洲药品管理局（European Medicines Agency）的纳米医学表征指南中概述的（Food and Drug Administration 2022年，European Medicines Agency 2025年，de Vlieger等人，2019年）。

本教程作为计量学驱动的参考，为研究人员和行业专业人士提供了关于选择和组合技术以全面表征基于脂质的纳米颗粒的实际见解。通过将方法选择与监管期望联系起来，并突出标准化方面的差距，本研究旨在支持下一代基于脂质的治疗药物的发展，以提高可重复性、质量控制和监管合规性。

2. 材料与方法

2.1. 基于脂质的纳米颗粒的制备

表1总结了本教程中使用的脂质体和LNP配方示例。

表1. 脂质体（LIP）和脂质纳米颗粒（LNP）样品的详细信息。

样品名称 | 脂质组成 | 装载量 | N/P缓冲液 |
| --- | --- | --- | --- |
| LIP1 | 类似Doxil的HSPC-胆固醇-DSPE-PEG 2000（55/40/5） | 无 | 25 mM HEPES/ 150 mM NaCl |
| LIP2 | SPE-胆固醇（50/50） | 无 | 25 mM HEPES/ 150 mM NaCl |
| LNP1 | 类似Onpattro的MC3/DSPC/CHOL/DMG-PEG（50/10/38.5/1.5） | F7 siRNA | 3.3 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 + 10% sucrose |
| LNP2 | 类似Onpattro的MC3/DSPC/CHOL/DMG-C-PEG（50/10/38.5/1.5） | mRNA | 15 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 |
| LNP3 | 无 | 无 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 |
| LNP4 | 类似Onpattro的MC3/DSPC/CHOL/DMG-PEG（50/10/38.5/1.5） | mRNA | 6 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 + 10% sucrose |
| LNP5 | 类似Moderna的SM-102/胆固醇/DSPC/PEG-DMG（50/38.5/10/1.5） | mRNA | 6 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 |
| LNP6 | 类似Moderna的SM-102/胆固醇/DSPC/PEG-DMG（50/38.5/10/1.5） | 无 | 无 | 10 mM TRIS-HCl, pH 7.5 |

用于制备脂质体配方的脂质从Avanti Polar Lipids（Croda）购买。LIP1由氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC，55% mol）、胆固醇（40% mol）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（18:0 PEG2000:PE，5% mol）组成。LIP2由1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（琥珀酰）钠盐（SPE，50% mol）和胆固醇（50% mol）组成。脂质体是通过脂质薄膜再水化方法制备的，其中脂质在氯仿中溶解，然后蒸发形成薄干膜。然后用所需体积的25 mM HEPES和150 mM NaCl在pH 7.4下水化以达到所需的脂质浓度。使用Thermobarrel挤出机（LIPEXTM Extruder，Northern Lipids）在受控温度和压力下校准脂质体的大小。挤出在60°C下进行，压力为100-300 kN/m2（LIP1）或500-1000 kN/m2（LIP2），使用0.4 μm孔径的聚碳酸酯（PC）膜8次（LIP2），然后使用0.4 μm PC膜3次，接着使用0.22 μm PC膜3次，最后使用0.1 μm聚偏二氟乙烯膜3次（LIP1）。

对于LNP配方，可电离的阳离子脂质SM-102（9-十七烷基8-{(2-羟乙基)[6-氧-6-(十一烷氧)己基]氨基}辛酸酯，MedChemExpress）、D-Lin-MC3-DMA（(6Z,9Z,28Z,31Z)-十七三萜-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯，Broadpharm，（LNP1）和MedChemExpress（LNP2-LNP4））、辅助脂质二硬脂酰-sn-甘油磷脂（18:0 PC，或DSPC，Avanti Polar Lipids）、胆固醇（Avanti Polar Lipids（LNP1）或Sigma-Aldrich，目录号C8667（LNP2-LNP6）和聚乙二醇（PEG）脂质（PEG2000-DMG，Avanti Polar Lipids用于LNP1，LNP4-LNP6和PEG2000-C-DMG，MedChemExpress，用于LNP2-LNP3）以50:10:38.5:1的摩尔比溶解在纯乙醇中，总脂质浓度为10 mM。定制的人类凝血因子VII siRNA（F7-siRNA，Horizon Discovery Biosciences，LNP1）或mRNA（CleanCap? Firefly Luciferase mRNA，TriLink Biotechnologies，LNP2,4,5）稀释在乙酸缓冲液（25 mM，pH 4）中。表1报告了可电离脂质上的胺基与mRNA上的磷酸基的摩尔比（N/P比）。LNP3和LNP6不包含mRNA。LNP样品使用T型接头混合器（CapTite Interconnect Tee，LabSmith）连接到两个自动注射泵（New Era泵系统）进行流动混合制备。脂质乙醇溶液和mRNA水溶液以总流量12 ml/min注入T型接头，有机相与水相的流量比为1:3。配方后，mRNA-LNPs在Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 7.5）中透析过夜，使用10 KDa分子量截留的透析盒（Slide-A-Lyzer? G2，Thermo Scientific?），除了LNP1在10 mM tris中加入10% sucrose的10倍体积中通过100 KDa孔径的再生纤维素膜（Amicon，Millipore）在1800 g下超速离心。LNP2-6在1100g下使用超速离心过滤器（Amicon，Regenerated Cellulose，100,000名义分子量限）浓缩10倍。通过基于强度的MADLS分析在25°C下监测LNP的短期稳定性，时间点为0小时、4小时和24小时。LNP1的长期稳定性在冷藏（4°C）和冷冻（-20°C）储存条件下进行评估（详见SI和图S1）。

2.2. 低温透射电子显微镜（cryo-TEM）

脂质体和LNPs均通过cryo-TEM进行表征。从得到的显微照片中提取了几何尺寸、尺寸分布、圆度和多层性（对于脂质体）。

样品通过 plunge-freezing 方法玻璃化，并在约-180°C下成像。使用Thermo Scientific Mark IV Vitrobot和Leica EM GP2进行样品制备。数据采集使用Thermo Scientific 200 kV FEG Talos Arctica cryo-TEM和200 kV JEOL JEM-2100Plus TEM。Quantifoil R2/1、Quantifoil Multi A和lacey碳TEM网格作为支撑膜。每种样品悬浮液施加3 μl的体积到网格上。LIP1在Milli-Q水中以1.5 mg/ml的浓度制备，而LIP2在HEPES/NaCl缓冲液中以15 mg/ml的浓度沉积。LNP1以1.85 mg/ml的脂质浓度制备，而LNP2和LNP3在MilliQ水中以1.2 mg/ml的浓度制备。网格类型的选择基于预期的颗粒大小和表面覆盖率，以最小化过度拥挤并确保最佳颗粒分布。使用的校准像素大小在2.3 ?/pixel到5.8 ?/pixel之间，失焦设置在-1.0 μm到-5.0 μm之间。

脂质体的分割、分类和量化使用Fiji/ImageJ（纳瓦拉大学应用医学研究中心）开发的半自动化宏程序进行，详细信息见SI的第S2节（Schneider等人，2012年；Doveri等人，2025年）。

2.3. 动态光散射（DLS）和颗粒跟踪分析（PTA）

DLS和PTA都测量具有等效扩散系数的固体球体的流体力学半径。DLS测量并时间相关地关联了一组通过布朗运动移动的颗粒集体散射的光强度波动，而PTA通过显微镜可视化从单个颗粒散射的光，并从颗粒到颗粒的基础上推导出个体扩散系数。扩散系数通过斯托克斯-爱因斯坦方程转换为粒子直径。这些粒子通常被稀释到该方法所需的浓度中，并根据国际标准化组织（ISO）的标准（ISO 19430:2024和ISO 22412:2025）对胶体分散体进行测量。这些测量使用了多种仪器：对于LNP1-LNP6，使用了VascoKIN DLS仪器（635纳米激光器，Cordouan Technologies）、Zetasizer Ultra仪器（633纳米激光器，Malvern Panalytical），该仪器以多角度检测模式运行：后向散射（空气中173°）、侧向散射（空气中90°）和前向散射（空气中13°），以及Zetasizer NanoZS（633纳米激光器，Malvern Panalytical），后者还用于测量粒子的Z电位。对于DLS，使用累积分析来推导Z平均直径和多分散性指数（PDI）。或者，使用非负最小二乘分析来推导多模态群体中的平均峰值直径。结果以重复测量的平均值和标准差表示。

PTA测量使用配备488纳米激光器的NanoSight Pro仪器（Malvern Panalytical，英国）在流动条件下进行。LNP1和LNP4样品在10 mM Tris–HCl缓冲液中稀释10,000倍，以达到仪器动态范围内的最佳粒子浓度。重复测量的数据被平均以获得粒子样品的基于数量的大小分布和平均模态粒子直径。有关这些方法的更多信息，请参见补充信息（SI）的第S3节。

2.4. 多检测器流场流式分级（MD-FFF）是一种根据流体动力学直径分离样品组分的技术（Parot等人，2020年；Roda等人，2009年；国际标准化组织，ISO 21362:2026；ASTM International 2024年）。分离过程发生在通道中，其中层流输送样品。一个垂直于洗脱流的流体动力学场强度根据样品的流体动力学直径将不同组分分布在通道高度上。由于层流剖面，样品组分由于位置不同而以不同的速度洗脱，从而导致不同的洗脱时间。如补充信息（SI）的第S3节所述，在多个系统上进行了多检测器FFF（MD-FFF）测量。与FFF分级系统耦合的检测器包括紫外-可见光（UV-Vis）吸收、DLS、多角度光散射（MALS）和折射率检测器。

2.5. 小角X射线散射（SAXS）SAXS是一种用于纳米粒子分散体的集合方法。SAXS使用低发散度的强单色X射线。样品通过例如玻璃毛细管或流动池与实验真空环境隔开，并暴露于X射线束下。散射辐射由放置在样品后面的二维检测器记录。样品与检测器的距离通常为几米，直接光束被光束阻挡器阻挡。得到的散射图案通常由对应于不同动量传递值的同心环组成。通过将检测器图像进行方位积分，可以获得动量传递q的散射强度（参见补充信息（SI）的第S4节）。可以通过使用适当的形状因子模型拟合散射曲线来确定粒子大小分布（Walenta，1985年；国际标准化组织，ISO 17867:2020）。

SAXS测量使用了三种不同的设置：一种实验室设置使用X射线管；一种在偶极源处的同步辐射光束线（Wernecke等人，2014年）；以及一种与AF4分级装置的排气口耦合的同步辐射光束线。这些设置的详细信息在补充信息（SI）中提供。平均直径和双层厚度的不确定性是通过χ2方法确定的（Hughes和Hase，2010年）。

2.6. RNA测量：毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光（CGE-LIF）和RiboGreen测定法LNP制剂中的RNA定量使用毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光（CGE-LIF）和RiboGreen荧光测定法进行。CGE-LIF测量使用BioPhase 8800仪器（SCIEX）和Andrew+移液机器人（Waters）进行自动样品制备。在光保护条件下制备了含有SYBR? Green的核酸扩展范围凝胶。单链RNA梯度溶液在加载前被变性、冷却、稀释并保持在冰上。从100 μg/mL的RNA储备液中制备了两个校准曲线（0.45–13.5 μg/ml RNA），平行组分别用3% Triton X-100处理总RNA或用UltraPure? DNase/RNase-Free Distilled Water处理游离RNA。根据目标分析物对LNP样品进行处理：对于总RNA（[RNA]total），样品预先稀释，用Triton X-100裂解，孵育并与甲酰胺混合；对于游离RNA（[RNA]free），样品直接在甲酰胺中稀释。使用BioPhase Software v.1.4.458（AB SCIEX）记录和分析荧光信号。通过绘制峰面积与RNA浓度的关系来构建校准曲线，并应用线性回归来确定RNA浓度。封装效率（EE%）使用公式（1）计算：(1) EE% = ([RNAtotal ? RNAfree] / [RNAtotal]) × 100

LNP制剂中的RNA浓度还使用RiboGreen RNA测定法（Invitrogen）进行测量。LNP样品分别以稀释和未稀释的状态制备，以分别量化总RNA和游离RNA。校准曲线使用0–640 ng/ml的RNA浓度范围制备了三个重复样本，并用2% Triton X-100处理总RNA，不用Triton X-100处理游离RNA。通过测量荧光来评估RiboGreen染料与LNP样品中RNA的结合。样品在（500 ± 10）nm处激发，发射在（525 ± 10）nm处使用Tecan SPARK微孔板读取器记录。通过将荧光强度与相应的校准曲线进行比较来确定样品中的RNA浓度，并根据公式（1）计算封装效率。

2.7. X射线光电子能谱（XPS）对LNP5和LNP6进行了XPS分析，以了解LNP表面的化学组成并确认表面存在PEG。测量在真空和低温模式下进行。这些测量后，样品在仪器内原位干燥，并重复测量。实验分析使用Kratos AXIS Supra+光谱仪进行，仪器描述见补充信息（SI）的第S5节。由于XPS的化学敏感性，在测量前通过更换缓冲液去除溶液中的缓冲分子。这是使用Amicon再生纤维素膜离心过滤器完成的：将样品悬浮液放入过滤器中，以14,000 rcf离心10分钟，直到溶液体积减少10倍。这个过程重复3次，每次循环之间以及完成后用超纯水（18.3 MΩ cm）重新配制样品。

2.8. 冷冻飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）ToF-SIMS是一种能够以0.1-1 μm的空间分辨率对固体表面进行质谱成像的表面分析方法（Massonnet和Heeren，2019年）。通过将高能离子的聚焦束扫描选定的分析区域上的每个像素，并在飞行时间质谱仪中检测发射的（二次）离子，从而获得每个像素的单独质谱。然后使用获得的数据来获得显示样品表面上特定离子（代表特定分子种类）的横向分布的离子图像，或从感兴趣区域（ROIs）获得质谱。对于当前的测量，方法是生成分布在冷冻悬浮液表面的单个脂质体的离子图像，并从单个脂质体中提取质谱以进行成分分析。含有脂质体的悬浮液样品通过将悬浮液的薄层浸入液氮中进行 plunge freezing，然后将上层云母片移除来进行制备。在ToF-SIMS仪器内，使用气体簇离子束（GCIB）通过溅射侵蚀去除冷冻悬浮液的上层区域（约4 μm），以获得代表整个悬浮液的表面。在整个制备和转移过程中，样品温度保持在-100°C以下，测量期间大约保持在-160°C。

ToF-SIMS测量在M6 ToF-SIMS仪器（IONTOF GmbH，德国明斯特）中进行，使用30 kV Bi3+初级离子进行分析，使用10 kV Ar2000+离子进行溅射。补充信息（SI）的第6节提供了关于样品制备和测量程序的更多细节。

3. 结果

3.1. 冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）样品的代表性cryo-TEM显微照片显示在图1 A-F中。通过cryo-TEM成像可视化了脂质体制剂的独特结构（图1 A-C）。LIP1的代表性图像显示在图1 A中。这种制剂主要由单层囊泡组成，平均直径约为100 nm（表2），尺寸分布较窄。囊泡呈现近似球形形态（平均圆度高于0.9）。在更高放大倍数下（图1 B），双层厚度可以测量到约5 nm。LIP2（图1 C）由较大的囊泡组成，尺寸分布较宽，其中包含占囊泡群体的45%的多层亚群（图S2a）。LIP2的更多图像显示在图S2b中。所有亚群的圆度值始终很高（总群体的0.880 ± 0.005，单个脂质体的0.890 ± 0.005，多层囊泡的0.880 ± 0.009），表明主要是球形形态。

表2. 按批次分组的脂质体样品的尺寸测量结果，包括DLS、AF4-DLS（功率衰减）、SAXS和cryo-TEM。结果以平均值和标准差值表示。

LNP1（图1 D）的粒子群体具有相对狭窄的尺寸分布和粒子形状的均匀性，主要是接近圆形的粒子。粒子是固态的，群体中几乎没有囊泡结构。尽管观察到一些层状-固态核心结构，这些结构在一侧有小的液体填充隔室。还观察到了多种内部结构，即无定形固态核心、颗粒状有序结构和多层核心（图S2c）。LNP2（图1 E）在粒子大小和结构上与LNP1相比变化更大。群体由固态粒子、囊泡和带有一个或多个附着囊泡隔室的固态粒子组成。一些囊泡和隔室在图像中具有颗粒状内部结构，这可能与内部存在mRNA有关（Brader等人，2021年）。LNP3（图1 F）的粒子结构与LNP2类似，包括固态粒子、囊泡和带囊泡隔室的固态粒子。不过，尺寸分布更窄，粒子平均更圆，且在囊泡隔室中观察不到内部结构，这很可能是因为这些粒子中没有mRNA。

表3. 按批次分组的LNP样品的尺寸测量结果，包括DLS和cryo-TEM。结果以平均值和标准差值表示。

LNP1（图1 D）的粒子群体具有相对狭窄的尺寸分布和粒子形状的均匀性，主要是接近圆形的粒子。粒子是固态的，群体中几乎没有囊泡结构。尽管观察到一些层状-固态核心结构，这些结构在一侧有小的液体填充隔室。还观察到了多种内部结构，即无定形固态核心、颗粒状有序结构和多层核心（图S2c）。LNP2（图1 E）在粒子大小和结构上与LNP1相比变化更大。群体由固态粒子、囊泡和带有一个或多个附着囊泡隔室的固态粒子组成。一些囊泡和隔室在图像中具有颗粒状内部结构，这可能与内部存在mRNA有关（Brader等人，2021年）。LNP3（图1 F）的粒子结构与LNP2类似，包括固态粒子、囊泡和带囊泡隔室的固态粒子。尺寸分布更窄，粒子平均更圆，且在囊泡隔室中观察不到内部结构，这很可能是因为这些粒子中没有mRNA。

表4. MD-AF4测量的结果总结，包括回转直径（Dg）、流体动力学直径（Dh）、数浓度[CN]和回收率。结果以平均值和标准差值表示。

3.2. 液体中的尺寸测量

3.2.1. DLS和PTA LNP和脂质体样品的DLS结果分别列在表2和表3中，代表性分布显示在图2 A-C（DLS和MADLS）和图S3a（PTA）中。样品LIP1通过这两种技术都显示出狭窄的分布。这与LIP3相对于LIP1测得的显著较低的PDI值一致（表2）。图2C显示了LIP1中的多个群体，这些群体在DLS中并未观察到，这可能是由于MADLS相对于传统DLS方法具有更好的分辨能力（Coones等人，2025年）。下载：下载高分辨率图像（510KB）下载：下载全尺寸图像

图2. 尺寸分布：使用各种技术在缓冲液中测量的基于脂质的颗粒的代表性尺寸分布。通过DLS的后向散射模式和MADLS（A、B和C）以及流动AF4-DLS/UV（D、E和F）测量的尺寸分布分别显示了样品（A、D）LNP1、（B、E）LIP1和（C、F）LIP2。在流动AF4-DLS尺寸分布中，红点代表全分数值，而蓝点表示相对于UV信号的全宽半高（FWHM）。

3.2.2. 分级方法
MD-AF4的结果在表2和表4中呈现。图2D-F显示了使用AF4-DLS/UV测量的基于脂质的颗粒的代表性尺寸分布。结果与DLS/MADLS测量结果一致，样品LIP1显示出非常狭窄的尺寸分布，而样品LIP2则不是这样。相应的方法和分馏图在补充信息（SI）的第S3节中报告。还使用了一种替代的分级系统来分析LNPs，该系统结合了UV、荧光、DLS和MALS检测器。该系统能够确定样品的回转直径（Dg）、流体动力学直径（Dh）、颗粒浓度和配方回收率（表4），结果显示在SI的图S3c中。

脂质体样品通过AF4-DLS/UV使用功率衰减法和恒定交叉流法进行测量（Doveri等人，2025年；Parot等人，2020年；Roda等人，2009年；国际标准化组织，ISO 21362:2026；ASTM International 2024年）。对于LIP1的两种测量方法的示例结果表明，这两种分级策略都适用于相对较小且均匀的脂质体群体（图S3d）。使用功率衰减分级方法（Doveri等人，2025年）测量的LIP2的分馏图示例显示，在这些条件下得到了稳定且分辨率良好的洗脱曲线（图S3d）。这些结果证实了功率衰减方法适用于分级和表征大型非PEG化脂质体系统，这些系统超出了标准恒定交叉流方法的最佳工作范围，在该范围内可能会出现过度保留和峰宽增加的问题。

3.2.3. SAXS
SAXS测量在三个实验室进行，使用了不同的实验配置，包括实验室X射线源和同步辐射光束线（见SI的第S4节）。其中一个同步辐射光束线的LIP1的一维散射曲线显示在图3A中，而图S4a和图S4b总结了所有设置下的SAXS结果。对于LIP1，散射曲线（图3A）使用单层囊泡的解析形式因子进行拟合，假设脂质双层电子密度由五个高斯壳层组成（Brzustowicz和Brunger，2005年）。该模型非常适合分析PEG化单层脂质体，得到的尺寸分布显示在图S3a（B面板）中。图3B展示了LIP1双层的示意图以及通过形式因子拟合得到的电子密度对比轮廓。脂质体的外径定义为电子密度外最大值之间的距离，结果总结在表2中。为了限制参数数量并更稳健地确定双层厚度，假设了一个对称的双层结构，即图3B中显示的电子密度轮廓中相邻最大值之间的距离，得出LIP1的双层厚度为（4.9 ± 0.3）纳米。

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图3. SAXS测量：LIP1的SAXS分析。（A）根据单层模型进行的代表性散射曲线及其拟合。（B）LIP1脂质双层的示意图，未显示PEG，以及根据假设由五个高斯壳层组成的对称双层模型得到的测量电子密度对比轮廓（实线黑色）。为了更好地显示双层，在此示意图中，电子密度的x轴被截断在|x| < ≈20 nm的范围，因为在该范围内电子密度差异近似为零。实际上，与示意图相比，双层的实际尺寸更小。

对于LIP2，Cryo-TEM图像（图1D和图S2）显示了单层和多层脂质体的混合物。因此，SAXS模型扩展以包括约10%的多层脂质体，以计算整个集合的平均电子密度。为了限制可调参数的数量，假设了双层数量的高斯分布（截止值低于0）。选择高斯分布作为经验模型，因为缺乏关于双层数量的可靠统计模型。由于这种配方未PEG化，因此只需描述双层的头基团-烃基团区域。LIP2的双层厚度确定为约4.4纳米，层状重复距离（双层厚度加上双层间的水层）约为8.6纳米。LIP2的典型散射曲线显示在图S4a（C面板）中。它们显示出比LIP1更不规则的形状，在q ≈ 0.74 nm-1和q ≈ 1.48 nm-1处有两个额外的峰，这些峰来源于层状堆叠。同一图表还比较了本研究中调查的三种SAXS设置的结果，显示出方法之间的一致性。

虽然在同步辐射设施进行的测量通常在噪声和q分辨率方面提供更高的数据质量，但实验室设置更容易获得，因此可用于稳定性监测（图S4a（C））和大多数具有良好散射对比度的样品的日常分析。

3.3. 化学测量
3.3.1. RNA定量
表5总结了使用CGE-LIF和Ribogreen测定法对LNP样品的总RNA和封装RNA以及封装效率（EE%）的测量结果。

表5. CGE-LIF和Ribogreen测定法测得的RNA封装效率结果（*）。结果以重复实验的平均值和标准差表示。

样品 加载 EE% (%) 封装RNA (μg/mL) 总RNA (μg/mL)
LNP1* F7 siRNA 97 ± 23 67 ± 9 80 ± 7
LNP2 mRNA 96 ± 29 4 ± 8 98 ± 8
LNP4 mRNA 98 ± 23 78 ± 10 386 ± 10
LNP5 mRNA 93 ± 10 547 ± 30 590 ± 30

3.3.2. ξ-电位
ξ-电位测量提供了有关颗粒表面电荷的信息，这与它们在溶液中的稳定性和化学性质有关。LIP1是一种PEG化脂质体，其ξ-电位值约为-25 mV，而不含PEG的LIP2的ξ-电位为（-88 ± 12）mV，通过静电相互作用实现稳定。

3.3.3. 真空和Cryo-XPSS
真空和Cryo-XPS的扫描谱揭示了LNP 5和LNP6的元素组成（图S5a），定量数据在表S5a中提供。XPS是一种表面敏感的技术，信号来自样品顶部约10纳米的区域，因此强烈偏向于材料的表面化学性质。对LNP样品的分析显示了碳、氧、氮和磷的明显信号。对于在水合状态下测量的样品（即通过Cryo-XPS），氧信号主要来自悬浮颗粒中的水，因此不能使用氧浓度来评估LNP的组成。然而，氮和磷的含量可以提供有关样品中特定成分的数量和位置的信息，并结合碳1s光谱的拟合，可以用来评估颗粒的结构。

碳是所有样品中的主要元素，这与颗粒的组成相符。对于LNP5，观察到的氮信号可能来自SM-102和DSPC，以及mRNA载荷。LNP5中的磷也可能来自DSPC或mRNA。在LNP6中，空颗粒的氮信号必须完全来自SM-102或DSPC。基于这一观察，可以对碳1s光谱进行峰值拟合（图4），以区分颗粒中不同成分的存在。特别是，虽然许多存在的分子含有C-O键（或在碳1s光谱中位置相似的C-N物种），但DMG-PEG是唯一不含氮原子的成分。这使我们能够确定来自含氮材料的碳1s光谱峰值的成分比例的上限，从而确定来自DMG-PEG的信号比例的下限。

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图4. XPS的碳光谱：（A和C）LNP5和（B和D）LNP6的碳1s峰拟合，分别通过真空（A和B）和Cryo（C和D）XPS测量。组分C1对应于烃类，C2对应于CO/CN物种，C3对应于COO物种，C3b对应于与COO物种相关的β位移烃类（C*COO）。

图4显示了真空和Cryo-XPS的碳1s光谱的峰值拟合。每个组分的比例和分配在表S5b中给出。在低温条件下进行的测量显示，与真空测量相比，与PEG相关的碳组分的峰值更强烈。通过拟合碳1s光谱，我们得到PEG来源的碳信号比例的下限分别为LNP5的>15.5%和LNP6的>57.9%。尽管原始配方中PEG的浓度仅为1.5摩尔%，但这些结果表明PEG在表面有显著的浓度。LNP5中观察到的表面氮表明，要么是加载颗粒表面残留的mRNA，要么是较大比例的加载颗粒在低温制备过程中失去了结构。

3.3.4. Cryo ToF-SIMS
对冷冻的含LIP2悬浮液进行的正ToF-SIMS离子图像显示了烃类碎片离子的明显斑点，这些离子随机分布在主要由水簇离子组成的均匀背景上，这与暴露在水悬浮液表面的单个脂质体或小脂质体聚集体一致（图5A和SI的图S6a）。由于没有观察到较大或更具体的分子离子的信号，因此用烃类碎片离子表示脂质体。此外，离子图像中烃类离子斑点的大小在<0.5-1 μm范围内，这与TOF-SIMS测量的横向分辨率相当，因此与单个脂质体或小聚集体一致。含有钠的水簇离子（代表NaCl缓冲液）显示出与脂质体颗粒类似的斑点外观，但空间分布明显不同，尽管一些重叠表明脂质体颗粒中的缓冲液含量不同。在离子图像中观察到孤立的脂质体颗粒，允许选择感兴趣区域（ROI）并从单个颗粒中提取质谱，用于单个颗粒的分子表征，如图5A中的30个颗粒所示。比例尺为10微米。(B) 通过ToF-SIMS强度分析，分别从小分子（C2至C4）和大分子（C5至C9）烃类碎片离子的相对组成（如(A)中标记所示），并分别归一化到所有烃类碎片离子（C2至C9）的总强度，这些数据来自单个粒子的质谱以及SPE16和胆固醇的参考谱。(C) 通过ToF-SIMS强度分析，分别代表HSPC、DSPE-PEG2000和胆固醇的离子的相对组成，并归一化到LIP1悬浮液中所有脂质的总强度，这些数据来自单个粒子的质谱。在没有更具体的脂质离子的情况下，尝试量化LIP2悬浮液中单个脂质体颗粒的SPE16/胆固醇组成是基于2-9个碳原子的烃类碎片离子（C2-C9）的信号强度分布与胆固醇的参考谱之间的差异，因为胆固醇的参考谱显示5-9个碳原子的离子（C5-C9）具有相对较高的信号强度，而SPE16的分布主要由2-4个碳原子的烃类离子（C2-C4）主导（见补充图S6b）。因此，图5B显示了C2-C4离子和C5-C9离子的相对信号强度，以表示每个颗粒中SPE16和胆固醇的相对丰度。图表显示个体颗粒之间的变化相对较小，此外，强度分布与纯胆固醇参考样本观察到的非常相似（图5B）。由于我们知道SPE16/胆固醇的组成大约为50/50摩尔比，这些结果表明烃类碎片分布并不能正确代表该悬浮液中脂质体颗粒的脂质组成，这可能是由于来自脂肪族结构的烃类碎片离子的产率受到抑制，导致碎片离子分布主要由胆固醇的更稳定的多环烃类结构产生的烃类离子所主导。使用相同的方法，确定了LIP1脂质体样本中单个颗粒/聚集体的脂质组成（图5C）。在这里，发现脂质成分在ToF-SIMS质谱中产生了更具体的离子，从而消除了依赖烃类碎片分布进行组成分析的需要。基于纯脂质的参考谱，使用了一组特征性的含氮离子来代表HSPC（Prinz等人，2007年）。SPE-PEG2000由PEG的特征性含氧碎片离子表示，而C5-C9烃类碎片离子用于表示胆固醇。然而，正如预期的那样，由于这些脂质体的较小尺寸和单层结构，LIP1悬浮液的离子图像显示的脂质成分的斑点较少且不那么明显（见补充图S6c），与LIP2悬浮液的离子图像相比，后者更可能代表单个脂质体。

4. 讨论
我们提出了一项研究，利用基于脂质的纳米颗粒配方来说明其结构和化学表征的分析工具框架。该框架包括既定的和新兴的分析方法，并讨论了它们的优势、局限性和协同作用。为本研究准备的样品具有不同的性质，可以利用这些分析工具进行探索。研究了两种类型的脂质体，它们具有不同的脂质组成并采用了不同的稳定策略。一种在外表面具有PEG（LIP1），而另一种（LIP2）则依赖于高表面负电荷产生的静电排斥。虽然LNP在大小和形状上相对均匀，但脂质体样品的大小和多分散性值却有很大差异。稳定性分析（见补充信息S1）为研究期间样品的完整性提供了信心。LNP1-4样品均表现出公认的Onpattro样脂质组成（Akinc等人，2019年），而LNP5-6具有Moderna COVID-19样的脂质组成（Zhang等人，2023年），但所有样品在RNA含量和缓冲液类型上都有所不同（表1）。使用了成熟的方法来评估它们的封装效率（Schultz等人，2024年），以及封装的RNA总量（表5）。

4.1 结构和尺寸表征
通过一系列技术提供了结构和尺寸表征。通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）研究了基于脂质的颗粒的形状和结构（图1）。优化的低温样品制备协议有助于保持颗粒的天然结构，并减少了这一阶段通常引入的典型伪影，例如由于冰层厚度导致的颗粒尺寸偏差，以及由于冰晶形成导致的颗粒损伤（Nangude等人，2026年）。冷冻透射电子显微镜可以直接观察颗粒的大小、形状和形态，在脂质体的情况下，它还允许可靠地评估其层状结构。高质量冷冻透射电子显微镜成像与半自动化图像分析的结合，使得定量结构描述符的提取更加稳健和可重复，从而增强了对配方依赖性颗粒结构差异的理解。尺寸通常以直径表示，是纳米药物的基本属性，显著影响其治疗效果和安全性（Clogston等人，2019年）。尽管冷冻透射电子显微镜提供了丰富的信息数据集，并可以直接观察颗粒形态，但分析的颗粒数量相对较少，这限制了该技术所能获得的统计结果。此外，其使用受到专门实验室的限制，以及其低通量和相关的运行成本，限制了将其作为常规研究方法的使用，例如在开发和放大过程中。因此，了解冷冻透射电子显微镜测量的尺寸与液体中的尺寸（如批量动态光散射DLS和SAXS）之间的关系非常重要。还有其他光学方法可以补充关于颗粒稳定性的信息，包括冷冻过程中的信息（Gunther等人，2021年）。

虽然DLS和PTA测量的是颗粒的流体动力学直径，但TEM和SAXS测量的是其电子密度直径。后者通常得到的值较小，因为它们没有包括靠近颗粒表面的液体层或吸附物，而这部分属于颗粒的流体动力学体积（Meli等人，2012年）。DLS和PTA还表示直径时考虑了具有相同扩散系数的固体球体，而SAXS则严重依赖于颗粒建模，包括其内部结构，来解决颗粒的尺寸特性。在这方面，TEM是这里唯一直接提供颗粒形状信息的方法。电子显微镜测量的颗粒尺寸通常表示为等效圆直径，即与颗粒2D投影面积相同的圆的直径，或者作为最小和最大Feret直径的平均值（国际标准化组织ISO 21363:2020）。

冷冻透射电子显微镜（图1）显示空心的Doxil样脂质体（LIP1）是一个均匀的、主要为单层的群体，具有狭窄的尺寸分布。相反，未PEG化的脂质体LIP2显示出更宽的尺寸分布和更高比例的多层囊泡，表明结构异质性增加。对总尺寸分布和亚群体尺寸分布直方图的分析对于准确描述囊泡群体和揭示批量技术无法访问的结构特征至关重要。这些详细的结构信息对于指导SAXS等方法所需的有效颗粒模型的开发至关重要。表2中的数据显示，所有技术都报告LIP2的直径大于LIP1。然而，SAXS和冷冻透射电子显微镜报告的等效圆直径比DLS或AF4-DLS测量的LIP1的直径小。对于LIP2，冷冻透射电子显微镜再次报告了一个较小的直径。但是，由于在低q值时散射曲线无特征且缺乏Guinier平台，无法用SAXS确定LIP2的直径。

对于像LIP1这样的单分散球形颗粒系统，我们观察到冷冻透射电子显微镜和DLS测量的平均直径之间存在约18纳米的差异（Z-平均值）。这与其他研究结果一致，例如Nordstr?m等人的研究（Nordstr?m等人，2021年）。需要注意的是，纳米颗粒表面的PEG分子层对冷冻透射电子显微镜是不可见的。这意味着PEG层的总厚度以及颗粒流体动力学体积内的所谓“滑移面”预计约为9纳米。这与PEG-2000层的预期厚度在3.5纳米到10纳米之间一致（见补充信息S7）（Li等人，2021年），此外滑移面的典型厚度约为4纳米（Minelli和Shard，2016年）。

SAXS测量能够提供脂质体样品的进一步结构细节，如双层厚度和多层间距，以及它们的尺寸和多分散性。由于测量是在液体条件下进行的，这种集合技术提供了相对于冷冻透射电子显微镜等方法的更大颗粒群体的平均结果，并且样品不太容易受到样品制备引入的潜在伪影的影响。然而，散射曲线的拟合（图S4a）严重依赖于建模，随着颗粒复杂性的增加，这变得更加具有挑战性。SAXS测量的LIP1的双层间距约为4.9纳米，与其他Doxil样脂质体的SAXS测量结果非常吻合（Nordstr?m等人，2021年）。这也与冷冻透射电子显微镜的测量结果一致，后者估计的双层间距约为5纳米。尺寸分布的宽度是由颗粒尺寸的分散性和方法分辨率共同决定的。后者取决于基本仪器原理和用于分析数据的分析算法。集合技术如DLS和SAXS相对于逐颗粒方法如PTA或冷冻透射电子显微镜通常具有较低的分辨率，除非它们与分离方法如AF4结合使用。表2中的数据显示，所有技术都认为LIP1比LIP2具有更高的单分散性，尽管它们得出的尺寸分布宽度不同。测量尺寸分布的权重也可能导致偏差，对于多分散样品来说这种偏差更为显著。例如，SAXS和冷冻透射电子显微镜通常产生基于数量的分布，而DLS提供的是基于强度的分布。由于较大颗粒的散射光强度较高，DLS测量的颗粒直径可能会偏向于较大的尺寸。这可能解释了DLS测量的LIP2直径（约275纳米）与冷冻透射电子显微镜测量的直径（约200纳米）之间的较大差异。MADLS似乎在LIP2样本中识别出多个尺寸群体，分别为约240纳米和约420纳米。然而，其他方法并未观察到这一点，而是报告了一个宽的尺寸分布。冷冻透射电子显微镜分析显示存在大量较大直径的多层脂质体（约230纳米，而单层脂质体的直径约为160纳米，见图S2a）。尽管这两类脂质体的散射特性预计会有所不同，但没有足够的证据将这些差异与MADLS所建议的结果相关联。相反，MADLS旨在通过从三个不同角度测量散射信号来提供更准确的尺寸分布，包括一个对较大颗粒更敏感的前向角度。它还通常使用“多窄模式”（MNM）分析算法，这导致与“通用”（GP）算法相比，尺寸分布更为狭窄。这可能导致相关函数的过拟合，从而在得到的尺寸分布中产生伪影（Coones等人，2025年）。

使用FFF分离方法是提高测量尺寸分布分辨率的有效策略。FFF方法是基于脂质的纳米颗粒的首选分离方法，因为它们对脆弱的基于脂质的纳米颗粒作用温和（Caputo等人，2021年）。将分离方法与多个探测器结合使用，使得FFF系统成为极其多功能的平台，能够处理异质样品并产生信息丰富的数据集。分馏步骤减少了较大或散射较强的颗粒群体主导批量测量并产生测量结果偏差的风险。这在表3和表4的数据中清晰可见，其中FFF测量的流体动力学直径系统地小于DLS测量的直径。因此，MD-FFF倾向于与逐颗粒技术如PTA有更好的一致性，后者较少受到DLS固有的强度加权效应的影响。对于脂质纳米颗粒来说，冷冻透射电子显微镜的结果展示了典型的结构变异性。例如，在类似Ompattro的LNP样本中，LNP1表现出相对较窄的粒径分布，但观察到了多种不同的内部结构，主要为固体颗粒。而LNP2和LNP3的粒径变化较大，颗粒形状也更为多样，其中含有相当比例的囊泡结构。与LNP3不同，LNP2装载了RNA，其平均粒径更大，粒径分布也更宽。与批量DLS相比，MD-FFF在检测前先进行了一步分离（例如通过MALS或DLS）。例如，批量DLS测得的LNP1和LNP4的直径均大于100纳米，而PTA和MD-FFF测得的直径则在约70纳米到约80纳米之间。这些发现突显了MD-FFF在解析多分散样品方面的优势，同时提供了更能代表颗粒群体的尺寸测量结果。PTA和FFF等技术还能够估算样品中的颗粒数浓度。表4展示了其中一个FFF系统的结果。将SAXS与FFF结合使用（图S4b）可以通过SAXS分析低多分散性的组分，尽管由于稀释作用信号强度会有所降低。对于脂质体，我们的结果强调了根据颗粒大小和组成选择合适的交叉流剖面的重要性，并证实了FFF-DLS能够提供关于分离效率和粒径分布的可靠且互补的信息（图S3d）。

4.2 化学表征
RNA定量是RNA-LNP药物产品的主要关键质量属性之一，因为剂量准确性、疗效和安全性直接依赖于RNA载量的多少及其完整性（Parot等人，2024年）。封装效率的确定尤为重要，因为它反映了制剂的性能以及生物可利用RNA的比例，因此是工艺优化和批次间一致性的关键参数。可以使用不同的互补方法来评估RNA的浓度、完整性和纯度，从而更全面地了解制剂情况。基于荧光的测定方法（如RiboGreen）可以快速定量总RNA和封装RNA的量，而CGE-LIF等技术则通过分离全长转录本和降解产物来提供关于RNA完整性的额外信息（Tran等人，2025年）。因此，这些方法的结合对于质量控制策略非常相关，并支持RNA-LNP治疗产品的监管提交所需的分析要求。新兴技术如cryo-ToF-SIMS和cryo-XPS能够对颗粒进行分子水平上的表征，提供关于脂质组成、PEG化以及可能的RNA分布的见解。尽管目前这些方法仅限于专业实验室使用，但它们可以验证传统测定方法，并生成高分辨率的数据集，有助于理解LNP在生理条件下的行为机制。药物递送系统表面的化学性质对其稳定性和靶向潜力至关重要。因此，开发能够研究这一性质的方法非常重要。对于依赖静电相互作用稳定性的递送系统（如LIP2），表面ξ电位很有用；而对于依赖PEG链压缩来维持稳定性的系统来说，这种方法的作用则较小。然而，目前能够识别和定量递送系统表面PEG的方法仍然有限（Li等人，2021年）。Cryogenic XPS已被用于多种纳米医学系统的研究（Cant等人，2023年）。XPS是一种表面敏感的技术，能够探测有机材料表面约10纳米以内的结构。然而，传统的XPS需要在超高真空条件下操作，而基于脂质的颗粒在这种条件下不稳定。在低温条件下，样品保持水合状态，类似于cryo-TEM技术。使用cryo-XPS，我们观察到的PEG信号比传统真空XPS测量结果更为显著（图4），这提供了颗粒表面的结构信息。

基于脂质的纳米颗粒在单个或亚群体水平上的化学和结构特性会影响其临床性能，因此能够在单颗粒水平上对这些材料进行表征的方法非常受欢迎。虽然TEM用于结构表征，各种光学成像技术也被开发用于光谱表征（Boateng等人，2025年），但目前仍缺乏针对单个基于脂质的纳米颗粒的分子表征方法。因此，所描述的ToF-SIMS方法为此目标提供了一个有前景的途径。这项工作展示了该技术量化单个基于脂质的纳米颗粒分子组成的能力。然而，分析依赖于能够独立检测不同分子组分特征离子的可能性，并且需要足够的产率。例如，我们的结果（图5）表明，由于胆固醇的存在和/或与周围冰基质的相互作用，LIP2脂质体中SPE16脂质片段的产率显著降低。相比之下，LIP1脂质体的所有脂质组分（即HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000）都可以被独立定量。

尽管本文描述了诸多进展，但在将颗粒分辨的结构和化学测量转化为标准化质量指标方面仍存在挑战。实验室间的重复性研究、分离和成像协议的标准化以及颗粒性质与生物活性的关联是下一步需要解决的关键问题。我们的发现表明，单个颗粒水平上的脂质组成差异可能超过样品间的名义差异，这强调了颗粒分辨表征对于稳健质量控制的重要性。

5. 结论
本研究展示了协调的多模态分析方法在基于脂质的纳米颗粒（即LNP和脂质体）的尺寸、结构和化学表征方面的价值。Cryo-TEM提供了对颗粒形态和层状结构的直接洞察，清晰地区分了均匀和更异质的制剂，同时确认了脂质体和LNP的结构一致性。流体动力学技术（DLS、MADLS）在不同制剂中产生了稳定的尺寸测量趋势，尽管分辨率和抗干扰能力随样品复杂性的增加而变化。AF4耦合检测提高了尺寸分辨率，并实现了基于分离的表征，这凸显了其在处理多分散系统时的优势。SAXS提供了可靠的基于集合体的结构参数，包括双层厚度，并通过特征性布拉格峰识别了多层结构，尽管对于复杂样品需要进一步建模以进行详细的结构解释。化学分析（CGE-LIF、RiboGreen）提供了可靠的封装效率和RNA定量结果，而Cryo-XPS在研究表面和分子组成方面显示出潜力。Cryo-ToF-SIMS能够对单个颗粒的脂质含量进行评估，揭示了颗粒间的显著差异，强调了能够超越集合平均值的分析方法的重要性。总体而言，这些发现证实没有单一方法能够完全描述基于脂质的纳米颗粒的复杂性。相反，结合成像、散射、流体动力学、分离和化学技术的综合方法是很有用的。这里生成的比较数据集支持了朝着统一分析标准和提高这些日益重要的药物递送系统测量重复性方向的努力。

CRediT作者贡献声明
Caterina Minelli：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、概念化。
Jeremie Parot：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Enrica Alasonati：撰写 – 审稿与编辑、研究。
Annika Altsk?r：研究。
David J.H. Cant：撰写 – 原稿、监督、资金获取、正式分析。
Jonathan D.P. Counsell：研究。
Giorgia Dal Pan：研究。
Valentin de Carsalade du pont：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、研究、正式分析、数据管理。
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Lavinia Rita Doveri：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、研究、正式分析。
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Peter Sj?vall：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。