活菌及巴氏杀菌后的Faecalibacterium prausnitzii及其无细胞上清液对小鼠单核细胞增生李斯特菌感染的改善作用，以及这种作用与肠道屏障增强和TLR4/NF-κB通路下调之间的关联

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Amelioration of Listeria monocytogenes infection in mice by live and pasteurized Faecalibacterium prausnitzii and its cell-free supernatant and its association with strengthened gut barrier and downregulated TLR4/NF-κB pathway

　　单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性病原体，对健康构成严重威胁。Faecalibacterium prausnitzii 是肠道微生物群的主要成员之一，被认为对维持肠道健康至关重要。本研究的目的是探讨活的 Faecalibacterium prausnitzii（FP）、巴氏杀菌的 Faecalibacterium prausnitzii（pFP）及其无细胞上清液（CFS）对小鼠感染单核细胞增生李斯特菌的易感性的影响，并探索其潜在机制。安全性评估结果表明，FP、pFP 和 CFS 在健康小鼠体内没有毒性作用。在感染单核细胞增生李斯特菌的小鼠中，这些处理显著降低了各种器官和粪便中的细菌数量，并减轻了炎症。此外，这些干预措施显著提高了短链脂肪酸（SCFA）的水平，尤其是乙酸和丙酸，并在感染后调节了肠道微生物群的组成。RT-qPCR 和 Western blot 结果显示，它们减少了炎症因子和肠道损伤，这与 TLR4/NF-κB 通路的下调有关。综合这些结果表明，FP、pFP 和 CFS 可以减轻小鼠中的单核细胞增生李斯特菌感染，并可能被开发为预防或减轻单核细胞增生李斯特菌感染的替代策略。

单核细胞增生李斯特菌是一种常见的食源性病原体，对健康构成严重威胁。Faecalibacterium prausnitzii 是肠道微生物群的主要成员之一，被认为对维持肠道健康至关重要。本研究的目的是探讨活的 Faecalibacterium prausnitzii（FP）、巴氏杀菌的 Faecalibacterium prausnitzii（pFP）及其无细胞上清液（CFS）对小鼠感染单核细胞增生李斯特菌的易感性的影响，并探索其潜在机制。安全性评估结果表明，FP、pFP 和 CFS 在健康小鼠体内没有毒性作用。在感染单核细胞增生李斯特菌的小鼠中，这些处理显著降低了各种器官和粪便中的细菌数量，并减轻了炎症。此外，这些干预措施显著提高了短链脂肪酸（SCFA）的水平，尤其是乙酸和丙酸，并在感染后调节了肠道微生物群的组成。RT-qPCR 和 Western blot 结果显示，它们减少了炎症因子和肠道损伤，这与 TLR4/NF-κB 通路的下调有关。综合这些结果表明，FP、pFP 和 CFS 可以减轻小鼠中的单核细胞增生李斯特菌感染，并可能被开发为预防或减轻单核细胞增生李斯特菌感染的替代策略。

引言
单核细胞增生李斯特菌是一种食源性病原体，对公共卫生构成重大威胁[17]。这种细菌可以通过食用受污染的食物进入人体，对孕妇、新生儿、老年人和免疫系统受损者等脆弱人群尤其有害。感染后，单核细胞增生李斯特菌可引起发热、肌肉疼痛、头痛、恶心、呕吐和腹泻[32]。李斯特菌病是由单核细胞增生李斯特菌引起的一种严重疾病，全球死亡率为20-30%。最近的研究表明，尽管过去10年中单核细胞增生李斯特菌感染的发病率总体稳定，但这种更严重且更具侵袭性的疾病的小规模爆发比以前认为的更为频繁[41]。在严重的情况下，该细菌可以侵入中枢神经系统，导致脑膜炎、脑炎、败血症甚至死亡。单核细胞增生李斯特菌感染与肠道屏障之间的关系复杂，细菌利用多种机制穿透和破坏肠道屏障，从而促进感染[8]。此外，该细菌分泌如李斯特菌粘附蛋白（LAP）等蛋白质，破坏肠道上皮细胞之间的紧密连接，从而损害肠道屏障的完整性[8]。单核细胞增生李斯特菌的侵入和增殖会引发肠道炎症反应，进一步加剧肠道屏障的损伤，从而促进细菌的进一步侵入和扩散[25]。单核细胞增生李斯特菌感染对肠道和整体人类健康构成重大威胁。目前尚缺乏有效的单核细胞增生李斯特菌疫苗，患有严重李斯特菌病的患者通常使用β-内酰胺类抗生素和庆大霉素进行治疗，但最终依赖免疫系统清除细菌。免疫系统受损者发生严重甚至致命感染的风险更高[40]。鉴于系统性单核细胞增生李斯特菌感染的高死亡率以及耐药菌株的持续出现，探索新的安全有效策略来预防李斯特菌病至关重要。

肠道微生物群由居住在人体肠道中的多种微生物组成，在维持肠道健康方面发挥着多方面的作用。肠道微生物群参与食物消化和营养代谢，帮助身体吸收不可消化的植物纤维并合成某些维生素[2]。最近采用整合多组学方法的研究提供了对这些相互作用的更深入见解。例如，一项利用微生物组、转录组和代谢组分析的研究表明，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）可以在沙门氏菌感染期间调节肠道微生物群的组成、宿主免疫反应和代谢途径[18, 39]。这些发现强调了益生菌的保护机制通常涉及宿主-微生物生态系统的复杂多层次调节，而不仅仅是单一的作用方式[18, 39]。此外，肠道微生物群调节肠道免疫系统的平衡，影响免疫细胞的发育和功能，减少过敏和炎症性疾病的发生[30]。同时，肠道微生物群与宿主的代谢和心血管健康密切相关，通过调节能量平衡和脂质代谢影响体重和胆固醇水平[54]。最重要的是，肠道微生物通过竞争排斥和产生抗菌物质来抵御病原体的侵入，从而维持肠道屏障的完整性[59]。Yan等人证实，经过黄连素处理的肠道微生物群足以减轻小鼠结肠炎相关的结肠肿瘤的发生[53]。还有研究表明，槲皮素通过调节肠道微生物群增加SCFA水平并降低促炎细胞因子的水平[10]。因此，肠道微生物在维持肠道健康和整体生理功能中起着关键作用。

Faecalibacterium prausnitzii 是一种革兰氏阳性、厌氧的肠道细菌，属于厚壁菌门（Firmicutes）中的梭菌类（Clostridia），被认为是维持肠道健康的关键因素[21]。它还具有抗炎特性，可以调节宿主的免疫反应，从而减少肠道炎症[24]。Gao等人表明，Faecalibacterium prausnitzii 可以改善由ICI引起的结肠炎，重塑肠道微生物群组成，并增强免疫治疗的抗肿瘤活性[12]。研究表明，Faecalibacterium prausnitzii 有助于维持肠道屏障的完整性，防止病原体和有害物质通过胃肠道进入体内[56]。更重要的是，Faecalibacterium prausnitzii 调节免疫系统的平衡，减少炎症反应，从而调节肠道微生物群的平衡，实现维持稳定健康肠道环境的作用。尽管 Faecalibacterium prausnitzii 在肥胖、糖尿病和癌症等慢性疾病中的作用已被广泛研究，但其（特别是巴氏杀菌的 Faecalibacterium prausnitzii 及其无细胞上清液）对食源性病原体感染的影响却很少被探索。因此，在本研究中，对活的 Faecalibacterium prausnitzii（FP）、巴氏杀菌的 Faecalibacterium prausnitzii（pFP）及其无细胞上清液（CFS）进行了详细研究，以探讨它们是否可以减少肠道上皮损伤、保护肠道免受感染及其机制。

材料与方法
单核细胞增生李斯特菌和 Faecalibacterium prausnitzii
单核细胞增生李斯特菌 10403s 从 Eastmo Biotech Co., Ltd.（北京，中国）购买。该菌株在使用前在 Brain-Heart Infusion Broth 中培养过夜。Faecalibacterium prausnitzii（DSM 17677）在改良的强化梭菌培养基（MRC broth）中于37°C厌氧培养24小时。pFP 和 CFS 的制备方法如前所述（J. Liu, [28]）。培养后的 Faecalibacterium prausnitzii 在12,000 g下离心10分钟以去除培养基，冲洗两次后悬浮在0.01 M PBS中，并在70°C下巴氏杀菌30分钟以获得pFP。离心后，取上层液体并通过0.22 μm过滤器（Millipore过滤器，美国）过滤以获得 Faecalibacterium prausnitzii 的 CFS。

动物处理和研究设计
所有实验程序均按照美国国立卫生研究院的《实验动物指南》进行。该研究获得了大连理工大学动物伦理委员会的批准（DLPU2024035）。从辽宁长盛生物技术有限公司（长春，中国）购买了五周大的C57BL/6J雄性小鼠，这些小鼠为特定无病原体（SPF）状态。小鼠被饲养在受控的SPF环境中（12小时光照/黑暗周期，24 ± 1°C）。小鼠被分为五组（n = 10）：对照组（磷酸盐缓冲盐水）、Mod组（磷酸盐缓冲盐水，第21天添加单核细胞增生李斯特菌）、FP组（1 × 10? CFU/mL）、pFP组（1 × 10? CFU/mL）和CFS组（1 × 10? CFU/mL）[3, 11, 45]。在FP、pFP和CFS处理21天后，小鼠在最初24小时内通过胃管给予100 μL CaCO3（悬浮在0.5% CMC-Na中）以中和胃酸，从而帮助单核细胞增生李斯特菌在感染期间的存活。随后，小鼠被感染5 × 10? CFU/mL的单核细胞增生李斯特菌。在24天内每天记录体重。第25天，在测量体重后对动物实施安乐死。血液通过4°C下1,000 × g离心10分钟收集。血清分离后储存在-80°C以备后续分析。结肠样本收集后储存在-80°C。结肠样本在4%甲醛中固定24小时。根据体重将动物随机分配到实验组。由于干预措施的特性，样本收集是盲法进行的，而关键结果评估（如细菌计数和组织病理学评分）由不了解组别分配的人员进行。

HE染色
结肠组织在4%甲醛中固定，然后进行纵向切片，每组三个样本[46]。样本随后嵌入石蜡块中。使用切片机将组织切成3-5 μm厚度，然后用苏木精和伊红（HE）染色。在显微镜下评估每个组织切片中的黏膜下水肿程度、上皮完整性、杯状细胞保留情况以及固有层的细胞浸润情况，每个标准的评分范围为0到4分。病理评分是这四个标准评分的总和。炎症分为四类：重度炎症（评分≥12）、中度炎症（评分8-12）、轻度炎症（评分4-8）和无炎症（评分≤4）[28]。

AB-PAS染色
AB-PAS染色按照制造商的说明进行。安乐死小鼠后收集结肠组织并制备石蜡切片[44]。切片脱水后，用Alisin Blue（AB）染色15分钟，用去离子水冲洗，然后用过氧化氢氧化5分钟，再用Schiff试剂处理5分钟，随后用酸分化溶液分化5秒。用去离子水冲洗和干燥后，用Scott Blue溶液分化5分钟。再次用去离子水冲洗和干燥后，用Scott’s blueing溶液复蓝5分钟，最后密封切片。使用尼康Eclipse Ti-S显微镜（东京，日本）观察切片。

粪便和器官中单核细胞增生李斯特菌的计数
小鼠组织（回肠、结肠、肠淋巴结、肝脏和脾脏）和粪便在含有1% Triton X-100（1:10, w/v）的冷PBS中无菌收集并匀浆。制备系列稀释液并在37°C下孵育24小时，然后接种到 Listeria Chromogenic Medium 平板（HB7008，Hopebio，青岛，中国）上以确定总菌落计数[45]。

ELISA分析
根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒测量细胞因子的水平，包括IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α、DAO、LPS和IFN-γ（Jiancheng，南京，中国）。

Western blotting
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（Beyotime）从经过不同处理的结肠组织中提取蛋白质[29]。等量的（30 mg）蛋白质样本通过10-15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到0.45 μm硝酸纤维素膜上。用5% BSA在TBST中封闭后，膜在4°C下与一级抗体孵育过夜，包括ZO-1（1:2000；Abcam，剑桥，英国）、Ocludin（1:1000；Abcam）、Claudin-1（1:1000；Abcam）、TLR4（1:1000；Abclonal，中国）、IL-1β（1:1000；CST，美国）、MyD88（1:1000；Proteintech，中国）和β-actin（1:2000；Abcam）。然后用TBST洗涤膜三次，并在室温下与辣根过氧化物酶结合的二级抗体孵育90分钟。最终，膜用TBST洗涤，然后用ECL试剂（Solarbio）处理，接着使用ChemiDoc XRS系统（Bio-Rad）捕获并分析条带。

免疫荧光染色
对于免疫荧光显微镜观察，结肠切片先用4%的甲醛固定，然后通过梯度乙醇溶液脱水[28]。接着用含有0.1%（v/v）Tween 20的PBS渗透处理，再用免疫染色清洗液（Beyotime Biotechnology，中国）洗涤，并用免疫染色阻断液阻断1小时。之后将结肠切片在4°C下与一抗孵育过夜。使用的一抗如下：兔抗Mucin 2（1:50；Proteintech，中国），兔抗ZO-1（1:50；Proteintech，中国），兔多克隆抗Claudin 1（1:50；Proteintech，中国）和兔多克隆抗Occludin（1:50；Proteintech，中国）。孵育后，用清洗液洗涤三次，然后与二抗孵育。细胞核用DAPI染色。图像使用荧光显微镜（Eclipse Ti-E，Nikon，日本）捕获。

RNA分离和基因表达
从小鼠中分离结肠组织，并储存在-80°C直至进一步分析。结肠组织用Trizol（Sangon，中国）试剂中的珠子进行匀浆，然后按照制造商的说明使用Evo M-MLV RT Premix for qPCR（AG11706，Accurate Biotechnology）逆转录为cDNA。定量实时PCR在Bio-Rad iQ5 PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）上进行。所有反应进行45个循环，循环条件包括95°C 30秒，40个循环95°C 5秒，55°C 30秒，以及95°C 15秒和60°C 30秒的解离步骤。内源性对照基因β-actin的相对表达使用2^-ΔΔCT方法确定[27]。本实验中使用的引物来自上海生物技术公司，并列在表1中。

表1 基因和引物序列

短链脂肪酸（SCFAs）分析
SCFAs调节免疫细胞的功能，以促进体内稳态[34]。将储存在-80°C的粪便解冻，称重，用20 μL稀释的硫酸（50%，v/v）、1000 μL乙醚和1 μL 2-乙基丁酸酸化，然后通过涡旋和摇晃3分钟进行匀浆。在冰水中超声处理30分钟，然后在-20°C下孵育30分钟，最后以12,000 rpm离心15分钟。上清液转移到含有250毫克无水硫酸钠的离心管中，充分混合后以12,000 rpm离心15分钟。得到的上清液通过0.22 μm有机膜（Millipore，美国）过滤。粪便中的SCFAs通过气相色谱-质谱（GC-MS，Agilent，日本）进行定量，使用以下温度参数：260°C，1 μL注射体积，50:1分流比，以及2.5分钟的溶剂延迟。加热程序如下：初始温度80°C，以40°C/min升温至120°C，然后以10°C/min升温至200°C，最后在230°C保持2分钟。质谱使用电子电离（EI）源进行，条件如下：离子源温度230°C，四极杆温度150°C，传输线温度250°C，电子能量设置为70 eV。质谱仪以全扫描模式（SCAN）操作，质量范围m/z 30–300。粪便中SCFAs的定量使用标准曲线确定。

16S rRNA基因测序分析
在干预的最后一天收集小鼠粪便，并使用E.Z.N.A.?土壤DNA试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）从粪便样本中分离总细菌DNA。使用引物338 F 5’-ACTCCTACGGGGGAGGCAGCAG-3’和806R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’通过PCR扩增微生物。使用Illumina MiSeq平台（Majorbio Bio-pharm，上海，中国）进行测序，并从研究数据库（版本7.1 http://drive5.com/uparse/）中选择序列相似度为97%的封闭参考操作分类单元（OTUs），并与SILVA128/16S细菌数据库对齐以获取分类信息。测序数据在Majorbio I-Sanger Cloud平台（http://www.majorbio.com/）上免费在线分析[28]。

RAW 264.7细胞培养
将冷冻的RAW 264.7巨噬细胞在37°C的水浴中解冻。解冻后，以8,000 r/min离心5分钟[28]。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在2 mL的完全DMEM中，其中包含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青霉素/链霉素溶液。在37°C下含5% CO2的条件下孵育24小时，直到细胞生长至80–90%。为了传代培养，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理细胞，并用DMEM终止消化。以8,000 r/min离心5分钟，弃去胰蛋白酶溶液，然后将细胞重悬在2 mL的DMEM中。轻轻 pipette以确保细胞悬浮，然后根据实验设计转移到培养皿或平板上。

Caco-2细胞培养和处理
Caco-2细胞通常在添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培养，温度为37°C，CO2浓度为5%。使用Transwell插件进行Caco-2细胞通透性测定。Caco-2细胞接种在24孔Transwell插件的上层腔室中，该插件具有聚碳酸酯过滤膜（聚酯，0.4 μm孔径，Corning，纽约，NY，美国），培养21天，直到形成TEER值为800–1000 Ω的紧密连接结构[45]。细胞用FP、pFP和CFS处理24小时。然后向上层腔室加入单富集的L. monocytogenes悬浮液（2 × 10^7 CFU/mL，500 μL），同时向基底腔室加入新鲜的无FBS DMEM（800 μL）。孵育3小时后，计数基底腔室中的侵袭性L. monocytogenes。使用Millicell ERS-2仪器（Millipore，Burlington，MA，美国）测量跨上皮电阻（TEER）。

统计分析
数据以平均值±标准差表示。使用单因素方差分析（ANOVA）比较多个组间的结果，随后使用Tukey的事后检验进行成对比较。统计分析使用GraphPad Prism 7.0进行，p值< 0.05被认为具有统计学意义。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，使用Levene检验验证方差齐性，然后进行ANOVA。对于微生物组相关分析，使用Kruskal-Wallis检验进行多重比较，并使用Benjamini-Hochberg假发现率（FDR）程序进行校正。

结果
FP、pFP和CFS在感染前没有引起细胞因子、器官指数和重量的变化
图1B显示了连续21天内小鼠体重的变化。在前6天，con组、pFP组和CFS组之间的体重没有显著差异，所有组的体重都有所增加。FP组和con组之间，以及pFP组和CFS组之间的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺或肠系膜器官指数也没有显著差异（图1C-G）。这些结果表明FP、pFP和CFS组对小鼠的体重或器官指数没有不良影响。

图1
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

FP、pFP和CFS对小鼠体重、器官指数和炎症因子的影响。A 实验设计。B 体重。C 脾脏重量。D 肠系膜淋巴结重量。E 肾脏重量。F 肝脏重量。G 胸腺重量。H TNF-α。I LPS。J DAO。K IL-6。L IL-10。M IFN-γ。数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

为了评估FP、pFP和CFS干预对小鼠全身炎症的影响，在治疗21天后使用ELISA测量血清中的炎症因子水平。如图1H-M所示，四组之间的TNF-α、LPS和IL-10水平没有显著差异。然而，FP组的DAO水平显著高于pFP组、CFS组和con组（p < 0.05）。尽管FP组的DAO水平显著升高，但这并未伴随炎症标志物的增加或组织病理损伤，表明这是一种生理适应而非不良影响。此外，FP、pFP和CFS干预显著降低了IL-6水平，pFP和CFS也降低了IFN-γ水平。这些结果表明，在正常情况下，FP、pFP和CFS不会对小鼠的体重、器官指数和炎症反应产生不良影响，但可以降低某些促炎因子的水平。

FP、pFP和CFS对感染前结肠、回肠和SCFAs产生的影响
如图2所示，对照组结肠长度为9.36 ± 0.25 cm，pFP组为9.10 ± 0.14 cm，FP组为9.00 ± 0.32 cm，CFS组为9.24 ± 0.29 cm，各组之间没有显著差异（p > 0.05）。回肠长度分别为对照组31.48 ± 0.97 cm，pFP组30.09 ± 1.87 cm，FP组28.56 ± 0.94 cm，CFS组30.46 ± 0.44 cm（p > 0.05）。回肠和结肠的H&E染色显示所有组的切片均正常，没有观察到病理差异（图2E，G）。

FP、pFP和CFS处理对感染前小鼠肠道健康的影响。A 结肠。B 结肠长度。C 回肠。D 回肠长度。E 代表性结肠H&E染色图像。放大倍数（上，×40）（下，×100）。F 组织学评分。G 代表性回肠H&E染色图像。放大倍数（上，×40）（下，×100）。H 绒毛高度。（I）肠壁。J 绒毛隐窝高度。K 绒毛/隐窝比率。L 乙酸。M 丙酸。N 丁酸。O 异丁酸。P 戊酸。Q 异戊酸。数据以平均值±标准差表示。（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）

如图2L-Q所示，干预21天后，con组的丁酸水平为0.95 ± 0.021 μg/mg，FP组为2.57 ± 0.47 μg/mg，pFP组为1.26 ± 0.086 μg/mg，CFS组为3.51 ± 0.26 μg/mg。FP组和CFS组的水平显著高于con组（p < 0.05）。戊酸水平分别为con组0.97 ± 0.0095 μg/mg，FP组3.02 ± 0.35 μg/mg，pFP组2.16 ± 0.15 μg/mg，CFS组2.01 ± 0.16 μg/mg，FP组、pFP组和CFS组的水平均显著高于con组（p < 0.05）。丙酸水平分别为con组0.24 ± 0.0059 μg/mg，pFP组0.51 ± 0.064 μg/mg，FP组1.16 ± 0.20 μg/mg，CFS组1.17 ± 0.075 μg/mg，con组与FP组、pFP组和CFS组之间存在显著差异。异戊酸水平分别为con组0.30 ± 0.13 μg/mg，pFP组1.33 ± 0.11 μg/mg，FP组1.73 ± 0.26 μg/mg，CFS组2.68 ± 0.16 μg/mg。此外，CFS组小鼠粪便中的丙酸和异丁酸水平较高，而FP组中的乙酸和丙酸水平较高。这些结果表明FP、pFP和CFS干预增加了SCFAs的产生。

FP、pFP或CFS预处理调节L. monocytogenes感染
为了评估FP、pFP和CFS对感染期间小鼠的影响，我们测量了小鼠的体重和粪便菌落计数（图3B）。接受FP、pFP和CFS处理的小鼠体重逐渐下降，而感染组在第2天继续减轻体重。相比之下，FP、pFP和CFS处理的小鼠体重恢复到基线水平。使用平板计数法评估L. monocytogenes，接受FP、pFP和CFS预处理的小鼠在整个感染过程中的粪便细菌负荷始终低于对照组（图3C，p < 0.05）。这些结果表明FP、pFP和CFS可以延缓体重下降并减少L. monocytogenes感染小鼠的粪便细菌负荷，表明它们在预防感染方面具有潜在效果。

图3
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

FP、pFP和CFS处理减弱了L. monocytogenes感染。A 实验设计。B 体重变化。C 粪便中的L. monocytogenes。D 临床评分。E 重量比例。炎症细胞因子的浓度。F IL-10。（G）IFN-γ。（H）TNF-α。I IL-6。J DAO。（K）LPS。数据以平均值±标准差表示。（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）

血清中的炎症因子水平反映了全身L. monocytogenes感染的严重程度。较高的细菌负荷会触发宿主对L. monocytogenes入侵的更大程度的炎症因子分泌。为了评估全身炎症的程度，我们使用ELISA测量了感染小鼠血清中的炎症因子表达。如图3F-K所示，五种炎症因子（IL-6、DAO、LPS、TNF-α和IFN-γ）的血清水平发生了显著变化（p < 0.05）。与FP、pFP和CFS处理组相比，这五种炎症因子的分泌量在mod组中显著增加。IL-10的水平在FP、pFP和CFS处理的小鼠中显著高于mod组。FP、pFP和CFS减少了感染L. monocytogenes的小鼠粪便和器官中的细菌数量。感染后第3天，对感染小鼠器官的肉眼检查显示，FP、pFP和CFS处理组的脾肿大程度减轻（p < 0.0001）。然而，与对照组相比，肝脏、肾脏、胸腺、胰腺和肠系膜的指标在五组之间没有显著差异，但都显著低于mod组（图4）。在感染前用FP、pFP和CFS处理的小鼠中，肠道外组织（包括脾脏、肝脏、肾脏、MLN、结肠和回肠）中的L. monocytogenes负荷显著减少。图4的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS减少了感染L. monocytogenes的小鼠粪便和器官中的细菌数量。FP、pFP和CFS还减少了L. monocytogenes感染小鼠的肠道炎症。感染后，测量了结肠长度：对照组为8.79 ± 0.63厘米，mod组为7.81 ± 0.76厘米，FP组为8.83 ± 0.56厘米，pFP组为8.59 ± 0.62厘米，CFS组为8.80 ± 0.63厘米。这些结果表明，FP、pFP和CFS干预措施缓解了小鼠结肠长度的缩短。通过H&E和AB/PAS染色进一步分析了结肠组织病理（图5C-F）。与FP、pFP和CFS处理的小鼠相比，模型小鼠表现出更严重的病理损伤，其特征是杯状细胞显著减少、大量炎症细胞浸润以及肠道上皮完整性受损（p < 0.01）。这些结果表明，FP、pFP和CFS干预增强了宿主对L. monocytogenes诱导的肠炎的抗性。这些发现表明，FP、pFP和CFS可以减少组织中的L. monocytogenes负荷，并减轻结肠组织损伤，突显了它们在宿主对抗全身性L. monocytogenes感染中的有益作用。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS减少了L. monocytogenes感染小鼠的肠道炎症和组织损伤。FP、pFP和CFS降低了L. monocytogenes感染小鼠的肠道炎症和组织损伤。A 结肠。B 回肠。C 代表性的H&E染色图像。放大倍数（上：40倍，下：100倍，黑色箭头：炎症细胞浸润；红色箭头：上皮细胞丢失）。D 组织学评分。E 代表性的AB/PAS染色图像。F 杯状细胞数量。数据以平均值±标准差表示。(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001) FP、pFP和CFS降低了L. monocytogenes感染小鼠的肠道炎症。如图6A-D所示，RT-qPCR分析显示FP、pFP和CFS组中Claudin 1、Occludin、ZO-1和Mucin 2基因的表达显著上调（p < 0.05）。为了进一步研究肠道屏障相关蛋白的表达，对Claudin 1、Occludin和ZO-1进行了Western blot分析。结果显示，这些蛋白在FP、pFP和CFS组中的表达显著增加（图6E-H）。肠道组织的免疫荧光染色（图6I）也证实了FP和CFS上调了蛋白表达。图6的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS影响了L. monocytogenes感染小鼠的紧密连接蛋白表达。A Claudin 1的mRNA表达。B Occludin的mRNA表达。C ZO-1的mRNA表达。D Muc2的mRNA表达。E 紧密连接蛋白的Western blot。F Claudin 1的定量。G Occludin的定量。H ZO-1的定量。I 紧密连接蛋白的免疫荧光图像。J Claudin 1的定量（IF）。K Occludin的定量（IF）。L ZO-1的定量（IF）。M Muc2的定量（IF）。数据以平均值±标准差表示。(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001) FP、pFP和CFS下调了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。为了研究FP、pFP和CFS在L. monocytogenes感染期间激活炎症通路的潜在作用，我们评估了MyD88及其下游细胞因子IL-1β的基因和蛋白表达（图7）。RT-qPCR分析显示，FP、pFP和CFS处理小鼠的结肠中NF-κB、TLR4、MyD88和IL-1β基因的表达显著下调（p < 0.05）。这些发现通过Western blot得到了进一步验证，显示相应蛋白的表达显著下调（图7E和F）。这些结果表明，FP、pFP和CFS的保护作用与TLR4/NF-κB信号通路和MyD88表达的下调有关。图7的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS影响了感染小鼠的MyD88蛋白表达和TLR4/NF-κB通路。A NF-κB的Western blot。B TLR4的Western blot。C MyD88的Western blot。D IL-1β的Western blot。E TLR4/NF-κB通路的Western blot。F NF-κB的mRNA表达。G IL-1β的mRNA表达。H TLR4的mRNA表达。I MyD88的mRNA表达。(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001) FP、pFP和CFS改善了L. monocytogenes感染引起的肠道微生物失调。肠道微生物群是调节宿主健康的关键因素之一。通过16S rRNA基因测序分析了FP、pFP和CFS干预后粪便中的肠道微生物多样性和组成变化。如图8A-D所示，使用alpha多样性分析评估了群落丰富度（Chao指数、Ace指数）和多样性（Shannon指数、Simpson多样性指数）。与对照组小鼠相比，FP组和CFS组的Simpson多样性指数较高，而LM组的Simpson多样性指数显著下降。实验结果显示，与对照组相比，L. monocytogenes感染导致微生物群落发生了显著变化。图8E显示了每个组在OTU水平的Venn图。对照组有356个OTU，LM组有337个，FP组有390个，pFP组有375个，CFS组有377个OTU，表明细菌种类数量没有显著变化。随后，为了进一步表征五组之间的肠道微生物群，主坐标分析（PCoA）显示同一组小鼠的样本聚集在一起，CFS组在感染后的微生物群与对照组相似。图8G-J显示了小鼠中各家族的相对丰度。其中，mod组中Erysipelotrichaceae和Ruminococcaceae的丰度显著增加，而Lactobacillaceae的丰度显著减少。在FP、pFP和CFS干预后，probiotics Muribaculaceae也在肠道微生物群中增加。为了进一步研究实验组之间的微生物组成差异，我们使用LEfSe和log LDA得分大于3.0以及p值小于0.05来识别差异表达的细菌。图8K中的直方图显示了各种细菌的相对丰度。观察到CFS组的Lactobacillus水平较高。另一方面，mod组显示Erysipelotrichales的相对丰度较高。pFP组显示Akkermansia muciniphila的丰度较高。图8L中的热图显示了7种肠道细菌属与炎症相关因素、肠道屏障相关因素以及SCFAs之间的相关性。特定分类群与炎症标志物之间的相关性表明可能存在关联，但并不能确定这些细菌直接调节炎症反应。具体来说，Lactobacillus与IL-10、Zo-1和丁酸盐呈显著正相关。Bacteroides与TNF-α和DAO呈强正相关，但与occludin和SCFAs（如乙酸盐）呈显著负相关。Akkermansia主要与IL-10呈强正相关。Alloprevotella与多种SCFAs呈负相关。Limosilactobacillus与丁酸盐呈强正相关。这些相关性表明，不同的肠道细菌属可能与宿主生理状态有关，可能通过它们与免疫反应的关系影响肠道屏障功能，并改变SCFAs水平，其中Bacteroides和Lactobacillus在免疫调节和代谢产物生成中起重要作用。图8的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS缓解了L. monocytogenes感染引起的肠道微生物失调。A Chao指数。B Ace指数。C Shannon指数。D Simpson多样性指数。E OTU水平的共享和独特细菌的Venn图。F PCoA图分析。G 肠道微生物群组成的比较。H Erysipelotrichaceae的相对丰度。I Muribaculaceae的相对丰度。J Lactobacillaceae的相对丰度。K LEfSe分析LDA得分。L 肠道微生物群与肠道炎症相关指数之间的Spearman相关性分析（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001) FP、pFP和CFS影响了感染后L. monocytogenes引起的SCFAs。SCFAs不仅是肠道上皮细胞的能量来源，还为宿主提供定植抵抗力。因此，我们接下来分析了感染L. monocytogenes的小鼠粪便中的SCFAs水平。如图9所示，感染后对照组和pFP组之间的SCFAs水平没有显著差异。然而，FP组和CFS组中的丙酸盐含量分别为1.85 ± 0.058 μg/mg和2.12 ± 0.25 μg/mg，而丁酸盐水平分别为2.86 ± 0.24 μg/mg和3.23 ± 0.51 μg/mg，戊酸盐水平分别为3.32 ± 0.091 μg/mg和3.24 ± 0.28 μg/mg。这些值显著高于其他两组（p < 0.05）。这些结果表明，FP和CFS在感染后积极调节了丙酸盐、丁酸盐和戊酸盐的生成。这可能是FP和CFS减少L. monocytogenes组织负荷并缓解感染的机制之一。图9的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS影响了L. monocytogenes感染小鼠的SCFAs。A 乙酸盐（B）丙酸盐（C）丁酸盐（D）异丁酸盐（E）戊酸盐（F）异戊酸盐通过GC-MS在不同处理组中测定。数据以平均值±标准差表示。(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001) FP、pFP和CFS影响了Raw 264.7细胞中的炎症因子水平，并减缓了肠道屏障损伤。为了研究FP、pFP和CFS对Raw 264.7细胞中炎症因子产生的影响（图10），干预组显著抑制了促炎因子水平，并增加了抗炎因子IL-10。图10的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示，FP、pFP和CFS影响了Raw 264.7细胞和Caco-2细胞的炎症因子和通透性。A TNF-α。B LPS。C IL-6。D IFN-γ。E DAO。F IL-1β。G IL-10。H Caco-2细胞单层的TEER值。数据以平均值±标准差表示。(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001) 使用Caco-2细胞开发了一个体外肠道上皮屏障模型。FP、pFP和CFS预处理减少了L. monocytogenes通过Caco-2单层的转移（p < 0.05）（图10H）。TEER变化以TEER%表示，在图10I中显示，mod组的值显著低于FP、pFP和CFS组。跨上皮阻力通透性测定进一步证明，FP、pFP和CFS减轻了L. monocytogenes引起的屏障功能丧失。总之，FP、pFP和CFS可能通过增强肠道上皮屏障来减轻L. monocytogenes感染。讨论F. prausnitzii被广泛用作益生菌，具有调节肠道微生态平衡、增强宿主免疫力、抑制有害细菌生长的潜在益处。它还有助于预防和治疗肠道感染，改善营养消化和吸收，减少肠道炎症，并可能对心血管健康和代谢疾病有积极影响[23, 35]。然而，F. prausnitzii在L. monocytogenes感染中的作用仍不完全清楚。本研究探讨了F. prausnitzii在L. monocytogenes感染过程中的作用。我们的研究结果表明，活的F. prausnitzii、巴氏杀菌后的F. prausnitzii及其无细胞上清液通过下调TLR4/NF-κB信号通路的表达，显著减轻了由L. monocytogenes感染引起的肠道损伤和疾病严重程度。关于基线生物安全性，我们的结果显示FP、pFP和CFS干预对体重、器官指数或肠道组织形态没有不良影响，这与F. prausnitzii公认的安全性特征一致[36]。值得注意的是，尽管主要的全身炎症标志物保持稳定，但IL-6和IFN-γ水平的显著降低表明在生理条件下可能具有免疫调节作用。这与最近的研究结果一致，即益生菌菌株即使在无疾病状态下也能调节宿主免疫，这表明这些干预可能在病原体挑战之前建立一种保护性的免疫基线[1, 20]。

肠道屏障是身体的重要防御线，其中肠道内的黏液层和上皮细胞形成了对抗潜在有毒物质的物理屏障，对维持肠道健康起着至关重要的作用[4]。组织病理学分析显示，L. monocytogenes感染的小鼠上皮细胞完整性严重受损，而FP、pFP和CFS组则表现出改善的病理特征，包括杯状细胞增多、上皮细胞结构改善以及炎症细胞浸润和黏膜损伤减少。先前的研究报告称，食源性病原体感染的组织学分析通常显示结肠上皮中缺乏杯状细胞[51]。紧密连接蛋白是膜相关蛋白，可调节细胞间的物质流动，紧密连接相邻细胞并形成屏障[55]。在肠道炎症期间，ZO-1的表达和分布可能会改变，破坏紧密连接并增加肠道屏障的通透性[14]。Occludin功能受损会导致紧密连接松弛，可能引起细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的异常释放，从而进一步促进炎症[22, 26]。缺乏黏蛋白的小鼠对肠道感染的易感性增加，表明黏液层在防御肠道病原体方面起着关键作用[5, 16]。F. prausnitzii恢复了肠道屏障功能，并改善了DSS诱导的结肠炎中的黏蛋白2分泌。在FP、pFP和CFS处理的小鼠中，感染后观察到黏蛋白2和其他紧密连接蛋白的高表达。这一观察结果与FP通过重塑黏液层和刺激杯状细胞产生黏蛋白来保护肠道的已知作用一致。这些发现支持了FP、pFP和CFS可能通过增强肠道屏障功能标志物来预防感染的假设。然而，我们认识到，由于本研究未进行直接的通透性测定，因此对体内屏障通透性的功能验证有限。因此，未来的研究将更彻底地探讨这一方面。我们计划进行体内通透性测定，例如FITC-葡聚糖通量测量，以提供屏障保护的直接功能证据。此外，通过整合多组学方法可以进一步阐明我们研究中的机制机制。例如，有研究利用整合转录组学和代谢组学分析来研究益生菌在细菌感染期间介导的宿主反应[19, 43]。他们的研究表明，益生菌可以调节宿主免疫、代谢和肠道屏障完整性，为理解我们干预中观察到的更广泛的全身效应提供了框架。将我们的表型数据与这些多组学技术结合的未来工作可能会揭示FP、pFP和CFS对抗肠道病原体的新途径。

MyD88（髓系分化因子88）是一种细胞内信号分子，在免疫细胞中普遍表达，是Toll样受体（TLRs）的关键适配器[6, 15]。作为关键的信号适配器，MyD88连接NF-κB/TLR4通路[13, 38]。这导致NF-κB激活和核转位，启动免疫反应。促炎细胞因子会增加肠道紧密连接蛋白的通透性。在本研究中，我们发现FP、pFP和CFS降低了细胞内适配器蛋白MyD88的表达，并下调了结肠组织中的促炎细胞因子IL-1β。这与先前的研究结果一致，即Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）有助于维持肠道屏障完整性，减少病原体和有害物质的通过，从而降低NF-κB通路的激活[42]。类似于NF-κB，TLR4也负责产生促炎细胞因子。TLR4作为模式识别受体，能够识别病原体相关的分子模式（如细菌脂多糖（LPS），进而激活下游信号通路并促进炎症反应。在TLR4的信号传导过程中，连接蛋白（如MyD88和TRIF）通过招募和激活IKK复合体发挥关键作用，最终导致NF-κB的激活。同样，绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和葡萄籽提取物中的原花青素具有抗炎和抗氧化特性，可以调节TLR4/NF-κB通路[58]。同样，FP、pFP和CFS的处理也下调了MyD88蛋白，调节TLR4/NF-κB通路并减少肠道损伤。在我们的研究中，TLR4、MyD88和NF-κB通路组分的下调表明这些信号通路可能参与了FP、pFP和CFS的保护作用。然而，需要注意的是，这些发现基于表达变化，提供了关联证据而非直接的机制证明。未来的工作将采用TLR4敲除模型或特定通路抑制剂进行更深入的研究，以明确具体的分子机制。

肠道中的短链脂肪酸（SCFAs）主要来源于肠道微生物对膳食纤维的发酵过程[57]。这些SCFAs在肠道中具有多种重要作用，如为肠道细胞提供能量、调节免疫系统、抑制有害细菌的生长、预防肠道炎症、改善肠道屏障功能以及降低心血管疾病风险[49]。越来越多的证据表明，SCFAs的水平在肠道屏障和炎症中起着重要作用。其中，丁酸通过氧化代谢为肠道细胞提供能量，促进细胞增殖和修复，这对于维持肠道屏障的完整性至关重要[50]。此外，SCFAs能够调节紧密连接蛋白的表达和分布。研究表明，丁酸可以增加紧密连接蛋白（如occludin和compactin）的表达，从而增强肠道屏障的密封性并降低肠道通透性[31]。在本研究中，FP、pFP和CFS干预恢复了L. monocytogenes诱导的粪便SCFAs含量的下降。特别是FP和CFS显著增加了SCFAs的含量，主要是丙酸、丁酸和戊酸。据报道，丙酸缺乏可能导致紧密连接蛋白表达减少、肠道通透性增加以及肠道微生物群失衡，这些因素共同增加了肠道对病原体和有害物质的通透性[33]。同时，与对照组相比，感染L. monocytogenes的小鼠肠道菌群的α多样性及微生物组成发生了显著变化，Bacteroidetes相对富集。这与先前的研究结果一致，即IBD组和Treat组的粪便样本在α多样性指数（Richness指数和Chao1指数）上存在显著差异。甘露糖寡糖（MOS）可以促进肠道微生物群的多样性，包括Akkermansia和Bacteroides物种，并抑制某些病原体[9]。然而，在FP、pFP和CFS干预后，乳杆菌更加富集。这与先前的研究结果一致，即益生菌（如F. prausnitzii、Bifidobacterium和Lactobacillus）可以帮助预防或减少菌群失调[47]。因此，我们的发现表明，FP、pFP和CFS治疗与减轻L. monocytogenes感染、维持更好的肠道微生物群组成以及减少肠道炎症有关。

F. prausnitzii是一种众所周知的丁酸生产者，这种SCFA通过调节免疫反应、抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs）以及作为结肠细胞的主要能量来源，对其抗炎和增强屏障的作用至关重要[7]。此外，F. prausnitzii的分泌组富含生物活性分子，如微生物抗炎分子（MAMs），这些分子可以维持肠道完整性，还有细菌素、酶和具有免疫调节特性的信号肽[52]。除此之外，CFS代表了一种复杂的代谢产物矩阵，可能包括其他有机酸、维生素、细胞外多糖（EPS）和脂肪酸酰胺，所有这些都与宿主-微生物通信和免疫调节有关[37, 48]。尽管如此，我们明确承认当前研究的一个重大局限性在于缺乏对CFS的全面代谢组学和蛋白质组学表征。未来的研究将深入分析具体的生物活性成分及其潜在机制。

总之，我们的研究表明，活的F. prausnitzii、巴氏杀菌后的F. prausnitzii及其无细胞上清液能有效减轻小鼠的L. monocytogenes感染。保护机制与增强肠道屏障完整性、恢复肠道微生物群稳态、补充SCFAs有关，并且与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的下调相关，这与观察到的炎症反应减少相一致。本研究的局限性包括缺乏体内通透性测定以及对导致这些效果的具体生物活性成分的识别不完全。未来的研究将采用整合代谢组学和蛋白质组学分析，以分离关键的功能分子并进一步阐明F. prausnitzii的后生物特性背后的精确机制。