源自食品的利莫沙乳杆菌GR-3可增强抗PD-1免疫疗法的疗效

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Food-Derived Limosilactobacillus fermentum GR-3 Enhances Anti–PD-1 Immunotherapy Efficacy

　　摘要：免疫检查点阻断（ICB）显著改善了癌症治疗效果，但其应用仍受到异质性反应率和免疫相关不良事件的限制。虽然肠道微生物群的调节为优化ICB提供了有前景的途径，但缺乏具有明确作用机制的合理选择的益生菌。在此，我们选择了Lactobacillus fermentum GR-3（L. fermentum GR-3），这是一种经过预筛选的食品来源菌株，具有出色的胃肠道耐受性（维持>10^7 CFU/mL）、抗氧化活性（87.4%的DPPH清除效率）和免疫调节潜力，作为增强抗PD-1疗法的口服组合策略。在MC38小鼠结直肠癌模型中，口服L. fermentum GR-3显著增强了ICB的效果，比单独使用抗PD-1疗法显示出更大的肿瘤抑制作用（体积减少51.7%，而未经处理的对照组为0%），同时减轻了治疗相关的体重下降。在肿瘤微环境（TME）中，联合疗法促进了树突状细胞的成熟（MHC-II? DCs达到56.0%），有利于促炎巨噬细胞的极化（M1增加至20.8%，而M2减少至2.57%），并抑制了调节性T细胞的浸润（Tregs减少至2.32%）。这些变化与增强的细胞毒性反应密切相关，Granzyme B? CD8? T细胞的比例达到了40.4%（是PD-1单药疗法效果的两倍）。从机制上讲，L. fermentum GR-3的定植部分逆转了肿瘤相关的肠道菌群失调，丰富了产生短链脂肪酸（SCFA）的菌群（例如Lachnospiraceae和Bacteroides），并增加了肠道中的SCFA浓度（例如丙酸和丁酸分别恢复到70.13和26.07 μM/g）。这种微生物-代谢变化伴随着黏膜紧密连接基因（ZO-1、Occludin）表达的上调。此外，L. fermentum GR-3促进了平衡的免疫反应。在系统水平上，它减轻了氧化应激并缓冲了外周炎症信号，有助于非肿瘤组织（脾脏和结肠）的免疫稳态。总体而言，这些发现使L. fermentum GR-3成为一种可行的策略，可以同时增强ICB的效果并提高治疗耐受性。

引言：癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，预计到2040年将有2800万新病例和1620万死亡病例[1]。传统的癌症治疗方法，包括手术切除、化疗、放疗和免疫疗法已被广泛使用[2]。免疫疗法通过利用身体的免疫反应来对抗癌症，从而改变了肿瘤学领域[3]。免疫疗法的一个重大里程碑是ICB疗法的发展，该疗法专门针对PD-1/PD-L1通路，防止T细胞耗竭并恢复强大的抗肿瘤免疫反应[4]。例如，像nivolumab和pembrolizumab这样的PD-1抑制剂在晚期黑色素瘤中的客观反应率为40-45%，在非小细胞肺癌中为20-30%[5, 6]。尽管取得了这些成功，但PD-1阻断单药疗法仍面临显著的限制。最近的荟萃分析显示，只有20-40%的患者对PD-1阻断表现出持久反应，许多患者出现了原发性或获得性耐药性[7]。此外，PD-1阻断可能导致Treg过度激活，从而导致免疫抑制而不是免疫激活[8]。这些挑战激励我们探索创新策略来提高ICB疗法的效果。

肠道微生物群是一个多样且动态的微生物生态系统，可以调节宿主的免疫和代谢途径[9]。研究表明，癌症进展会破坏肠道微生物的稳态，导致有益细菌的数量减少[10]。例如，在结直肠癌患者中，主要的丁酸盐生产者Faecalibacterium prausnitzii减少了60%[11]。对于维持肠道屏障完整性至关重要的Akkermansia muciniphila，在晚期乳腺癌患者中减少了大约75%。同样，对免疫调节至关重要的Bifidobacterium物种在黑色素瘤患者中减少了45%[12]。相比之下，某些病原性或机会性细菌，如Clostridiaceae、Faecalibacterium、Ruminococcaceae和Fusobacterium nucleatum在癌症患者中增加，导致炎症和肿瘤进展[13, 14]。此外，癌症引起的肠道微生物群失调会导致多种免疫紊乱，包括肿瘤部位CD8? T细胞浸润减少40%[15]，调节性T细胞数量减少[16]，以及保护性免疫球蛋白A（IgA）水平下降约50%[17]。研究表明，严重菌群失调的患者免疫疗法的反应率可能降低多达30%[18]。代谢组学分析显示，短链脂肪酸（尤其是丁酸盐）显著减少，而这些脂肪酸对于维持肠道屏障功能和支持抗肿瘤免疫至关重要[19]。这些免疫和代谢物的变化与癌症引起的微生物失衡有关[20]。这些发现强调了迫切需要治疗策略来恢复肠道微生物平衡，以优化免疫疗法的效果。

益生菌在提高免疫疗法效果方面具有巨大潜力[21]。证据表明，益生菌可以通过调节免疫反应、改善肠道屏障完整性和恢复微生物平衡来增强PD-1疗法的效果。例如，Bifidobacterium已被证明可以在黑色素瘤模型中与抗PD-L1疗法结合使用，增强树突状细胞的功能[22]。在结直肠癌模型中，补充Lactobacillus rhamnosus与单独使用免疫疗法相比，肿瘤减少了42%[23]。Bifidobacterium longum在结直肠癌模型中上调了紧密连接蛋白（如claudin-3和occludin），有助于改善肠道屏障功能。同样，Lactobacillus rhamnosus GG通过调整Firmicutes/Bacteroidetes的比例来恢复肠道微生物群的稳态[24]。临床研究进一步支持了这些发现，接受益生菌和PD-1疗法的结直肠癌患者的生存期延长了4.2个月[25]。尽管有这些有希望的发现，但目前用于增强抗PD-1免疫疗法的大多数益生菌都来源于人类肠道微生物群，因此依赖于宿主的天然微生物群。因此，需要具有已知安全性的食品来源益生菌，它们能够在不同的生理压力下有效定植肠道并通过调节微生物群来增强免疫疗法的效果。

传统的发酵食品富含益生菌，由于其独特的潜在优势以及假定的安全性而引起了广泛关注[26]。我们的研究团队之前从西北地区的传统发酵食品“Jiangshui”中分离出了L. fermentum GR-3。该菌株已被证实可以降低尿酸水平、减轻肿瘤引起的氧化应激、增强宿主免疫功能并调节肠道微生物群[27]。在高尿酸血症患者中的临床试验验证了L. fermentum GR-3的有利安全性和耐受性，表明其具有更广泛的治疗应用潜力[28]。以此为基础，我们的研究探讨了L. fermentum GR-3如何与PD-1疗法结合使用，通过提高免疫检查点抑制剂的效力来改善癌症治疗效果。使用16S rRNA测序评估肠道微生物群的变化，并采用RT-qPCR定量分析与免疫功能和屏障保护相关的基因表达。评估了肿瘤组织和血清中的细胞因子谱以及肿瘤细胞凋亡，以评估L. fermentum GR-3的效果。结果表明，L. fermentum GR-3通过调节肠道微生物群和增强免疫反应，提高了PD-1免疫疗法的抗肿瘤效果，为改善癌症治疗效果提供了有前景的策略。

材料与方法：
**细菌菌株和培养条件**
L. fermentum GR-3之前已从西北地区的传统食品“jiangshui”中分离并纯化[29]。该菌株已正式存放在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，编号M2021902）。为了进行体外抗氧化能力比较，还使用了另外六种菌株（Pediococcus acidilactici S1、S5和S6；L. fermentum S2；Lactiplantibacillus plantarum S4；以及Lactobacillus timonensis S7）。这些对照菌株也是由我们的实验室从“jiangshui”中分离并纯化的。为了确保表型和遗传稳定性，所有实验中使用的细菌都限制在原始-80°C甘油储存液的三代以内。所有菌株都在37°C下在de Man, Rogosa and Sharpe（MRS）培养基中培养，不进行搅拌。通过测量600 nm处的光密度（OD???）来常规监测细菌生长。在对数生长阶段（OD???在0.8到1.0之间）通过离心（4°C下8,000 rpm离心5分钟）收集样本，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。对于体内给药，将L. fermentum GR-3细菌颗粒重新悬浮在无菌PBS中，最终浓度为1×101? CFU/mL（以每100 μL给药体积提供1×10? CFU的目标剂量）。为了确保批次间的一致性，在每次给药前通过连续稀释并在37°C下培养48小时的MRS琼脂板上计数菌落来严格验证实际给药剂量。

**L. fermentum GR-3的益生菌特性**
使用总抗氧化能力（T-AOC）和DPPH自由基清除活性来评估L. fermentum GR-3及其对照菌株（S1–S7）的体外抗氧化能力。这些参数是按照制造商的说明使用标准化的商业试剂盒（T-AOC试剂盒编号A015—2—1，DPPH试剂盒编号A153—1—1；南京建城生物工程研究所，南京，中国）进行测量的。简而言之，T-AOC是通过ABTS方法在405 nm处测量吸光度来确定的，而DPPH自由基清除活性是在517 nm处测量的。通过离心过夜的细菌培养物（10,000 × g，4°C，10分钟）制备无细胞上清液。按照试剂盒制造商的指南，所有测量都重复三次[30, 31]。为了评估胆汁耐受性，L. fermentum GR-3在添加了三种特定类型胆盐的MRS培养基中培养：牛胆盐（产品编号S30875）、猪胆盐（CAS编号8008—63—7）和牛磺酸钠（CAS编号145—42—6）。所有胆盐均购自上海Yuanye生物技术有限公司（上海，中国）。每种胆盐的最终浓度分别为0.5%和1.0%（w/v）。为了测试pH耐受性，该菌株在pH值从2.0到7.0的MRS培养基中培养。所有培养基都接种了过夜培养物（1% v/v），并在37°C下静态培养12小时以维持微厌氧环境。使用Thermo Scientific Multiskan GO微孔板读取器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）连续监测600 nm处的光密度（OD???）来监测细菌生长动力学。未接种的MRS培养基（含有相应的pH值或胆盐）用作空白对照以校正背景吸光度。由于OD???同时反映了活细胞和死细胞的质量，因此该指标仅用于评估相对生长趋势，而不是绝对存活率。随后通过比较在压力条件下生长的细菌的净OD???（样本吸光度减去空白值）与对照组（在标准未调整的MRS培养基中最佳条件下生长的细菌）的净OD???来计算相对生长率，并以百分比表示[32, 33]。使用模拟消化条件评估了L. fermentum GR-3的胃肠道存活能力。该菌株在MRS培养基中静态培养（37°C，24小时），通过离心（10,000 × g，4°C，10分钟）收集，并用PBS（0.1 M，pH 7.2）洗涤三次。随后，将细菌重新悬浮在0.5% NaCl中，调整OD???为1.0 ± 0.05，并暴露于模拟胃液（3 mg/mL胃蛋白酶，0.5% NaCl，pH 2.8）或肠液（1 mg/mL胰酶，0.5% NaCl，pH 8.0）的过滤灭菌溶液中。为了准确量化真正的益生菌存活率并避免基于OD的方法的过度估计，通过CFU计数严格确定了绝对存活率。细菌存活率是通过在初始时间点（0小时）和37°C下孵育12小时后，对样本进行连续稀释并接种在MRS琼脂上来量化的[34]。

**细胞系和培养条件**
MC38小鼠结直肠癌细胞系来自兰州大学第一医院的Weilin Jin教授实验室。细胞培养在添加了10%热灭活的胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的抗生素混合物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中生长。培养在受控环境中（37°C，5% CO?，湿润气氛），每2-3天进行一次传代培养。严格维持这种传代频率以防止接触抑制，并确保MC38细胞始终处于指数生长阶段，从而保持最佳的细胞活力。细胞汇合度保持在30%到80%之间。为了标准化肿瘤发展，使用第3-7代的细胞（汇合度为70-80%）进行肿瘤植入实验[35]。选择这个特定的代数窗口是因为非常早期的代数（例如第1-2代）的细胞可能尚未完全从冷冻保存的应激中恢复，而长时间的体外传代可能导致基因漂变、表型改变和肿瘤发生性的变化。使用第3-7代的细胞可以确保体内肿瘤模型的稳健性、一致性和可重复性。

**小鼠中的肿瘤模型建立**
所有动物实验均按照兰州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行（批准编号EAF2024048）。从兰州大学实验动物研究中心获得了30只4-6周大的C57BL/6雌性小鼠，将它们饲养在单独通风的笼子中（每笼6只小鼠），在受控条件下（22±2°C，50±10%相对湿度，12小时光照/黑暗周期），并提供标准啮齿动物饲料和无菌水。实验前动物适应一周。为了建立肿瘤模型，随机选择24只小鼠在其右腋窝区域皮下注射100 μL的细胞悬浮液（1×10?个细胞），使用26号针头，其余6只小鼠作为健康对照组（CK）。MC38细胞在汇合度为80-90%时收获，用冰冷的PBS洗涤两次，并重新悬浮至1×10?个细胞/mL的浓度。使用台盼蓝排除法确认细胞活力，活力始终超过95%。每天监测肿瘤形成情况，并使用数字卡尺测量肿瘤尺寸。大约在注射后7天，当可触及的肿瘤体积达到约50 mm3时，建立了稳定的肿瘤模型。肿瘤体积的计算公式为：体积 = 0.5 × 长度 × 宽度2。根据批准的IACUC方案，将体内肿瘤体积的最大值定为1500 mm3作为伦理人道终点[36, 37]。在整个研究过程中密切监测动物，并严格遵循机构动物福利指南，包括过度肿瘤负担、活动能力受损或一般痛苦迹象等标准。

**动物实验设计**
经过一周的适应期（从第-14天到第-7天），在第-7天对小鼠进行皮下注射100 μL的细胞悬浮液（1×10?个MC38细胞）以建立肿瘤模型。健康对照组（CK）小鼠皮下注射等量的无菌PBS。在七天的监测期（从第-7天到第0天）后，确认肿瘤成功建立，将具有可触及肿瘤（约50 mm3）的小鼠根据基线肿瘤体积和体重进行分层。如实验时间线所示，然后将小鼠随机分配到五个不同的组（每组n=6，总共5组）：（1）CK（健康对照组）；（2）Tumor（携带肿瘤的未治疗对照组）；（3）PD1（抗PD-1单药治疗）；（4）PD1/GR-3（抗PD-1与L. fermentum GR-3联合治疗）；（5）GR-3（L. fermentum GR-3单药治疗）。治疗干预从第0天开始。在PD1和PD1/GR-3组中，小鼠每三天接受一次抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠100 μg；BioXcell，#BE0146—5MG，RRID: AB_10949053，Rat IgG2a）的腹腔注射。对于微生物群干预，PD1/GR-3和GR-3单药治疗组从第0天开始每天口服给予L. fermentum GR-3（悬浮在100 μL PBS中，剂量如治疗方案所示），直到第16天收获。选择这个特定的益生菌剂量是基于小鼠微生物组研究中的既定方案[38]。为了最小化观察者偏差，由不了解组分配的研究人员使用数字卡尺在治疗后第7天、第10天、第13天和第16天连续测量肿瘤尺寸来监测肿瘤生长和治疗反应。同样，所有下游分析程序（包括16S rRNA测序、qPCR和ELISA）都在不了解组标识符的人员对编码样本进行。在第16天人道地收获小鼠。如果肿瘤负担接近批准的伦理限制（严格定义为肿瘤体积超过1,500 mm3或严重肿瘤溃疡）或观察到严重痛苦迹象，根据批准的IACUC方案提前对动物实施安乐死。

**样本收集和处理**
所有样本收集程序都在严格无菌条件下进行。在三个关键时间点收集粪便样本：肿瘤接种前（第-7天）、肿瘤建立后7天但治疗开始前（第0天）以及实验终点（第16天）。收集粪便样本时，将单个小鼠放置在干净的无菌笼子中过夜，以便自然排便。立即收集新鲜的粪便颗粒，迅速冷冻在液氮中，并储存在-80°C直到分析。通过眼后出血收集血液样本。收集后，样本在室温下静置30分钟凝固，然后在4°C下以3000×g离心15分钟。小心分离血清，分装以减少冻融循环，并储存在-80°C。通过颈椎脱位实施安乐死后，小心切除皮下肿瘤、脾脏、结肠、肝脏和肾脏。对于肿瘤内微生物群分析（典型的低生物量环境），使用无DNA的无菌仪器在干净的工作台上收获肿瘤组织，以严格防止环境污染。修剪外部肿瘤表面以去除潜在的皮肤相关微生物污染。每个肿瘤无菌分割：一部分立即放入无DNA的无菌微管中，迅速冷冻在液氮中，并储存在-80°C以进行后续的16S rRNA基因测序。剩余的肿瘤组织用于其他分析。一部分用4%戊二醛固定用于组织学评估，包括TUNEL染色以评估凋亡。这些固定样本被送往武汉Servicebio科技有限公司（中国武汉）进行切片和染色。剩余的未固定肿瘤、脾脏和结肠组织储存在-80°C以进行后续的基因表达和细胞因子分析。

**实时定量PCR（RT-qPCR）**
使用RNAiso Plus Kit（TaKaRa，中国）进行总RNA分离，并加入额外的质量控制措施。通过NanoDrop分光光度计检查RNA的质量和纯度（确保A???/A???比率在1.8–2.0之间），并通过琼脂糖凝胶电泳确认结构完整性。随后，使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）合成第一链cDNA，每个反应处理1 μg的总RNA。基因表达分析在QuantStudio 5平台上进行（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），使用SYBR Premix Ex Taq（目录号RR820A，TaKaRa）。反应总体积为20 μL，包含10 μL的2×SYBR Green混合物、0.4 μL的正向和反向引物（10 μM）、2 μL的模板cDNA和7.2 μL的无核酸酶H?O。PCR循环条件如下：初始变性步骤在95°C下30秒，然后是40个循环的95°C变性10秒和60°C退火/延伸30秒。包括熔解曲线分析以确认扩增特异性。在本研究中，我们量化了结肠和脾脏组织中的GzmB和Foxp3的表达，以及结肠组织中的ZO-1和Claudin3的表达。这些特定目标基因的引物序列来自之前的研究[39]，详细序列列在表S1中。相对基因表达使用2^-ΔΔCt方法计算，以β-actin作为内部参考进行标准化，使用每个样本的三个技术重复的平均值。

**酶联免疫吸附测定（ELISA）**
使用Elabscience ELISA试剂盒，我们分析了组织和血清样本中的四种关键细胞因子（IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A）。组织制备包括在添加了蛋白酶抑制剂的冰冷PBS中匀浆0.1 g样本，然后高速离心（12000 g，15分钟，4°C）以获得清澈的上清液。测量结果与标准曲线重复进行，吸光度值在Bio-Rad微孔板读数器（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）上读取（450/570 nm）。细胞因子浓度使用四参数逻辑回归进行量化，工作范围分别为16–1,000 pg/mL（IFN-γ）、16–500 pg/mL（IL-6）、16–1,000 pg/mL（IL-10）、16–1,000 pg/mL（IL-17A）和16–2,000 pg/mL（TNF-α）。超出这些检测范围的样本适当稀释并重新检测。

**16S rRNA基因测序和生物信息学分析**
根据制造商的说明，使用E.Z.N.A.?土壤DNA Kit（Omega Bio-tek，美国诺克罗斯）从粪便和肿瘤样本中提取微生物基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA的完整性，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量浓度。提取的样本在下游处理前储存在-80°C。细菌群落分析针对16S rRNA基因的高变区V3-V4，使用338F引物（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R引物（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）在T100 Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）中进行。20 μL的扩增混合物包含FastPfu成分（缓冲液、聚合酶、dNTPs）、引物和模板DNA。热循环程序包括初始的95°C变性3分钟，然后是27–30个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒和72°C延伸45秒，最后在72°C下延伸10分钟。包括熔解曲线分析以确认扩增特异性。在本研究中，我们量化了结肠和脾脏组织中的GzmB和Foxp3的表达，以及结肠组织中的ZO-1和Claudin3的表达。这些特定目标基因的引物序列来自之前的研究[39]，详细序列列在表S1中。相对基因表达使用2^-ΔΔCt方法计算，以β-actin作为内部参考进行标准化，使用每个样本的三个技术重复的平均值。

**酶联免疫吸附测定（ELISA）**
使用Elabscience ELISA试剂盒，我们分析了组织和血清样本中的四种关键细胞因子（IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A）。组织制备包括在添加了蛋白酶抑制剂的冰冷PBS中匀浆0.1 g样本，然后高速离心（12000 g，15分钟，4°C）以获得清澈的上清液。测量结果与标准曲线重复进行，并在Bio-Rad微孔板读数器（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）上读取450/570 nm的吸光度值。细胞因子浓度使用四参数逻辑回归进行量化，工作范围分别为16–1,000 pg/mL（IFN-γ）、16–500 pg/mL（IL-6）、16–1,000 pg/mL（IL-10）、16–1,000 pg/mL（IL-17A）和16–2,000 pg/mL（TNF-α）。超出这些检测范围的样本适当稀释并重新检测。

**16S rRNA基因测序和生物信息学分析**
根据制造商的说明，使用E.Z.N.A.?土壤DNA Kit（Omega Bio-tek，美国诺克罗斯）从粪便和肿瘤样本中提取微生物基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA的完整性，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量浓度。提取的样本在下游处理前储存在-80°C。细菌群落分析针对16S rRNA基因的V3-V4高变区，使用338F引物（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R引物（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）在T100 Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）中进行。20 μL的扩增混合物包含FastPfu组件（缓冲液、聚合酶、dNTPs）、引物和模板DNA。热循环程序包括初始的95°C变性3分钟，然后是27–30个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒和72°C延伸45秒，最后在72°C下延伸10分钟。使用Omega PCR Cycle Kit（Omega Bio-tek）进行凝胶纯化，并使用Qubit 4.0荧光计（Thermo Fisher Scientific）进行定量后，将纯化的扩增子等摩尔量合并并在Illumina MiSeq平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥，Tsingke Biotechnology Co., Ltd.，北京）上进行配对末端测序（PE300）。随后的生物信息学分析使用Tsingke Biotechnology提供的标准流程进行，并增加了严格的质量控制措施[40]。测序后，使用fastp对原始FASTQ文件进行去多路复用和质量过滤，并使用FLASH合并配对末端读段。为了实现高分辨率的微生物组分析，在QIIME 2框架中使用DADA2插件去除序列中的噪音、去除嵌合体并生成Amplicon Sequence Variants（ASVs）。使用基于标准SILVA数据库（版本138）训练的Naive Bayes共识分类器进行ASVs的分类。鉴于肿瘤内微生物组的低生物量特性，应用了严格的污染控制。根据阴性对照（无菌水和DNA提取空白）的测序数据，计算并过滤出潜在的污染物ASVs。

**L. fermentum定植的量化**
为了评估L. fermentum GR-3的定植效果，对小鼠粪便和远端结肠黏膜样本进行了定量实时PCR（qPCR）。体内实验完成后，立即切除约1厘米的远端结肠段并用无菌0.9%盐水彻底冲洗。这些段纵向打开，轻轻刮取黏膜层以收集黏膜样本。使用Tiangen粪便DNA Kit（北京天根）从粪便和结肠黏膜样本中提取基因组DNA。所有提取的DNA样本在分析前储存在-80°C。qPCR测定在QuantStudio 5实时PCR系统（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州）上进行，使用针对L. fermentum的特异性引物和通用引物（图S1）[41]。使用含有已知浓度的特定目标序列的质粒DNA的十倍系列稀释仔细生成标准曲线。最终，通过确定L. fermentum与总细菌的比例来估计L. fermentum GR-3在结肠黏膜和粪便中的定植水平，基于建立的标准曲线[42]。

**短链脂肪酸（SCFAs）的量化**
使用气相色谱法（GC-FID）检测小鼠粪便中的SCFAs浓度。粪便提取程序按照之前描述的方法进行[43]。简而言之，大约600 mg的冷冻粪便样本解冻并完全重新悬浮在1.2 mL的PBS（pH 7.4）中。悬浮液剧烈涡旋后，然后在4°C下以15,000×g离心15分钟。此后，收集了200微升的上清液，通过0.22微米的注射器过滤器过滤，并加入100微升50%（v/v）的H?SO?进行酸化。在室温下孵育2分钟后，将酸化混合物用0.4毫升的乙醚进行液-液萃取。小心收集上层有机相，并使用配备FID检测器的Trace 1300气相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，新加坡）进行分析。色谱分离是在TG-WAXMS毛细管柱上进行的（30米×0.25毫米，Thermo Scientific，美国）。使用氮气作为载气。注射口和检测器的温度分别保持在240°C和250°C。烤箱温度程序从100°C开始（保持1分钟），以5°C/分钟的速率逐渐升高到150°C，然后以20°C/分钟的速率升高到240°C，最后保持5分钟。通过将每个样本的峰面积和保留时间与标准参考溶液进行比较，确定特定SCFAs的绝对浓度。

体内肠道通透性测定
为了评估肠道通透性，在口服荧光异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖（4 kDa，Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国）之前，小鼠禁食4小时。FITC-葡聚糖溶解在PBS（pH 7.4）中，并以100毫克/千克体重的剂量通过口服灌胃给药。灌胃后再次禁食4小时，收集血液样本并分离血清。随后，将每个血清样本与等体积的PBS混合。使用Varioskan Flash微孔板读数器（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）在485纳米的激发波长和535纳米的发射波长下立即量化荧光强度。根据在PBS中连续稀释FITC-葡聚糖生成的标准曲线计算血清中FITC-葡聚糖的绝对浓度。

肿瘤免疫微环境的流式细胞术分析
流式细胞术分析，包括组织处理、细胞染色和数据采集，由甘肃Solivia生物技术有限公司（兰州，中国）执行。简要来说，为了全面了解肿瘤微环境中的免疫变化，准备了来自皮下肿瘤组织的单细胞悬浮液。切除的肿瘤被切成小块，并在37°C下用胶原酶IV和DNase I酶解45分钟，然后通过70微米尼龙细胞过滤器过滤。为了确保严格的分析并消除非特异性结合，细胞首先与可固定活力染料一起在4°C下孵育15分钟，以排除死细胞，同时加入纯化的抗小鼠CD16/32抗体（Fc阻断）。为了评估表面标记物，预阻断的细胞在4°C下在黑暗中孵育30分钟，使用优化的荧光素结合抗体混合物。表面染色面板包括T细胞亚群（抗CD45、抗CD3、抗CD4、抗CD8和抗CD25）、巨噬细胞（抗F4/80、抗CD11b和抗CD86）和树突状细胞（DCs）（抗CD45、抗CD3、抗CD11c和抗MHC-II）的标记物。为了检测细胞内和核内目标，根据制造商的说明使用Foxp3/转录因子染色缓冲液套装对细胞进行固定和渗透。渗透后，用针对Foxp3（识别调节性T细胞）、Granzyme B（评估CD8? T细胞细胞毒性激活）和CD206（识别M2巨噬细胞极化）的抗体对细胞进行染色。经过彻底洗涤后，使用BD FACSAria III流式细胞仪（BD Biosciences，圣何塞，CA，美国）获取染色样本。所有流式细胞术数据随后使用FlowJo软件（版本10.x，BD Biosciences）进行分析[44]。

统计分析
统计分析和数据可视化使用GraphPad Prism软件（版本8.0，圣地亚哥，CA，美国）进行。所有定量数据表示为平均值±标准差（SD）。首先使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性。对于正态分布的数据，使用非配对Student’s t检验分析两个独立组之间的统计差异，而三个或更多组之间的比较则使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey的事后检验。在数据不符合正态性假设的情况下，应用非参数等效方法（Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验）。对于纵向数据，如随时间监测的肿瘤体积和体重，使用双向ANOVA和Sidak的多重比较检验确定统计差异。

结果与讨论
L. fermentum GR-3作为PD-1免疫疗法增强剂的体外益生菌特性
最近，将益生菌与免疫疗法结合作为一种提高癌症治疗效果的策略受到了相当大的关注。在这项研究中，选择了L. fermentum GR-3作为增强PD-1阻断效果的候选者，基于其优越的功能特性。首先，系统发育分析确认了L. fermentum GR-3属于Limosilactobacillus支系（图1A）。扫描电子显微镜（SEM）显示L. fermentum GR-3具有典型的杆状形态，表面光滑，两端圆润，与乳杆菌属物种的形态特征一致（图1B）。生理学分析显示其在广泛的pH范围4.0–7.0内具有强健的生长能力，在中性pH 7.0时观察到最佳增殖（图1C）。此外，L. fermentum GR-3对胆盐表现出异常且特定的耐受性。虽然常见的生理胆盐成分，如牛胆盐和猪胆盐，几乎完全抑制了其生长（图1D–E），但该菌株对牛磺胆酸钠表现出显著的抵抗力，在0.5%和1.0%浓度下仅分别有19.6%和14.9%的生长抑制（图1F）。证明其能够在宿主消化道中存活后，L. fermentum GR-3在模拟的胃肠道条件下保持了高活力。细菌计数从3.06×10^6 CFU mL^-1增加到1.07×10^7 CFU mL^-1（在模拟胃液pH 2.8中），并在模拟肠液pH 8.0中持续为1.02×10^7 CFU mL^-1（图1G）。为了评估其抗氧化潜力，我们将L. fermentum GR-3与几种实验室保存的菌株进行了比较。L. fermentum GR-3表现出最高的总抗氧化能力（T-AOC）和DPPH自由基清除效率（图1H–I），突显了其减轻氧化应激的强大能力。总的来说，这种对恶劣胃肠道条件（酸和特定胆盐）的抵抗力，加上优越的基线抗氧化活性，有力支持了将L. fermentum GR-3作为癌症免疫疗法的强大益生菌增强剂的合理性。

图1
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
L. fermentum GR-3的鉴定和体外益生菌特性。(A) 基于16S rRNA的系统发育树。(B) 扫描电子显微镜（SEM）形态（比例尺=3 μm）。(C) 在pH 2.0–7.0范围内的生长动力学。(D–F) 对特定胆盐的耐受性：牛胆盐（D）、猪胆盐（E）和牛磺胆酸钠（F）在指定浓度下。(G) 在模拟胃液（pH 2.8）和肠液（pH 8.0）中12小时的存活能力。(H, I) 比较抗氧化能力：T-AOC（H）和DPPH自由基清除效率（I）在筛选的菌株中。数据为平均值±标准差。*p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001（t检验或ANOVA）。不同的小写字母表示通过Duncan检验在单因素ANOVA中具有显著差异（p < 0.05）。

最近的研究表明，某些益生菌可以增强PD-1阻断疗法的效果。例如，Akkermansia muciniphila通过促进CD8+ T细胞浸润和减少免疫抑制性Tregs来提高抗PD-1抗体疗法的效果[45]。Bifidobacterium breve和免疫检查点抑制剂在临床试验中显示出改善的无进展生存率[46]。一个关键的转化挑战是益生菌是否能够承受人类胃肠道的恶劣和多变条件。胃肠道存在显著的生理屏障，胃的pH值低至1.5—3.5，小肠和结肠的pH值分别为6.0—7.4和5.7—6.8。同时，小肠中的胆盐浓度从0.2%变化到2%[47, 48]。在这项研究中，L. fermentum GR-3在模拟的胃肠道条件下存活下来，在pH 3.0时表现出强健的生长，并在0.5%牛磺胆酸钠暴露下保持高活力。这种能力超过了常用的益生菌菌株。例如，L. rhamnosus GG的存活率仅为约40%，Bifidobacterium longum在pH 3.0时仅保持30%的活力，而L. plantarum在1%胆盐浓度下的存活率降至25%[49,50,51]。此外，L. fermentum GR-3在所有筛选的菌株中表现出最高的总抗氧化能力和DPPH自由基清除活性，进一步支持了其生理上的稳健性。抗氧化活性益生菌已被证明可以增强黏膜防御并减少氧化应激引起的免疫抑制，这可能有助于改善对PD-1阻断的反应[52, 53]。这些发现强调了L. fermentum GR-3在应对环境压力方面的卓越能力，为其在癌症免疫疗法中的潜在应用奠定了基础。

L. fermentum GR-3在体内协同增强PD-1阻断的促凋亡和抗肿瘤效果
根据图2A所示的实验方案，在C57BL/6小鼠中建立了皮下MC38肿瘤。治疗干预从第0天开始，当结节达到大约50 mm3的平均体积时（图2B）。值得注意的是，还包括了一个接受口服L. fermentum GR-3单治疗的独立组，以评估其基线效果；与未经治疗的肿瘤组相比，它显示出轻微但统计上不显著的肿瘤抑制趋势（肿瘤对照组：1.94 ± 0.49 g vs. GR-3：1.48 ± 0.48 g），证实了强大的效果需要与免疫疗法的协同作用（图S1）。通过持续监测体重来评估全身毒性。到第16天，未经治疗的肿瘤组和抗PD-1单治疗（PD1）组分别经历了12.6%和10.1%的显著体重损失，而健康对照组（CK）小鼠则没有（p < 0.01）。相比之下，接受联合治疗（PD1/GR-3）的肿瘤携带小鼠保持了最稳定的体重，仅减少了6.4%，表明这种协同疗法的极佳耐受性（图2C）。肿瘤生长动力学（图2D）显示PD1/GR-3组合组表现出最显著的肿瘤抑制效果。该组的最终平均肿瘤体积限制在210.8 ± 96.1 mm3，相对于未经治疗的肿瘤组减少了51.7%，相对于PD1单治疗额外减少了37.1%。这些宏观观察结果得到了最终切除肿瘤重量的高度证实（图2E和F）。使用TUNEL染色评估了肿瘤内的凋亡机制（图2G）。在肿瘤微环境中，未经治疗的肿瘤组表现出最小的自发凋亡活性（8.2 ± 1.2%）。虽然PD1阻断单独使用适度提高了凋亡率至26.4 ± 2.9%，但L. fermentum GR-3的联合使用显著增强了这一效果，使全球凋亡水平达到最高（52.5 ± 3.8%，p < 0.0001）（图2H）。这些临床可转化的发现提供了有力的体内证据，表明口服L. fermentum GR-3与抗PD-1疗法协同作用，增强了强大的抗肿瘤和促凋亡反应。

图2
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L. fermentum GR-3与抗PD-1疗法协同作用，在体内抑制肿瘤生长并诱导凋亡。(A) 实验设计示意图。(B) 皮下肿瘤的测量。(C) 16天治疗期间的体重变化。(D) 肿瘤生长曲线。(E) 第16天切除肿瘤的宏观图像（比例尺=1 cm）。(F) 最终肿瘤重量。(G) 肿瘤切片的代表性TUNEL染色（TUNEL，红色；DAPI，蓝色）。(H) TUNEL阳性细胞的量化。数据为平均值±标准差（每组n = 6）。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001（单因素或双因素ANOVA）。

癌症进展是由恶性细胞的不受控制的增殖和侵袭驱动的，这会损害健康组织并影响正常的生理功能[54]。癌细胞的快速增殖消耗了宿主的代谢资源，导致全身能量耗尽、免疫功能障碍和逐渐的体重下降[55]。最近的进展强调了肠道微生物群在调节癌症治疗效果中的作用，益生菌补充作为一种提高治疗效果的有希望的策略。例如，具有更高肠道微生物群多样性的患者对免疫疗法的反应大约好30%[56]。同样，平衡的肠道微生物群与30%的肿瘤控制改善相关[57]。这些观察结果支持了我们的假设，即特定的益生菌可以增强PD-1阻断疗法。在结直肠癌模型中，体重下降是肿瘤进展和全身代谢紊乱的关键指标[58]。接受PD-1单治疗的患者通常会经历5–15%的体重下降[59]。值得注意的是，我们的PD1/GR3联合疗法显著减轻了癌症引起的体重下降至6.4%，与先前研究中肿瘤携带小鼠体重改善20–25%的结果一致[24]。L. fermentum GR-3单治疗本身并没有显著影响体重或肿瘤生长，表明其单独的抗肿瘤活性有限。研究表明，长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）与抗PD-1疗法联合使用可显著降低结直肠癌的肿瘤体积约40%，而植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）与免疫疗法结合使用则可使黑色素瘤模型的肿瘤体积减少45% [60]。值得注意的是，在我们的模型中，发酵乳杆菌（L. fermentum GR-3）与抗PD-1抗体的组合实现了51.7%的肿瘤体积减少，这一效果超过了单独使用抗PD-1抗体或之前报道的益生菌组合，突显了它们之间的强大协同作用。发酵乳杆菌GR-3单独使用时缺乏抗肿瘤活性，这表明它通过需要同时抑制免疫检查点的机制来增强PD-1阻断作用。这一解释进一步得到了PD1/GR3组中肿瘤细胞凋亡显著增加的支持 [61]。综上所述，这些结果表明发酵乳杆菌GR-3并不直接发挥细胞毒性作用，而是作为免疫调节增强剂，放大PD-1介导的抗肿瘤免疫效应，使其成为免疫检查点疗法的新组合伙伴。

为了探究PD1/GR3组合的增强抗肿瘤效果，我们使用流式细胞术（flow cytometry）分析了肿瘤微环境（TME）中的先天性和适应性免疫特征（图3）。适应性淋巴细胞分析显示，虽然PD1组的CD4?/CD8? T细胞比例略低于肿瘤组（0.96对比1.55），但PD1/GR3组则表现出更明显的向细胞毒性表型的转变，该比例进一步降至0.026（p?
图3：PD1/GR3组合的增强抗肿瘤效果。代表性流式细胞术图表及相应的肿瘤内免疫细胞群体定量分析：(A, B) CD4?与CD8? T细胞的比率；(C, D) 调节性T细胞（Tregs，CD25?Foxp3?）；(E, F) Granzyme B? (GzmB?) CD8? T细胞；(G, H) 成熟的树突状细胞（DCs，MHC-II?）；(I–K) 肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化，包括代表性图表(I)以及促炎型M1样（CD86?）和免疫抑制型M2样（CD206?）TAMs的比例。数据为平均值±标准差（每组n=X）。*p?
免疫检查点阻断（ICB）的临床效果常常受到肿瘤微环境免疫抑制性质的制约，这种抑制主要由耐受性髓系细胞和Tregs维持 [62]。我们的表型分析表明，发酵乳杆菌GR-3作为免疫敏化剂，能够连接先天性和适应性抗肿瘤免疫，从而缓解ICB的耐药性。重要的是，肿瘤内的髓系细胞经历了功能上的显著重塑。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）重新极化为免疫刺激型M1样表型，同时树突状细胞（DCs）的成熟度也得到增强，共同促进了有利于抗肿瘤免疫的TME环境 [62]。那么，肠道益生菌是如何远程指导局部TME的呢？最近的研究表明，肠道共生菌与远处肿瘤之间的通信主要依赖于系统循环信号，尤其是微生物衍生的代谢物，这些代谢物可以通过表观遗传或代谢途径重新编程浸润的髓系细胞 [15, 63]。因此，我们模型中观察到的M1巨噬细胞和DC的显著激活强烈暗示发酵乳杆菌GR-3的定植可能引发了系统性的免疫代谢转变。激活先天免疫系统是有效ICB治疗的先决条件；功能性的DC对于肿瘤抗原的交叉呈递至关重要，而M1巨噬细胞会分泌趋化因子以招募效应T细胞 [64]。这种TME的重构与PD-1阻断形成了一个有利的前馈循环。通过逆转髓系细胞驱动的免疫抑制，发酵乳杆菌GR-3可能限制了Tregs的生存环境，这与PD1/GR3组中观察到的Tregs浸润减少相一致。通过PD-1阻断缓解Tregs介导的抑制并恢复T细胞功能，最终促进了CD8? T细胞的扩增和激活，这一点通过Granzyme B产量的增加得到了证实。这与先前的研究结果一致，即通过调节如双歧杆菌或阿克曼氏菌（Akkermansia）等肠道微生物群可以增强抗PD-1效果 [22]。总之，我们的发现表明，口服发酵乳杆菌GR-3可以通过系统性地破坏肿瘤相关的免疫耐受性，来缓解PD-1单药治疗的固有局限性。

发酵乳杆菌GR-3通过增强PD-1阻断作用，全面重塑了肿瘤微环境。代表性流式细胞术图表及相应的肿瘤内免疫细胞群体定量分析：(A, B) CD4?与CD8? T细胞的比率；(C, D) 调节性T细胞（Tregs，CD25?Foxp3?）；(E, F) Granzyme B? (GzmB?) CD8? T细胞；(G, H) 成熟的树突状细胞（DCs，MHC-II?）；(I–K) 肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的极化，包括代表性图表(I)以及促炎型M1样（CD86?）和免疫抑制型M2样（CD206?）TAMs的比例。数据为平均值±标准差（每组n=X）。*p?
免疫检查点阻断（ICB）的临床效果常常受到肿瘤微环境免疫抑制性质的制约，这种抑制主要由耐受性髓系细胞和Tregs维持 [62]。我们的表型分析表明，发酵乳杆菌GR-3作为免疫敏化剂，能够连接先天性和适应性抗肿瘤免疫，从而缓解ICB的耐药性。重要的是，肿瘤内的髓系细胞经历了功能上的显著重塑。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）重新极化为免疫刺激型M1样表型，同时树突状细胞（DCs）的成熟度也得到增强，共同促进了有利于抗肿瘤免疫的TME环境 [62]。那么，肠道益生菌是如何远程指导局部TME的呢？最近的研究表明，肠道共生菌与远处肿瘤之间的通信主要依赖于系统循环信号，尤其是微生物衍生的代谢物，这些代谢物可以通过表观遗传或代谢途径重新编程浸润的髓系细胞 [15, 63]。因此，我们模型中观察到的M1巨噬细胞和DC的显著激活强烈暗示发酵乳杆菌GR-3的定植可能引发了系统性的免疫代谢转变。激活先天免疫系统是有效ICB治疗的先决条件；功能性的DC对于肿瘤抗原的交叉呈递至关重要，而M1巨噬细胞会分泌趋化因子以招募效应T细胞 [64]。这种TME的重构与PD-1阻断形成了一个有利的前馈循环。通过逆转髓系细胞驱动的免疫抑制，发酵乳杆菌GR-3可能限制了Tregs的生存环境，这与PD1/GR3组中观察到的Tregs浸润减少相一致。通过PD-1阻断缓解Tregs介导的抑制并恢复T细胞功能，最终促进了CD8? T细胞的扩增和激活，这一点通过Granzyme B产量的增加得到了证实。这与先前的研究结果一致，即通过调节如双歧杆菌或阿克曼氏菌等肠道微生物群可以增强抗PD-1效果 [22]。总之，我们的发现表明，口服发酵乳杆菌GR-3可以通过系统性地破坏肿瘤相关的免疫耐受性，来缓解PD-1单药治疗的固有局限性。

为了确定局部微生物特征是否与肿瘤微环境（TME）内的免疫激活相关，我们对肿瘤组织进行了16S rRNA测序（图4）。虽然α多样性（Shannon指数）在各组间没有变化（p?=?0.29），但β多样性分析（NMDS）显示微生物群落特征发生了显著变化（PERMANOVA R2?=?0.56，p?=?0.026），表明PD1/GR-3联合疗法改变了肿瘤内的微生物DNA组成（图4A和B）。维恩图分析进一步展示了治疗驱动的OTU分布模式（图4C）。分类学分析突出了明显的组成变化。在门水平上，假单胞菌门（Pseudomonadota，以前称为变形菌门）的特征在PD1治疗后显著增加，从肿瘤对照组的18.0%上升到PD1单药组的52.0%，并在PD1/GR-3组合组中达到峰值69.0%（图4D）。相反，杆菌门（Bacillota，以前称为厚壁菌门）和放线菌门（Actinomycetota）的特征在组合组中几乎消失。属水平分析指出，这种变化主要是由沙门氏菌属（Salmonella）相关OTUs的显著富集驱动的。在未经治疗的肿瘤中，沙门氏菌DNA特征仅占6.0%，而在PD1单药组和PD1/GR-3组中分别上升至40.0%和65.0%（图4E）。重要的是，Spearman相关性分析显示这些检测到的微生物特征与局部免疫状态之间存在紧密联系。促炎性细胞因子（TNF-α，IFN-γ）与假单胞菌门尤其是沙门氏菌属呈强正相关，而与杆菌门呈负相关（图4F，G）。这些发现表明，PD1/GR-3疗法诱导了肿瘤相关微生物特征的特定改变，这与TME的免疫激活状态密切相关。

图4：发酵乳杆菌GR-3治疗后肿瘤内微生物群落的变化。(A) 通过Shannon指数评估的α多样性；(B) 基于Bray–Curtis距离的非度量多维缩放（NMDS）可视化的β多样性；(C) 维恩图显示各组间共享和独特的操作分类单元（OTUs）；(D, E) 主要微生物类群在门（D）和属（E）水平的相对丰度；(F, G) Spearman相关性热图评估肿瘤内细胞因子水平与特定微生物类群在门（F）和属（G）水平上的关联。最近的研究越来越重视肿瘤内低生物量微生物特征的存在，这些特征可以影响局部免疫状态和治疗反应 [65, 66]。在我们的研究中，我们观察到PD1治疗后的肿瘤内微生物DNA特征发生了显著变化，表现为假单胞菌门（主要是沙门氏菌）的显著富集和杆菌门的减少，这与先前的肿瘤内微生物组研究结果一致 [67]。值得注意的是，PD1/GR-3治疗组中沙门氏菌特征的积累不一定反映活跃的局部定植。相反，这种富集可能与我们在流式细胞术数据中观察到的免疫重塑功能相关。联合疗法显著激活了肿瘤浸润的树突状细胞，并使巨噬细胞极化为高度吞噬性的M1表型。这些激活的局部吞噬细胞可能会吞噬并积累来自肠道屏障泄漏的细菌成分（如DNA或脂多糖），这是晚期肿瘤和系统性免疫治疗的常见后果。无论这些革兰氏阴性细菌成分的存活能力如何，它们的存在都作为强效的病原体相关分子模式（PAMPs）。越来越多的证据表明，变形菌门衍生的成分可以通过提供强烈的免疫刺激信号来重新编程抗肿瘤免疫，持续激活局部髓系细胞并维持促炎性细胞因子的产生 [68]。这与临床前模型一致，在这些模型中，减弱的沙门氏菌衍生物或其分离的结构成分可以增强局部TNF-α和IFN-γ的产生，从而增强实体瘤的控制 [69, 70]。在这种情况下，我们观察到的沙门氏菌特征与肿瘤内IFN-γ/TNF-α水平之间的强正相关表明了一种双向交流：治疗诱导的炎症性TME可能有利于这些特定微生物抗原的积累，进而通过增强吞噬作用维持“热”肿瘤状态。

在研究下游免疫变化之前，我们首先确认了口服益生菌在胃肠道中的成功定植。定量PCR（qPCR）分析显示，接受发酵乳杆菌GR-3补充的小鼠粪便中，发酵乳杆菌GR-3相对于总细菌的比例显著增加（GR-3组和PD1/GR-3组相比CK组，p?
图5：发酵乳杆菌GR-3调节肠道微生物群组成并增强肠道短链脂肪酸（SCFA）的产生。(A) 肠道中发酵乳杆菌GR-3相对于总细菌的相对丰度；(B) 肠道微生物群在OTU水平的主成分分析（PCA）；(C) 肠道微生物群在属水平的分类组成；(D–I) 肠道SCFAs的靶向定量（μM/g）：乙酸（D）、丙酸（E）、丁酸（F）、异丁酸（G）和异戊酸（H）、戊酸（I）。数据为平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；ns，无显著性（单因素方差分析）。免疫检查点阻断（ICB）的临床疗效，包括抗PD-1疗法，经常受到肿瘤诱导的全身性免疫抑制和肠道菌群失调的阻碍[71]。针对微生物组干预的一个基本前提是成功植入所使用的菌株。我们的qPCR分析证实，L. fermentum GR-3成功定植于小鼠胃肠道，为后续的生态变化奠定了稳定基础。相应地，我们的16S rRNA测序显示，未经治疗的肿瘤携带小鼠表现出严重的菌群失调。其特征是有益共生菌（如拟杆菌和乳酸菌）的减少，以及机会性病原体的增加。例如，我们观察到普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）的水平升高，该菌科常与慢性黏膜炎症相关，以及Saccharimonas属细菌的增加，后者已被证实与结直肠癌的进展有关[72, 73]。重要的是，PD1/GR-3联合疗法积极对抗了这种肿瘤诱导的菌群失调，使微生物群结构恢复到健康基线。虽然这些组成上的改善表明了微生物的恢复，但将肠道腔与肿瘤微环境联系起来的真正机制在于功能性微生物代谢物。PD1/GR-3治疗显著扩增的菌类，特别是拟杆菌和Lachnospiraceae家族成员，是哺乳动物肠道中著名的短链脂肪酸（SCFA）生产者[74,75,76]。具体来说，Lachnospiraceae是主要的丁酸生产者。我们对SCFA的定量分析有力地验证了这一功能转化。我们发现，联合疗法减轻了肿瘤组中观察到的SCFA减少，显著恢复了关键的免疫调节代谢物，包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFA是众所周知的宿主免疫调节剂。它们增强肠道上皮屏障，防止全身性炎症，并直接调节白细胞功能[77, 78]。SCFA，尤其是丁酸和丙酸，可以抑制组蛋白去乙酰化酶（HDACs），从而在表观遗传层面上促进效应T细胞的分化，同时直接为CD8? T细胞的代谢适应性和细胞毒性提供能量。因此，肠道SCFA池的恢复为我们在模型中观察到的肿瘤内免疫激活增强提供了有力的机制解释（例如，Granzyme B? CD8? T细胞的增加）。最近的临床和临床前研究表明，使用益生菌（如双歧杆菌）调节微生物组可以通过增强抗肿瘤免疫力来提高抗PD-L1疗法的疗效[79, 80]。与这些里程碑式的发现一致，我们的数据表明L. fermentum GR-3是一种强效的免疫调节益生菌。通过建立稳定的定植、恢复产生SCFA的菌群以及提供有益的SCFA池，L. fermentum GR-3有效地塑造了微生物群-代谢物-免疫轴。最终，这种有针对性的生态和代谢平衡的恢复减轻了PD-1单疗法的固有局限性，将微生物组正常化作为实现协同抗肿瘤疗效的核心支柱。

L. fermentum GR-3不仅增强了肠道屏障，还减轻了全身毒性，同时放大了局部抗肿瘤炎症。全身性免疫相关不良事件（irAEs），特别是免疫介导的结肠炎和全身性炎症，仍然是PD-1阻断疗法的主要临床障碍。为了评估联合疗法的全身安全性和功能分区，我们评估了肠道屏障完整性和多组织免疫谱型。我们首先检查了治疗引起的微生物变化是否影响了肠道屏障功能。使用FITC-葡聚糖（FD4）进行的体内评估显示，肿瘤携带小鼠的肠道通透性比CK组更高，而PD1/GR-3联合疗法有效地逆转了这一缺陷（p<0.05）（图6A）。与这种宏观屏障的恢复一致，PD1/GR-3组中关键的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的结肠mRNA表达水平显著上调（p<0.01至p<0.0001）（图6D-F）。此外，与晚期恶性肿瘤相关的全身性氧化应激也得到了缓解。PD1/GR-3疗法提高了总抗氧化能力（T-AOC）（p<0.05），并显著抑制了循环系统中丙二醛（MDA）的积累（p<0.001）（图6B, C）。至关重要的是，这种强化的肠道屏障转化为全身性免疫安全。虽然肿瘤内细胞毒性标志物（如Granzyme B）的高表达对于疗效至关重要，但它们在外周组织中的异常过度激活会导致自身免疫毒性。实际上，肿瘤携带小鼠表现出全身性炎症状态，其特征是血清中TNF-α和IFN-γ水平的升高（图6H）。虽然PD1单疗法未能降低血清TNF-α水平，并在脾脏中诱导了GzmB mRNA的严重异常升高（表明全身性免疫过度激活），但L. fermentum GR-3的整合成功减轻了这些外周异常（图6H, I）。PD1/GR-3联合疗法降低了血清TNF-α水平，并将脾脏中的GzmB表达恢复到健康基线水平。重要的是，所有治疗组中结肠组织中与免疫相关的基因（Foxp3和GzmB）的相对mRNA表达接近健康基线（1.0）（图6G, I），表明口服L. fermentum GR-3不会在局部引发结肠过度激活或Treg介导的免疫抑制。值得注意的是，这种外周免疫调节并未损害局部抗肿瘤疗效。与平静的脾脏和血清形成鲜明对比的是，PD1/GR-3组中肿瘤内的促炎细胞因子TNF-α表达显著增强（p<0.01）（图6J）。同时观察到IL-10的局部增加，这可能反映了高度活跃的肿瘤微环境中的调节反馈机制。这些发现共同表明，L. fermentum GR-3成功地将全身性自身免疫毒性与局部抗肿瘤疗效分离。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

联合疗法恢复了肠道屏障完整性，减轻了氧化应激，并调节了全身性和局部免疫反应。（A）通过血清FITC-葡聚糖4 kDa（FD4）水平评估肠道通透性。（B, C）通过总抗氧化能力（T-AOC）（B）和丙二醛（MDA）（C）浓度评估全身性氧化状态。（D–F）结肠中紧密连接基因的相对mRNA表达：Zo-1（D）、Occludin（E）和Claudin-1（F）。（G, I）脾脏和结肠中Foxp3（G）和GzmB（I）的相对mRNA表达。（H, J）通过ELISA确定的血清（H）和肿瘤微环境（J）中的细胞因子谱型。数据为平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；ns，无显著性（单因素方差分析）。水平虚线（y=1.0）代表健康对照组（CK）的标准化基线表达。

在免疫检查点阻断（ICB）的临床应用中，一个主要挑战是免疫相关不良事件（irAEs）的频繁发生。针对PD-1/PD-L1轴的疗法常常会破坏外周耐受性。虽然在肿瘤内释放CD8? T细胞的细胞毒性（例如GzmB表达）是非常理想的，但这些细胞在健康外周组织中的异位过度激活会导致全身性炎症和免疫介导的结肠炎。这些毒性常常需要使用全身性皮质类固醇，这可能会无意中削弱抗肿瘤疗效[81, 82]。因此，识别能够将局部抗肿瘤疗效与全身性毒性分离的组合策略具有重要的临床意义。在这项研究中，口服L. fermentum GR-3实现了这种分区的免疫反应。我们研究中观察到的全身性保护主要源于肠道屏障的恢复。晚期恶性肿瘤和ICB疗法会导致肠道通透性增加（“肠漏”），促进共生细菌和促炎内毒素进入全身循环[83, 84]。这会引发全身性氧化应激和炎症级联反应。我们的体内功能测定和转录数据明确表明，L. fermentum GR-3降低了肠道通透性并上调了关键的紧密连接蛋白。这种增强屏障的特性是特定有益乳酸菌菌株的公认特征[85]。通过物理封闭肠道屏障，L. fermentum GR-3限制了炎症触发因子的异常全身传播。因此，这从根本上减轻了全身性氧化应激（MDA）并平息了异常的脾脏过度激活（降低了PD-1单疗法引起的严重GzmB升高）。此外，结肠组织中GzmB和Foxp3的稳定基线表达——与健康个体相当——表明L. fermentum GR-3积极维持了结肠免疫稳态，防止了ICB相关的自身免疫组织损伤，同时避免了不必要的Treg积累。值得注意的是，这种严格的全身性平息并未妨碍局部抗肿瘤反应。相反，PD1/GR-3组中的肿瘤内TNF-α水平显著增强。我们推测，这种空间上的二分法——全身性耐受性与局部细胞毒性——是由肠道来源的短链脂肪酸（SCFAs）的恢复所驱动的。新兴证据表明，循环中的SCFAs，如丁酸，可以特异性地重新编程肿瘤浸润CD8? T细胞的代谢和表观遗传状态，增强其局部效应功能，而不会引发非特异性的外周炎症[77, 86]。虽然先进的临床策略通常依赖于预防性细胞因子阻断来分离毒性和疗效[87]，但我们的发现强调了L. fermentum GR-3作为一种多方面的生物治疗剂，能够增强肠道屏障，减轻全身性irAEs，并通过微生物群-代谢物轴协调高度局部化的抗肿瘤免疫反应。

结论：这项研究表明，食品来源的益生菌L. fermentum GR-3通过协调调节微生物群-代谢物-免疫轴，协同增强了小鼠结直肠癌模型中抗PD-1免疫疗法的疗效。L. fermentum GR-3不是作为直接的细胞毒性剂起作用，而是作为一种口服免疫调节剂，重塑宿主宏观环境，显著增强了PD-1阻断介导的肿瘤消退。从机制上讲，L. fermentum GR-3的定植重塑了肠道微生物群并丰富了肠道短链脂肪酸（SCFA）池。这种有针对性的微生物-代谢变化增强了黏膜屏障的完整性，并有效减轻了全身性氧化应激。因此，这种肠道驱动的生理调节转化为肿瘤微环境（TME）的强有力重新编程。联合疗法通过抑制调节性T细胞，同时刺激局部抗原呈递细胞（M1巨噬细胞和树突状细胞）来促进强效的CD8?细胞毒性T细胞反应，从而减轻了肿瘤内的免疫耐受性。至关重要的是，协同的PD1/GR-3疗法协调了空间分区的免疫动态。它通过最大化肿瘤内的局部免疫激活，同时积极抑制外周炎症细胞因子级联反应，成功地将疗效与毒性分离，从而实现了非常有利的治疗指数。此外，观察到的肿瘤内微生物群的重新编程突显了肠道-肿瘤微生物之间的复杂相互作用，表明局部微生物特征也积极参与了治疗诱导的免疫反应。从转化角度来看，L. fermentum GR-3提供了一种高度可行且安全的临床应用策略。它来源于传统发酵食品，具有公认的安全性（GRAS）地位，并且具有可扩展的生产基础设施，可能绕过了与新分离的人类来源共生菌株相关的复杂监管瓶颈。总体而言，这项研究为L. fermentum GR-3作为微生物组靶向协同生物治疗剂的应用提供了全面的机制框架。尽管未来的临床研究和泛癌症模型对于定义其更广泛的适用性是必要的，但我们的发现牢固地将食品级微生物调节定位为一种安全、有效且可快速转化的策略，以优化下一代精准免疫疗法。