收获方法对Isochrysis galbana和Phaeodactylum tricornutum提取物的生物量产量及抗菌活性的影响

《Biotechnology Letters》：Influence of harvesting method on biomass yield and antimicrobial activity of Isochrysis galbana and Phaeodactylum tricornutum extracts

　　摘要
微藻被认为是高价值生物活性化合物的有希望的来源，这些化合物在农业和制药工业中具有广泛应用；然而，传统的生物质收获方法可能会降低产量、损害生物活性并增加加工成本。本研究旨在评估电絮凝法对微藻生物质回收和抗菌活性保留的影响，并将其与离心法进行比较。两种微藻的培养物分别采用电絮凝法和离心法进行收获，随后进行生物质定量和生物活性化合物的提取。通过针对临床和工业相关细菌菌株评估提取物的抗菌活性，从而对收获效率和生物活性保留情况进行比较。结果表明，对于这两种微藻物种，电絮凝法的生物质回收率均高于离心法。此外，在测试条件下，从电絮凝法获得的提取物表现出更高的抗菌活性，表明在收获过程中生物活性化合物得到了更好的保留。这些发现表明，电絮凝法是一种清洁、高效且可持续的微藻生物质收获方法，在产量和抗菌活性保持方面优于传统离心法，为其在从微藻生产生物活性化合物的生物技术过程中的应用提供了支持。

引言
微藻是海洋和淡水环境中的单细胞生物，作为初级生产者通过光合作用产生氧气。它们能产生多种有价值的化合物，如酚酸，这些化合物具有多种生物活性（Kwak等人，2014年；Tan等人，2018年；Andriopoulos等人，2022年）。在水产养殖中，微藻是重要的食物来源，其高蛋白质含量使其成为非动物蛋白生产的有希望的替代品（Wang等人，2021年）。Isochrysis galbana Parke和Phaeodactylum tricornutum Bohlin在生物技术上具有很高的价值，可用于生产有机分子。它们富含多不饱和脂肪酸（PUFAs），如EPA、DHA和ARA，这些脂肪酸对人类健康至关重要，尤其是对婴儿（Adarme-vega等人，2012年；Crawford，2000年）。I. galbana还含有岩藻黄质，这是一种具有强抗氧化特性的高营养价值化合物（Kim等人，2012年；Blanco-llamero等人，2021年；Bustamam等人，2021年）。然而，获取微藻生物质是大规模生产生物化合物的主要障碍之一。这种方法可能产生较低的生物质产量，使得分离过程成本较高。虽然添加有机溶剂进行絮凝是常见的方法，但这对人类健康和环境的影响使得其在工业规模上的应用不可行（Murador等人，2019年；Tan等人，2020年）。

电絮凝法是一种高效、低成本的微藻生物质收获方法，无需使用化学物质。该方法通过氧化阳极产生金属絮凝剂，中和细胞电荷，使细胞聚集并浮到表面（Tan等人，2018年；Suparmaniam等人，2019年）。该技术已用于废水处理，并且我们的研究小组证明它能有效提高生物质产量同时保留抗氧化活性（Ramos等人，2017年，2020年）。本研究旨在展示电絮凝法在提高微藻生物质产量方面的潜力，同时不损害乙醇提取物对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的杀菌效果。

材料与方法
**微藻、生长条件及维护**
所使用的海洋微藻为I. galbana和P. tricornutum，来自巴伊亚联邦大学（UFBA）生物研究所的微藻收集库。这些菌株已在SISGEN（编号A653955）——国家遗传遗产及相关传统知识管理系统（https://sisgen.gov.br）注册，并存放在UFBA生物研究所的ALCB标本馆中，编号分别为IBL-C007（P. tricornutum）和IBLC-013（I. galbana）。培养条件包括12小时的光照周期、35 μmol光子m-2 s-1的照度、22°C的温度以及恒定的通气条件。Conway培养基（Louren?o，2006年）被用于这两种微藻；对于P. tricornutum这种硅藻，还添加了0.32 M Na2SiO3。微藻在管状光生物反应器中培养，每种菌株重复三次。每天使用Neubauer计数器监测生物质生长情况。每毫升细胞数（C）根据以下公式计算：

**收获方法**
在静止生长阶段结束时，采用两种不同的方法收获生物质：离心法（MPW-351?），以5000 rpm离心45分钟（直至所有培养物被使用完毕）；以及电絮凝法，使用19 V的恒定电流或95 W的功率处理15分钟，电极材料为铝（13，14）。初步评估了不同的电极材料（包括铜）和配置（例如厚度和孔隙率的变化），最终选择铝是因为其性能良好且不会在培养基中留下可见残留物。之后，使用冷冻干燥机（Enterprise II，Terroni?）将细胞冻干，并保存在-20°C。

**提取物制备**
解冻后，用100 mL无水乙醇提取每种菌株的2 g干生物质，涡旋混合后进行两次6分钟的超声处理（功率10%）。混合物搅拌72小时后，以5000 rpm离心5分钟，收集上清液。此过程重复进行，直至生物质脱色。提取物通过真空旋转蒸发器进行浓缩。电絮凝法获得的生物质也采用相同的处理方法。

**测试的微生物**
使用了美国典型培养物收藏库（ATCC）的五种标准菌株，其中三种为革兰氏阳性菌：Staphylococcus aureus ATCC 6598、Bacillus subtilis ATCC 6633、Bacillus cereus ATCC 0096；两种为革兰氏阴性菌：Escherichia coli ATCC 94863、Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853。所有菌株均来自André Tosello基金会的热带培养物收藏库（CCT）（https://fat.org.br），并保存在巴伊亚州萨尔瓦多市巴伊亚州立大学的第一精确与地球科学实验室。

**抗菌活性评估**
根据CLSI M2-A8标准（Karaman等人，2003年），采用圆盘扩散法评估I. galbana和P. tricornutum提取物的抗菌活性。将提取物稀释至1% DMSO，得到10 mg/mL的溶液。每种微生物的细菌悬浮液调整至0.5 McFarland浊度标准后接种到Mueller–Hinton琼脂上。无菌滤纸圆盘浸渍10 μL乙醇提取物后放置在琼脂上。24小时后测量抑制圈大小。实验重复三次，阿奇霉素（15 μg）和1% DMSO（10 μL）分别作为阳性对照和阴性对照。

**统计分析**
采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并进行Tukey事后检验，显著性水平设为p < 0.05。

**结果与讨论**
通过离心法和电絮凝法获得的两种微藻生物质提取物主要对革兰氏阳性菌表现出抗菌活性，这是首次报道I. galbana微藻对B. cereus的抗菌活性。只有P. tricornutum在离心法下对革兰氏阴性菌E. coli表现出活性。表1显示了两种收获方法所得乙醇提取物的结果。电絮凝法获得的提取物显示出更高的抑制率（44–65%），而离心法获得的提取物抑制率为21.43–40%。对于S. aureus，电絮凝法提取物的抗菌活性几乎是离心法的两倍。这一结果具有重要意义，因为它突显了收获方法对生物活性化合物保留的影响。电絮凝法似乎比离心法更能保持抗菌活性，表明在生物质回收过程中活性分子的降解较少。观察到的对临床相关细菌的抗菌活性进一步支持了这种方法的潜在应用。从室内培养中收获细胞是一个成本较高的步骤，常常阻碍藻类产品的规模化生产（Tripathi & Kumar，2017年）。在本研究中，该方法不仅提高了生物质产量，还增强了提取物的杀菌活性，这对于保持目标分子的生物活性、促进其食用和药用应用具有价值。

**结论**
抗菌活性与多不饱和脂肪酸有关。Alsenani等人（2020年）利用质谱和核磁共振（NMR）技术表征了I. galbana的乙醇提取物，鉴定出pheophytin A、二十二碳六烯酸和油酸。他们的抗菌评估显示，I. galbana提取物能有效抑制Listeria monocytogenes、S. aureus和B. subtilis，抑制圈直径为19–20 mm。Zheng等人（2005年）和Sado-Kamdem等人（2009年）研究了多不饱和脂肪酸的抗菌机制，发现这些分子通过酶抑制作用干扰细菌的脂质代谢。He等人（2019年）在P. tricornutum生物质中发现了大量的二十五碳五烯酸，Desbois等人（2008年）证明其能抑制多重耐药的S. aureus。Wang等人（2021年）报告称二十五碳五烯酸对Vibrio spp.的最低抑制浓度为18 μg/mL，显示出良好的抗菌潜力。然而，其对E. coli和P. aeruginosa的活性有限。革兰氏阴性菌由于具有富含饱和脂肪酸的细胞膜而更难处理，这限制了抗菌剂的扩散。虽然离心法效率高，但耗时较长，尤其是对于小细胞，并且能耗较高。此外，离心法还会因剪切力导致细胞损伤，降低生物活性化合物的可用性（Ramos等人，2020年）。电絮凝法结合微藻提取物的生物活性分析显示出巨大潜力，但需要进一步研究。我们的团队在这一领域取得了显著进展，证明P. tricornutum的生物质产量提高了四倍，I. galbana提高了十倍（Ramos等人，2017年，2020年）。然而，电絮凝法的抗氧化活性略低于离心法。Davoodbasha等人（2021年）发现电絮凝法对Chlorella pyrenoidosa的回收效率为95%，仅次于FeCl?絮凝法（98.5%），但后者会使培养基呈现棕色，从而影响色素提取。此外，Davoodbasha等人（2021年）指出使用盐类进行收获会增加成本。我们的研究发现，电絮凝法增强了来自海洋微藻I. galbana和P. tricornutum的乙醇提取物的杀菌活性。该技术产生的生物质对革兰氏阳性菌（包括Staphylococcus aureus）有效，具有临床意义。随着抗生素耐药性的增加，微藻成为新的化合物来源，电絮凝法提供了一种经济高效且无毒的收获方法。尽管结果是在标准化条件下进行的比较评估，但抗菌活性是在单一提取物浓度下测定的，这限制了不同收获方法之间的详细定量比较。未来的研究应包括剂量-反应分析和最低抑制浓度（MIC）的测定，以进一步表征提取物的抗菌潜力。这些发现表明电絮凝法在保持抗菌活性方面具有优势，为其在制药和食品工业中的应用提供了支持。