《International Immunopharmacology》：Exploring the mechanism of ropivacaine in alleviating neuropathic pain via the mTOR-PKM2/STAT3-H4K12 lactylation axis
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神经病理性疼痛（Neuropathic pain, NP）是最具挑战性的病理状况之一，治疗方案有限，患者的生活质量受到严重影响。然而，现有临床治疗的成功率并不令人满意，探索新的干预策略是最紧迫的问题。过去几年，人们逐渐认识到小胶质细胞代谢重编程和表观遗传控制在
神经病理性疼痛（Neuropathic pain, NP）是最具挑战性的病理状况之一，治疗方案有限，患者的生活质量受到严重影响。然而，现有临床治疗的成功率并不令人满意，探索新的干预策略是最紧迫的问题。过去几年，人们逐渐认识到小胶质细胞代谢重编程和表观遗传控制在慢性神经炎症中的作用。本研究旨在探讨罗哌卡因通过调节mTOR（mammalian target of rapamycin）-PKM2（pyruvate kinase M2）/STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）-H4K12la（histone H4 lysine 12 lactylation）轴来缓解NP的假说。研究采用慢性坐骨神经压迫损伤（Chronic Constriction Injury, CCI）小鼠模型和BV-2小胶质细胞模型进行一系列实验。实验证据表明，在CCI模型中，疼痛行为学指标、代谢轴相关蛋白的表达及促炎细胞因子含量均显著增加，而罗哌卡因的干预能有效减轻CCI模型中的这些病理改变。同样，在机制层面，罗哌卡因能够调节mTOR-PKM2/STAT3信号通路的过度激活，减轻小胶质细胞的激活和氧化应激，并最终降低H4K12la水平。本研究阐明了罗哌卡因缓解NP效应的潜在机制：罗哌卡因通过抑制mTOR-PKM2/STAT3信号轴，并降低小胶质细胞中组蛋白H4K12乳酸化水平，从而减轻神经炎症和疼痛反应。该发现为扩展罗哌卡因在慢性疼痛管理中的临床应用提供了新的概念基础。
论文主体内容总结
1. 引言 (Introduction)
神经病理性疼痛（NP）是一种由躯体感觉神经系统损伤或疾病引起的慢性疼痛，其特征包括自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。其病因复杂，涉及外周和中枢敏化、神经炎症、离子通道失调与改变以及表观遗传修饰等多个过程。NP在全球范围内非常普遍，目前可用的首选治疗药物（如抗抑郁药、抗惊厥药和阿片类药物）疗效有限，且常伴有嗜睡、头晕和依赖性等严重副作用，导致许多患者缺乏有效的疼痛管理，生活质量严重下降。因此，全面阐释NP发生和进展的关键分子过程，并发现新的药理学枢纽，对于设计高效低毒的新型镇痛干预措施具有直接的临床重要性。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是调节细胞生长、代谢、自噬和蛋白质合成的核心通路，被发现是神经元可塑性和疼痛信号传递的核心。mTOR的异常激活可促进其下游效应分子如丙酮酸激酶M2（PKM2）的上调。细胞核内的PKM2可作为转录共激活因子和蛋白激酶，磷酸化信号转导和转录激活因子3（STAT3），从而调控一系列与痛觉过敏和神经炎症相关的基因表达。这种mTOR-PKM2/STAT3信号轴的级联激活被认为是神经元代谢重编程与慢性疼痛维持之间的关键转换环节。然而，该轴如何触发后续导致疼痛相关基因转录维持的表观遗传转换机制尚未完全阐明。组蛋白乳酸化，特别是组蛋白赖氨酸12乳酸化（H4K12la）作为一种新兴的表观遗传-代谢偶联调控方式，在基因转录调控中至关重要，且与神经功能障碍密切相关。研究表明，H4K12la在Aβ沉积周围的小胶质细胞中大量富集，并特异性分布于糖酵解过程两个重要调控基因PKM2和乳酸脱氢酶A（LDHA）的启动子区域。基于此机制，深入研究mTOR-PKM2/STAT3信号轴是否通过动态调控H4K12la驱动NP的发生和进展，已成为一个重要且有价值的研究方向。
罗哌卡因是一种长效酰胺类局部麻醉药，临床上广泛用于术后镇痛和区域神经阻滞。除了通过阻断电压门控钠通道短暂抑制神经传导外，越来越多的证据表明，罗哌卡因可能超越其局部麻醉作用，产生长期的调节效应，如抗炎特性和调节神经元可塑性。后续机制研究证实，罗哌卡因可诱导受损节段背根神经节内神经生长因子的表达，从而阻止小胶质细胞的激活。这些结果表明罗哌卡因对NP具有一定的保护和干预作用。由于其广泛的临床应用、深入研究的药代动力学参数和良好的安全性，罗哌卡因在慢性疼痛领域具有极佳的再利用潜力。
本研究旨在阐明罗哌卡因介导缓解NP的新机制，重点关注其对mTOR-PKM2/STAT3-H4K12la信号通路的调节作用。研究同时采用了体内坐骨神经CCI模型和体外BV-2小胶质细胞培养系统，系统评估了罗哌卡因的镇痛效果，并检测了其对通路关键分子活性及H4K12la水平的影响。
2. 材料与方法 (Materials and methods)
研究使用了6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，通过手术松散结扎右侧坐骨神经建立CCI模型。实验分为多个阶段和多个组别，包括假手术组、CCI模型组、CCI+罗哌卡因治疗组，以及后续为验证mTOR作用而增加的CCI+mTOR激动剂MHY1485组和CCI+MHY1485+罗哌卡因联合组。罗哌卡因皮下注射给药，持续28天。通过测量机械性缩足阈值和热刺激缩足潜伏期来评估疼痛行为。通过酶联免疫吸附测定检测血清或细胞培养上清中促炎细胞因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）的水平。体外实验使用BV-2小胶质细胞系，并用脂多糖诱导炎症损伤模型。细胞实验分组包括对照组、LPS刺激组、LPS+罗哌卡因预处理组、LPS+MHY1485组以及LPS+MHY1485+罗哌卡因组。通过CCK-8法检测细胞活力，通过DHE荧光探针检测活性氧水平。通过免疫荧光染色观察蛋白质的共定位和表达，通过蛋白质印迹法和实时定量逆转录聚合酶链式反应检测蛋白质和mRNA的表达水平。对组蛋白H4K12la的修饰水平也通过蛋白质印迹法进行了检测。所有数据均进行统计学分析。
3. 结果 (Results)
3.1. 罗哌卡因减轻CCI诱导的NP
行为学结果显示，与假手术组相比，CCI组小鼠的机械性缩足阈值和热刺激缩足潜伏期从术后第7天开始显著降低，并持续至术后第27天，表明模型成功诱导了稳定且持续的痛觉过敏。基于CCI模型给予罗哌卡因干预显著逆转了上述痛觉过敏行为，表明罗哌卡因能有效缓解CCI诱导的NP。
3.2. 罗哌卡因降低P-mTOR的表达
蛋白质印迹和qRT-PCR结果显示，CCI组小鼠脊髓组织中P-mTOR的蛋白和mRNA表达水平均显著升高。相比之下，罗哌卡因治疗组中P-mTOR的蛋白表达与CCI组相比被显著抑制，其mRNA水平的变化趋势与蛋白表达一致。这表明罗哌卡因能有效下调脊髓组织中P-mTOR的表达。
3.3. 罗哌卡因拮抗mTOR激活以缓解NP和炎症反应
为了验证mTOR在NP中的核心作用，研究在第一阶段实验基础上，增加了使用mTOR激动剂MHY1485的阳性验证组。与CCI组相比，CCI+MHY1485组的疼痛相关行为改变更为明显，表明神经损伤诱导的中枢敏化进一步加剧。蛋白质印迹结果显示，与假手术组相比，CCI组和CCI+MHY1485组中P-mTOR的蛋白表达均显著增加，但CCI+MHY1485组与CCI组之间的差异无统计学显著性。上述神经病理改变和疼痛敏化均可被罗哌卡因干预所缓解。酶联免疫吸附测定结果显示，与CCI组相比，CCI+MHY1485组中IL-1β和IL-6的表达水平显著增加，而TNF-α水平未见显著变化。这些结果表明MHY1485可进一步加剧CCI诱导的神经炎症。
3.4. 罗哌卡因对NP的改善作用与抑制PKM2和STAT3激活相关
蛋白质印迹分析显示，与假手术组相比，CCI组小鼠脊髓中PKM2和P-STAT3的蛋白表达水平显著升高。进一步用MHY1485干预后，P-STAT3的蛋白表达水平与CCI组相比有升高趋势，但未达到统计学显著性。相比之下，罗哌卡因处理显著抑制了CCI诱导的PKM2和P-STAT3蛋白表达升高。同时，qRT-PCR分析显示，CCI组中PKM2的mRNA转录水平也显著增加，其变化趋势与蛋白表达结果一致，表明PKM2在转录水平参与了这一病理过程。
3.5. P-mTOR在NP期间的脊髓小胶质细胞中高表达
免疫荧光染色检测P-mTOR在脊髓背角的细胞定位。结果显示，P-mTOR与离子钙接头蛋白分子1和小胶质细胞标记物Iba-1以及星形胶质细胞标记物GFAP在小鼠脊髓背角共定位。进一步的定量分析显示，P-mTOR与Iba-1的共定位显著高于与GFAP的共定位，表明在NP条件下，P-mTOR主要在小胶质细胞而非星形胶质细胞中被激活。
3.6. 罗哌卡因对NP的改善作用与其抑制P-mTOR表达相关
在小鼠BV-2小胶质细胞系中进行的类似分组实验显示，蛋白质印迹和qRT-PCR的结果与体内实验观察到的趋势一致。LPS刺激诱导了P-mTOR蛋白表达增加、PKM2表达上调和STAT3磷酸化激活。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，LPS组和MHY1485激动剂组的细胞活力均显著降低。相比之下，罗哌卡因预处理不同程度地减轻了LPS和LPS+MHY1485诱导的细胞活力下降，发挥了一定的保护作用。免疫荧光染色结果进一步证实，与对照组相比，LPS组和LPS+MHY1485组细胞中P-mTOR的荧光强度显著增强，这与蛋白质印迹结果一致，进一步支持了LPS对mTOR通路的激活作用。
3.7. 罗哌卡因抑制P-mTOR介导的小胶质细胞极化
为阐明罗哌卡因是否通过调节小胶质细胞极化发挥神经保护作用，研究检测了各组中小胶质细胞标记物Iba-1及其极化相关分子的表达变化。蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，LPS刺激显著上调了Iba-1的蛋白表达水平。在LPS+MHY1485基础上添加罗哌卡因后，Iba-1表达呈下降趋势，但与LPS+MHY1485组相比差异无统计学意义。通过qRT-PCR进一步检测M1/M2极化标记物的mRNA表达水平发现，与对照组相比，LPS组中M1标记物和Iba-1的表达显著升高，而M2标记物的表达显著降低。罗哌卡因干预后，CD86、iNOS和Iba-1的表达受到抑制，同时CD206和ARG-1的表达得到恢复和上调。这些结果表明，罗哌卡因可以抑制LPS诱导的小胶质细胞向M1表型极化，并促进其向M2表型转化。
3.8. 罗哌卡因通过减轻氧化应激和H4K12乳酸化抑制神经炎症
为验证罗哌卡因是否通过调节氧化应激和组蛋白乳酸化在细胞水平发挥抗神经炎症作用，在BV-2小胶质细胞中进行了相应实验。结果显示，LPS刺激以及LPS与mTOR激动剂MHY1485共同处理显著诱导了细胞内活性氧的产生，上调了H4K12la的水平，并同时促进了细胞上清中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。相比之下，罗哌卡因处理显著抑制了活性氧的产生，降低了H4K12la修饰水平，并显著减少了炎性细胞因子的分泌。这些发现表明，罗哌卡因可以通过减轻氧化应激和调节组蛋白乳酸化修饰来抑制小胶质细胞的炎症激活。
4. 讨论 (Discussion)
研究结果表明，罗哌卡因能有效缓解CCI诱导的NP行为，并下调脊髓中P-mTOR的表达。作为细胞能量感知和代谢调节的中枢枢纽，mTOR在小胶质细胞中的过度激活可通过上调葡萄糖转运蛋白1和己糖激酶2等糖酵解限速酶，促进葡萄糖摄取并增加有氧糖酵解通量。在这种代谢微环境下，PKM2进一步上调，从而维持小胶质细胞的糖酵解。此外，PKM2还可解离其功能性四聚体复合物形成二聚体，易位至细胞核，并与STAT3形成复合物。细胞核内的PKM2作为蛋白激酶直接磷酸化并激活STAT3，随后刺激促炎细胞因子基因的转录和释放。本研究结果与上述机制相符，发现mTOR可诱导PKM2表达和STAT3磷酸化，并随后导致CCI小鼠脊髓组织中炎性细胞因子水平升高。
研究使用MHY1485作为mTOR激动剂进行干预，实验证明该干预成功上调了小鼠脊髓背角P-mTOR蛋白的表达水平，并同时激活了其下游靶点PKM2和P-STAT3的活性。这种通路的持续激活与促炎细胞因子释放的显著增加相关。有趣的是，这些分子改变在局部麻醉药罗哌卡因干预后得到有效改善。
值得注意的是，尽管MHY1485作为mTOR激动剂在生理条件下可显著上调P-mTOR表达，但在本研究的CCI模型中，MHY1485干预组的蛋白表达水平并未超过仅CCI组。这一现象可能归因于CCI手术本身已诱导的脊髓mTOR通路激活达到了天花板效应。这一发现表明，在mTOR高度激活的病理背景下，简单地增强激动刺激可能不是有效的干预策略，反而支持了通过抑制mTOR通路来缓解神经病理性疼痛的治疗方法。
在NP的发生和进展过程中，脊髓水平的神经炎症反应以小胶质细胞和星形胶质细胞的序贯激活为特征。本研究的免疫荧光共定位分析显示，P-mTOR与Iba-1的共定位显著高于与GFAP的共定位。这种模式与其他研究报道不同，提示mTOR的细胞特异性激活可能具有模型依赖性和时间依赖性。这种差异可能源于损伤类型、物种差异以及观察时间窗等因素。为在体外进一步证实罗哌卡因的作用，使用了BV-2细胞模型。细胞分析结果表明，罗哌卡因诱导的代谢轴指标表达变化与体内实验结果相似。同时，本研究得出结论，LPS促进小胶质细胞向M1表型极化，并诱导广泛的氧化应激反应。
这种代谢转换使小胶质细胞能够快速生成三磷酸腺苷，同时伴随着大量乳酸等代谢副产物的积累。多余的乳酸通过单羧酸转运蛋白释放到细胞外空间，或回收到细胞核中，作为介导这些区域表观遗传变化的重要底物参与表观遗传调控。有证据表明，小胶质细胞中H4K12la的程度在各种中枢神经系统疾病中相当高，这表明乳酸代谢与神经炎症基因组调控之间存在稳定的相关性。本研究中观察到的乳酸积累与上述经典病理特征一致。据此，研究人员提出，代谢转换驱动的能量供应和乳酸积累可能与其介导的表观遗传重编程协同作用，共同形成促炎信号放大的正反馈回路，从而有力地驱动白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等关键促炎因子的转录激活和大量释放。但需要指出，这一假说仍需在后续实验中进行直接验证。
本研究存在一些局限性。首先，研究主要聚焦于脊髓水平小胶质细胞的机制，尚未验证该信号轴在外周神经损伤局部或更高中枢神经系统区域的功能。其次，存在时间动态分析的局限性，目前仅提供了单一时间点的初步定位证据，未能系统描述其动态表达谱。第三，体外模型存在局限性，主要使用了BV-2永生化小胶质细胞系，其存在固有的高基础激活状态和对LPS反应性降低等限制。第四，药理学干预存在局限性，采用了同时给药方案验证MHY1485对罗哌卡因作用的拮抗，但无法完全排除药物间潜在的非特异性相互作用。第五，本研究发现了罗哌卡因可抑制脊髓mTOR-PKM2/STAT3通路的激活，但尚不清楚其是直接靶向mTOR蛋白还是作用于上游信号分子。研究人员通过文献分析提出了几种潜在的作用机制。最后，罗哌卡因的临床转化潜力仍需系统评估。
总而言之，本研究揭示了罗哌卡因通过调节mTOR-PKM2/STAT3信号通路并降低H4K12la修饰水平，从而抑制小胶质细胞的代谢激活和神经炎症反应，最终缓解NP。该研究加深了对局部麻醉药镇痛作用的表观遗传-免疫代谢机制的理解，并为开发针对代谢-表观遗传串扰的新型疼痛治疗策略提供了实验证据。
