一种综合的分子分类系统能够识别出非肌层浸润性膀胱癌的不同预后亚群

《Functional & Integrative Genomics》：An integrated molecular classification system identifies distinct prognostic clusters of non-muscle-invasive bladder cancer

摘要
非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）的分子特征分析为临床结果和治疗反应的异质性提供了关键见解。整合现有的转录组亚型系统以消除不一致性将有助于临床应用。我们利用马尔可夫聚类算法构建了一个网络，整合了五种基于转录谱的膀胱癌分类系统，旨在建立一个综合的分子分类框架并识别不同的预后簇。我们识别出四个具有不同转录组、基因组、蛋白质组和临床特征的整合分子簇（IMC1-4）。IMC2显示出FGFR3突变的显著富集，而IMC4则主要表现出TP53的改变。根据欧洲泌尿学会（EAU）的指南，IMC1和IMC3在接受卡介苗（BCG）灌注治疗后表现出更好的无进展生存期（PFS）。利用转录谱，我们开发了一个单样本分类器，将肿瘤分类到不同的整合分子簇中。这项研究提供了一个综合分类系统，以理解NMIBC的异质性，并为临床管理、治疗靶点及临床试验监测建立了一个临床前框架。

引言
膀胱癌是全球第十大常见癌症，占所有癌症诊断的3%，每年全球新发病例数为573,278例（Sung等人，2021年）。与其他地区相比，2021年西欧的膀胱癌负担最重，其发病率（1.22×10?）、患病率（7.09×10?）和死亡率（0.48×10?）均较高（Zi等人，2024年）。根据肿瘤与肌肉层的关系，膀胱癌被分为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC）和非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）。高达20%的NMIBC患者（在不同分期和级别中有所不同）最终会进展为MIBC（Babjuk等人，2017年）。尽管NMIBC的预后通常优于MIBC，5年生存率为60%（Kamoun等人，2020年），但其累积医疗费用更高。这种差异源于预防复发和进展所需的长期、密集的监测和治疗干预（Svatek等人，2014年）。根据EAU使用WHO 2004/2016或WHO 1973分级系统（Gontero等人，2024年）的定义，NMIBC被分为低风险、中等风险、高风险和非常高风险组。高风险或非常高风险患者被认为是BCG灌注的一线治疗候选者。然而，接受膀胱内BCG免疫治疗的患者表现出异质的治疗反应（Jong等人，2023年）。膀胱内BCG灌注还与局部和全身毒性相关，发生率为73%（Sylvester等人，2003年）。此外，30%的患者因不良反应而停止或延迟治疗（Sylvester等人，2003年）。因此，准确预测个体治疗反应至关重要。此外，迫切需要替代疗法来解决全球BCG供应短缺的问题（Mostafid等人，2015年）。基于转录组分析的分子分类系统通过实现个体化的预后预测和治疗策略建议，为NMIBC的管理提供了有前景的方法。许多专家团队已经开发了适用于NMIBC的分子亚型系统（Jong等人，2023年；Sj?dahl等人，2012年；Blaveri等人，2005年；Tan等人，2019年；Dyrskj?t等人，2003年；Lindgren等人，2010年；Lindskrog等人，2021年；Marzouka等人，2018年；Mo等人，2018年；Robertson等人，2020年），并识别出具有不同临床预后的亚组。这些系统增强了我们对NMIBC在分子水平上的异质性的理解，促进了个性化治疗策略的发展（Jong等人，2023年；Lindskrog等人，2021年）。然而，这些亚型系统源自通过不同分析流程处理的独立数据集，包含不同数量的亚型，并且旨在解决不同的主要目标（表S1）。基于这些亚型系统的综合分类系统可以整合它们的多样性，揭示潜在的共性，从而有助于将其应用于临床实践。此外，分子分类在预测BCG治疗效果方面具有特别的临床意义。Erasmus亚型系统特别预测了高风险患者的BCG反应，将他们分为三个亚型，并表明BRS3亚型的患者在BCG灌注后的PFS最差（Jong等人，2023年）。然而，BCG治疗是否能够改善或未能改变特定患者群体的PFS仍不清楚。在这项研究中，我们构建了一个综合分类系统，整合了五种已发表的亚型系统，阐明了与NMIBC不同临床结果相关的转录组、基因组和蛋白质组异质性。我们的分析显示，大约31%根据EAU指南推荐接受BCG治疗的患者在治疗后PFS没有显著改善。这些发现为改进临床管理策略和识别NMIBC的潜在治疗靶点提供了关键见解。我们遵循了TITAN Guidelines 2025，以确保我们研究中AI使用的透明度。

材料与方法
整体设计
本研究遵循REMARK标准（McShane等人，2005年）进行报告。整体研究流程如图S1所示。我们收集了13个数据集（总共1602个样本）和五种亚型系统（总共24个亚型），以构建综合分子分类系统。亚型系统和数据集的详细信息分别列在表S1、表S2和补充材料1中。

转录数据准备
对于从Gene Expression Omnibus（GEO）获得的数据集，使用平台特定的注释文件（例如GPL软文件）进行了探针到基因的映射。对于EGAS00001004693（Jong等人，2023年）和EGAS00001006879（Kim等人，2010年），直接从原始出版物下载了预映射的表达矩阵。对于由多个探针代表的基因，计算了平均表达值。在极少数情况下，如果一个探针映射到多个基因，则仅保留第一个基因符号。为了实现跨平台整合，所有基因符号都被统一到GRCh38。

网络构建和整合簇确定
13个NMIBC转录组数据集（包含1602个样本）分别通过五种亚型系统的分类器被分为24个特定亚型。不同数据集中的亚型比例显示在图S2中。五种已发表的亚型系统的分类结果被合并以进行后续分析。工作流程包括两个主要步骤：网络构建和整合簇确定，完整的方法学细节在补充材料1中提供。
1. 网络构建。将多个系统的分类结果整合到一个逻辑矩阵中（亚型×样本）。计算了Cohen’s Kappa相似性矩阵D，其中D(x,y)表示亚型x和y之间的一致性。构建了一个以亚型为节点、以Kappa为权重的加权网络。
2. 整合簇确定。应用马尔可夫聚类算法（MCL）（Dongen 2008）进行聚类分析。测试了膨胀参数（I）（范围：1.4–15，步长：0.2）。对于每个I，通过1000次80%的子采样迭代评估了簇稳定性。从迭代中的共分配频率生成了一个聚类矩阵。亚型稳定性得分是根据与完整样本MCL网络一致的簇内关联频率计算的。最终选择了膨胀因子（I=3.4）和K=4的聚类（图S3）。选择这一选择的理由在补充材料1中有详细说明，并在图S3和S4中展示。

单样本分类器的构建
使用超几何检验，识别出822个代表特定IMC的核心样本（详细信息在补充材料1中）。基于两个数据集UROMOL 2020（n=251）和GSE163209（n=121），使用差异表达分析选择了候选基因。最终的分类器使用了1430个基因和在UROMOL 2020核心样本上训练的Pearson最近中心算法，实现了0.97的最佳分类准确率（图S5）。Pearson相关性对表达值的线性变换（缩放和移动）是不变的。由于我们分析的所有数据集都进行了对数转换（RNA-seq为log2(FPKM+1)，微阵列为log2转换的表达强度），因此基因之间的相对表达模式在平台和标准化方法之间基本保持不变。因此，不需要也不进行进一步标准化。所有样本都被分类到一个IMC中。IMC在数据集和输入亚型系统中的分布显示在图S6中，详细信息在表S4中提供。此外，我们分别在没有每个数据集的情况下进行了MCL聚类分析，发现聚类结果保持稳定。这种稳定性说明了不同亚型之间的内部一致性，如图S5D所示。单样本分类器作为R包在https://github.com/redmele/NMIBCClassifier上公开可用。

IMC的转录组特征分析
使用多种分析方法对IMC的转录组特征进行了表征。对于基因集富集、免疫浸润和免疫平衡分析，我们首先在每个数据集内进行了单侧Mann-Whitney U检验，将给定的IMC与其他所有样本进行比较。然后使用Stouffer的方法将结果p值汇总，得到一个组合p值。对于上皮-间质转化（EMT）和调控子活性分析，在分析之前将来自各个数据集的数据汇总，并使用双侧Fisher精确检验计算p值。这些分析的详细信息在补充材料1中提供。相应的基因列表和p值分别显示在表S3和表S5中。

生存分析和多变量Cox回归
我们合并了6个数据集（UROMOL 2020、de Jong队列A、de Jong队列B、GSE154261_73、GSE163209和GSE128959），这些数据集具有可用的PFS数据或RFS数据（n=1110）。具体来说，605名患者接受了BCG灌注治疗。进展定义为进展为肌肉浸润性或转移性膀胱癌。在没有详细风险因素信息的情况下，T1HG、T1G3或CIS的患者被分类为推荐接受BCG治疗的患者（高风险和非常高风险组），而其他患者则不是，如EAU指南所述（Gontero等人，2024年）。构建了一个按临床阶段分层的多变量时间依赖性Cox模型。临床数据的详细信息在表S7中提供。

统计分析
对于分类变量，进行了Fisher精确检验。对于连续变量，进行了Mann-Whitney U检验。对于遗传变量，计算了Benjamini-Hochberg调整后的p值，测试家族包括每个独立分析中测试的所有遗传变量，因为这些变量可能代表潜在的药物靶点或诊断生物标志物。否则，报告了未调整的p值。所有统计和生物信息学分析都是使用R（v 4.4.1）进行的。

结果
综合分子分类系统识别出四个IMC
我们收集了13个膀胱癌数据集（n=1601名患者），如表S2所述，以及五种已发表的NMIBC分子亚型系统（总共24个亚型）（Erasmus（Jong等人，2023年）、UROMOL21（Lindskrog等人，2021年）、Chicago（Robertson等人，2020年）以及NMIBC和MIBC（Baylor（Mo等人，2018年）和Lund（Marzouka等人，2018年））。使用已发表的分类器，将每个数据集的样本分别分配到特定的亚型。随后，将亚型结果汇总到一个矩阵中，并使用马尔可夫聚类算法（MCL）开发了一个NMIBC的整合亚型系统。整体设计如图S1所示。我们识别出四个整合分子簇：IMC1、IMC2、IMC3和IMC4，分别包含八个、七个、五个和四个已发表的亚型（图1A）。IMC2构成了最大的簇（39.3%），而IMC3的比例相当（39.1%）。IMC4代表了最小的簇（8.1%）。观察到IMC之间已发表亚型的分布不同（图1B和C）。选择IMC的理由在“方法”部分有详细说明。

图1
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
整合分子分类系统的网络以及IMC与五种已发表亚型系统之间的关联。（A）IMC的网络。四个IMC被包含在虚线矩形内。每个节点代表五个已发表的亚型系统中的一个亚型（用不同的颜色标记）。节点的大小与属于相应亚型的总样本数量成正比。边的宽度与两个亚型之间的Cohen’s Kappa得分相关。（B）直方图显示了五个已发表的亚型系统在三个IMC中的比例。样本使用相应的单样本分类器被分类为五个已发表的亚型和一个IMC。（C）输入亚型和IMC的每个样本的分布。亚型或簇用不同的颜色标记。样本按照IMC的顺序排列。UroA-Prog = Urothelial-like A的进展版本；Uro = Urothelial-like；Inf = Infiltrated；Ba/Sq = Basal/Squamous；GU = Genomically Unstable；Mes-like = Mesenchymal-like；Sc/NE-like = Small-cell/Neuroendocine-like；T1-Inflam = T1-Inflamed；T1-LumGU = T1-Luminal Genomically Unstable；T1-TLum = T1-True Luminals。

我们分析了转录组数据，并使用MSigDB中的特征进行了基因集变异分析（GSEA）。结果显示IMC1中存在高水平的免疫浸润，干扰素γ反应、炎症反应、补体、IL6-JAK-STAT3和IL2-STAT5信号通路的相关基因过表达。此外，IMC1表现出向上皮-间充质转化的倾向和/或更强的成纤维细胞浸润，这与图2B的特征一致，表现为分化标记物（例如uroplakins）下调和癌干细胞标记物上调。为了验证这些发现，进行了额外的EMT分析，如图S7B所示。这些结果表明整个IMC1群体表现出间充质倾向。然而，其余三个IMC的免疫活性相对较弱。IMC3和IMC4富集了与增殖过程相关的特征（图2A）。两者都表现出E2F靶点和G2M检查点的更高表达。具体来说，IMC3中观察到MYC靶点的上调，而IMC4中的有丝分裂纺锤体更为活跃。此外，IMC4表现出DNA损伤和高DNA修复活性，同时TP53通路的活性较低。IMC2在增殖和DNA修复方面的表现与IMC3和IMC4相反，但都具有低免疫浸润的共同特征。

图2的替代文本可能是使用AI生成的。

IMC的转录组特征。比较是一个簇与所有其他簇。 （A）热图显示了从MSigDB中选定的特征的基因集富集分析。完整结果显示在图S7A中。 （B）热图显示了四个IMC中临床相关基因的表达情况，呈现了Stouffer组合p值。工作流程与A中的类似。 （C-D）肿瘤免疫微环境特征的热图。使用了两种“方法”，MCPcounter和ESTIMATE分别分析每个数据集，并呈现了Stouffer组合p值。 （E）热图显示了NMIBC预后生物标志物的调控子活性状态差异。对合并的调控子状态数据（激活或失活）进行了Fisher精确检验，并呈现了Stouffer组合p值。 FT = FGFR3靶向治疗；CT = 化疗；RT = 放疗；ICI = 免疫检查点抑制剂。

接下来，仔细选择了NMIBC的临床相关特征并在各IMC之间进行了比较（图2B）。成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）共表达基因在IMC2中强烈激活，表明IMC2可能对FGFR3靶向治疗有反应，值得进一步研究。IMC4和IMC3的特点是早期细胞周期和缺氧相关基因下调，晚期细胞周期和DNA复制相关基因上调，表明通过膀胱内化疗或放疗可以改善预后（Gabrielson等人2023年，Horsman和Overgaard 2016年，Pawlik和Keyomarsi 2004年）。对于IMC1，发现免疫检查点基因（PD-1和PD-L1）过表达以及高度免疫浸润的微环境（图2C和D以及S7C-S7F），这突显了其作为免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的潜在目标。然而，先前的研究表明，激活的成纤维细胞TGF-β会减弱肿瘤对PD-L1阻断的反应（Mariathasan等人2018年）。为了解决这个问题，我们构建了一个线性模型来预测CD8效应子特征得分和泛成纤维细胞TGF-β反应特征（F-TBRS）以及基于计算残差的EMT-基质之间的平衡（Rose等人2021年）（图S8A）。值得注意的是，较高的F-TBRS和EMT-基质残差与较差的ICI反应相关（Rose等人2021年），在IMC1中尤为明显（图S8B）。因此，结合抗TGF-β和ICI的潜在益处值得进一步研究（Mariathasan等人2018年，Gulley等人2022年）。对三个簇之间的进展和CIS评分的分析显示，IMC2的评分最低（图S7G），表明IMC2的预后较好。

为了阐明IMC之间的转录组差异，我们分析了与NMIBC预后相关的基因网络（Olislagers等人2025年）、膀胱癌相关转录因子（Lindskrog等人2021年，Robertson等人2017年）和染色质重塑调节因子（Lindskrog等人2021年）。在不同IMC之间观察到了不同的调控子活性模式（图2E、S7H和S7I）。关于预后生物标志物的整体信息由Olislagers等人总结（Olislagers等人2025年）。FGFR3的上调与良好的无进展生存（PFS）相关，在IMC2中占主导地位，表明预后较好。其他与进展相关的生物标志物在IMC1、IMC3和IMC4中的表达程度不同。例如，E2F1、CCNE1、FOXM1、CENPF、DHCR24和COL1A1在IMC4中高度表达。它们的过表达与进展的风险比（HR）升高相关（Olislagers等人2025年）。对20个膀胱癌相关转录因子的分析显示，STAT3、RARB、PGR、HIF1A、FGFR1和ESR1在IMC1中的调控子活性更强，而IMC2与高TP63、RXRA、RARG和AR活性相关。IMC3和IMC4观察到类似的调控子活性，尽管IMC4中的ESR1和AR活性更高。

染色质重塑调控子的谱型显示了不同IMC之间的不同表观遗传状态，这可能导致不同的生物学行为（图S7H）。例如，在IMC4中观察到高EZH2调控子活性，这在许多癌症类型中都过表达，可能与较差的临床结果相关（Duan等人2020年）。高CREB1水平可能增强IMC3中的细胞增殖和侵袭能力（Guo等人2018年）。IMC1中的高FLI1调控子活性与上皮细胞迁移倾向和细胞连接组织减弱相关（Guneri-Sozeri等人2023年）。IMC2中的DNA甲基转移酶（DNMT）不活跃，表明DNA甲基化状态下调。

总的来说，我们验证了四个IMC之间的分子差异，并绘制了IMC的转录图谱，表明IMC2与更好的预后相关，而其他IMC的进展风险比（HR）较高。

我们的主要分析使用了Prip等人的数据集（Prip等人2025年），并使用了另外三个数据集进行验证。每个样本根据基因表达数据被分类为IMC。我们选择了膀胱癌中频繁突变的基因，如图3A所示。图S9A显示了前20个显著改变的基因突变。IMC2中FGFR3突变富集（76.4%，p < 0.001），与其他两个数据集的结果一致（图S9B）。IMC2还显示出KDM6A（50.5%，p < 0.001）和STAG2（32.5%，p < 0.001）的改变比例更高。IMC3和IMC4分别富集ARID1A突变（41.2%和36.4%）。此外，IMC4还表现出TP53突变（95.5%，p < 0.001）和RB1突变（50%，p < 0.001，图3A）。在其他三个数据集中也观察到了较高比例的TP53突变（图S9C）。接下来，我们确定了所有四个数据集中参与TP53通路的几个关键基因（TP53、ATM、RB1、MDM2、E2F3和ATR）以评估该通路中的改变。改变定义为这些基因中的任何遗传变化，包括突变或拷贝数变异。如图3B所示，IMC4显示出比IMC2和IMC3更高的TP53通路改变频率。考虑到TP53在DNA修复中起重要作用，我们进一步研究了突变负荷。结果显示IMC4的TMB显著高于其他IMC（图3C）。

图3的替代文本可能是使用AI生成的。

IMC的基因组改变特征。 （A）使用Prip等人（Prip等人2025年）的可用基因组数据，每个样本的iCluster、基因组类别和基因组改变的分布。*、**、***分别表示双侧Fisher精确检验的p值< 0.05、< 0.01、< 0.001。箭头表示Benjamini-Hochberg调整后的p值< 0.05。左侧的数字代表基因组改变的总体百分比。 （B）直方图显示了四个数据集（Prip等人2025年、GSE163209、GSE32549和GSE48075）中每个簇的TP53通路改变比例。***表示经过Benjamini-Hochberg调整后的双侧Fisher精确检验的p值< 0.001。 （C）箱形图显示了Prip等人（Prip等人2025年）数据集中每个IMC的肿瘤突变负担。***表示经过Benjamini-Hochberg调整后的Fisher精确检验的p值< 0.001。

根据Prip等人（iCluster）（Prip等人2025年）和Lindskrog等人（基因组类别）（Lindskrog等人2021年）描述的两种不同的基因组分类，所有IMC4和大部分IMC3患者被分类为iClus4或GC3（图S9D和S9E），这些亚型与最大的基因组不稳定性和最差的PFS相关。

为了评估肿瘤内的异质性，应用了加权计算机病理学（WISP 2025），首先过滤了纯样本，然后基于批量转录组分析计算了纯样本的质心。因此，每个样本在三个权重簇中被分配了一个权重，如“方法”中所述，相关的p值显示在表S6中。所有簇都显示出异质性，其中IMC1的异质性程度最低，而IMC2的异质性最大（图S10A）。权重簇的转录组和基因组分析揭示了保守的生物学特征（图S10B-D）：权重簇3和4显示出对传统细胞毒性疗法的潜在敏感性，权重簇4显示TP53和RB1突变；权重簇1显示出免疫浸润特征，表现为PD-1、PD-L1和TGF-β表达升高；权重簇2由FGFR3、STAG2和KDM6A突变定义。这些结果表明了定义IMC特征的稳健性。

总的来说，IMC4的特点是TP53通路改变和最重的突变负荷，而IMC2的特点是高FGFR3突变率。

我们使用了Groeneveld等人的数据集（Groeneveld等人2024年），该数据集整合了转录组和蛋白质组数据（图S11）来分析和验证蛋白质组特征。无监督的蛋白质组群（uPGs）A、B和C与IMC3和IMC4有重叠，而IMC2与组E相关（图S11A）。此外，FGFR3基因组改变主要在IMC2中观察到，这与先前的发现一致。为了进一步阐明IMC的蛋白质组图谱，我们选择了uPGs中变化最大的25个蛋白质（如Groeneveld等人2024年所述），并量化了它们在IMC中的丰度模式，从而揭示了异质性。如先前的研究所示，STAG2蛋白表达升高与疾病进展的风险比（HR）增加相关（Taber等人2021年，Lelo等人2018年）。值得注意的是，IMC3表现出STAG2蛋白水平升高，这与PFS降低相关（图S11B和S11C）。

我们观察了IMC之间临床变量的不同分布（图4A和S12A）。无论临床分期、WHO 1973分级或WHO 2004分级如何，IMC4都表现出更高比例的高级别病例（p < 0.001）。相比之下，IMC2的进展潜力较弱，大多数为低级别（p < 0.001）。IMC1和IMC3在所有三个参数上表现出中间特征。

图4的替代文本可能是使用AI生成的。

IMC与临床特征、生存结果和膀胱内BCG灌注反应的关联。生存分析基于六个具有可用生存数据的数据集（UROMOL 2020、de Jong队列A、de Jong队列B、GSE154261_73、GSE163209和GSE128959）。 （A）每个IMC中临床分期、WHO 1973分级和WHO 2004/2016分级的比例。p值使用双侧Fisher精确检验计算得出。比较是针对一个簇与所有其他簇进行的。(B) 四种IMC的生存分析，左侧面板显示了无进展生存期(PFS)，右侧面板显示了无复发生存期(RFS)。(C) 生存分析显示了四种IMC的PFS，左侧面板进行了T1分期，右侧面板进行了Ta分期。(D) 生存分析比较了高风险/非常高风险组中是否进行BCG灌注对PFS的影响，根据2024年欧洲泌尿外科学会(EAU)指南，BCG灌注是首选治疗方法。(E) 生存分析比较了低风险/中等风险组中是否进行BCG灌注对PFS的影响，根据2024年欧洲泌尿外科学会(EAU)指南，BCG灌注不是首选治疗方法。生存分析显示IMC与PFS之间存在强烈关联，但在无复发生存期(RFS)方面没有显著差异（图4B）。IMC3、IMC4和IMC1的PFS较差，而IMC2的结果较好。鉴于治疗后进展为MIBC的继发性病例通常比原发性MIBC的预后更差（Pietzak等人2019年，Grossmann等人2022年），因此将PFS作为主要终点。为了评估IMC亚型的独立预后价值，我们进行了多变量Cox回归分析，调整了WHO 2004分期、临床分期和BCG治疗因素。由于临床分期（p=0.009）和BCG治疗（p=0.039，图S12B）违反了比例风险假设，我们使用了以分期为分层因素的分层Cox模型，并包括了BCG治疗的时间依赖性系数。在这个模型中，所有IMC亚型都与IMC2进行了比较。IMC1（HR=2.18，95% CI 1.22–3.88，p=0.008）、IMC3（HR=2.88，95% CI 1.70–4.88，p<0.001）和IMC4（HR=2.51，95% CI 1.33–4.76，p=0.005）分别与进展风险显著增加相关（图S12B）。我们进一步研究了IMC在不同临床分期（T1 vs. Ta）中对PFS的分层能力。如图4C所示，IMC3的PFS最差，而IMC2的结果较好，表明其具有超出临床分期的预后价值。将整合分子分类应用于MIBC样本（TCGA-BLCA）显示了亚型变化：IMC2的比例减少，IMC3和IMC4的比例增加（图S12C）。这表明，尽管该分类系统是基于NMIBC数据开发的，但它能够捕捉到与临床结果和肿瘤生物学相关的关键基因特征。此外，我们进行了生存分析，以了解不同IMC对BCG治疗的反应。BCG分层生存分析仅显示IMC3的PFS有所改善，其他亚型没有显著变化（图S12D）。我们还根据指南组进行了亚组生存分析（图4D和E）。在没有风险因素信息的情况下，T1HG、T1G3或CIS患者被归类为高风险和非常高风险组（Gontero等人2024年），对于这些患者，BCG治疗是一线疗法；而所有其他患者被归类为低风险和中等风险组。在低风险/中等风险组中，所有IMC的PFS没有显著改善。在高风险/非常高风险组中，IMC1和IMC3在BCG灌注后PFS有所改善（p=0.011和<0.001）。这一发现可以避免高风险/非常高风险组中31%的IMC2/IMC4患者接受不必要的BCG过度治疗，同时优化对可能响应亚型的治疗。为了便于临床应用，我们开发了一个结合IMC和临床分期的进展风险诺模图（图S13A）。基于IMC的模型比单独使用临床分期具有更好的预测性能（AUC提高），当结合这两个变量预测5年或7年进展时，AUC进一步提高（图S13B）。我们的整合分子分类系统能够独立于临床分期对PFS进行分层。IMC2与最佳结果相关。高风险/非常高风险组中的IMC1和IMC3可能从BCG灌注中获益，表明特定分子亚型具有治疗效用。

讨论
在这项研究中，确定了四种IMC，每种IMC都具有独特的转录组、基因组和临床特征，从而解决了NMIBC的肿瘤间异质性问题，如图5所示。为了便于临床应用，我们使用R语言实现的Pearson最近中心点算法开发了一个单样本分类器，该分类器利用了转录组数据。考虑到肿瘤内异质性，该分类器不仅将样本分配到特定簇中，还为每个簇提供了Pearson相关系数。在临床实践中，该分类器会用IMC标签标注肿瘤样本的转录组。我们的结果揭示了IMC之间的不同程度的肿瘤间异质性，需要进一步的研究来阐明它们的预后和临床意义。

图5
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

IMC的关键特征总结。提出的NMIBC分类法揭示了显著的分子异质性，并为临床管理提供了深入的见解。

鉴于非肌层浸润性膀胱癌对BCG治疗的反应存在差异，准确预测治疗效果至关重要。由于缺乏BCG治疗的数据，之前的基于转录组的模型（Baylor(Mo等人2018年)，Lund(Marzouka等人2018年)并未专门针对BCG反应进行预测。Baylor模型旨在对膀胱癌（包括NMIBC和MIBC）的整体生存进行分层和预测。Lund模型除了定义NMIBC和MIBC的更详细亚型外，还使用了IHC数据。UROMOL21(Lindskrog等人2021年)识别出四种具有不同PFS和RFS的NMIBC亚型。尽管它关注的是2a类和2b类的BCG反应，但没有观察到统计学上的显著差异。Chicago(Robertson等人2020年)关注的是T1期患者在接受BCG治疗后的RFS，但原始文章并未报告显著差异。最近，de Jong等人(Jong等人2023年)（Erasmus团队）利用了一个大型BCG治疗的HR-NMIBC队列，将样本分为三个亚型，其中BRS3在BCG治疗后的PFS最差。然而，缺乏未经治疗的对照组数据限制了其识别可能从BCG灌注中受益的患者的能力。在这里，我们试图改进风险分层系统。我们的结果表明，在高风险/非常高风险组中，IMC1和IMC3从BCG治疗中获益显著，而IMC2和IMC4的反应有限，这表明大约31%的患者可能避免不必要的BCG过度治疗。这种方法可能有助于更好地识别最有可能从BCG灌注中受益的候选者。需要进行前瞻性研究和临床试验以进一步验证。

整合分子分类系统为指导治疗策略提供了有价值的框架。如前所述，高风险/非常高风险组中的IMC3和IMC1在BCG治疗后PFS有所改善。IMC3和IMC4的特点是活跃的增殖、DNA复制和细胞周期晚期，这表明它们可能对化疗有反应。IMC1表现出免疫抑制，表现为高水平的PD-1、PD-L1和泛成纤维细胞TGF-beta表达。升高的TGF-beta活性可能会阻碍T细胞浸润到肿瘤中（Mariathasan等人2018年）。临床前研究表明，M7824是一种同时阻断PD-L1通路并抑制TGF-beta信号传导的药物，是治疗尿路上皮癌的有希望的候选药物（Grenga等人2018年），目前正在进行临床试验（Niglio等人2021年）。ICI和抗TGF-beta的联合使用可能改善IMC1患者的预后。IMC2表现出最佳的PFS，可能主要需要监测。FGFR3突变在约60%的NMIBC病例中普遍存在，已知在肿瘤发生中起关键作用（Noeraparast等人2024年）。高FGFR3突变和表达表明FGFR3抑制剂可能对IMC2有效。口服Erdafitinib（FGFR3抑制剂）已被证明可以延长FGFR3/2改变患者在BCG治疗后复发的PFS；然而，它与不可忽视的全身副作用发生率相关（Catto等人2024年）。TAR-210是一种新型药物递送系统，旨在在膀胱局部释放Erdafitinib并最小化全身毒性（Vilaseca等人2023年），是一个有前景的替代方案。

这项研究有几个局限性，包括临床数据收集的回顾性。此外，还需要外部队列进行进一步验证。整合分类系统是基于五种转录组分类方案构建的，可能无法完全捕捉NMIBC的复杂性。需要多组学亚型来全面描述膀胱癌的肿瘤间异质性。此外，批量RNA表达无法充分了解肿瘤内异质性；未来的研究应优先考虑单细胞RNA测序和空间转录组学。单样本分类器基于1,430个基因构建，以确保分类准确性。我们认识到，在临床环境中，这组基因可能会带来大量的测序成本。未来的工作应侧重于降维，以识别保留高分类性能的更简洁的基因特征，从而促进临床适用性和转化可行性。在临床应用之前，需要进行前瞻性研究和随机临床试验，并应在独立的多中心队列上验证简化的基因面板。我们通过整合五种基于转录组分析的分子亚型框架，开发了一个NMIBC的整合分子分类系统。这种方法识别出四种具有独特转录组、基因组和临床特征的IMC。值得注意的是，我们发现IMC1和IMC3在高风险/非常高风险组中在接受BCG灌注后PFS有所改善。提出的整合分子分类系统为优化膀胱内BCG治疗方案建立了临床前框架，并为治疗策略的开发提供了信息。我们的发现强调了协调分子分类系统以改进NMIBC管理和预后分层的价值，为个性化临床管理铺平了道路。