用于小分子微电子衍射（MicroED）数据的高通量自动化分子替换技术

《IUCrJ》：High-throughput automated molecular replacement for small-molecule MicroED data

　　亚当·蒂博多克斯（Adam Thibodeaux）| 关宏布（Guanhong Bu）| 莱尔·C·爱德华兹（Lael C. Edwards）| 艾玛·罗瓦·达内利乌斯（Emma Rova Danelius）
加州大学河滨分校化学系
900 University Avenue
河滨，加利福尼亚州 92521，美国

在过去十年中，人们对电子衍射（ED）在蛋白质和小分子结构表征中的应用兴趣显著增加。虽然从头算相位方法仍然是小分子样品ED数据的金标准，但在数据收集过程中辐射束的损伤以及纳米晶体样品的低结晶度使得这种方法变得不可行——特别是对于那些具有构象灵活性的复杂分子。分子替换（MR）是蛋白质ED数据中最常用的相位方法，可以解决与数据质量下降相关的问题。然而，由于缺乏生成最佳试验构象的方法，其在小分子中的应用一直受到限制。本文开发了一种高通量自动化分子替换工作流程，用于解决一种具有药用价值的 macrocyclic gallotannin——corilagin 的新型ED结构问题，这种结构无法通过从头算相位方法得到解决。该方法通过三种已知结构的类似 macrocycles（paritaprevir-α、paritaprevir-β 和 grazoprevir）进行了验证，数据分辨率分别为 1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8 和 2.0 ?。在所有这些分辨率下，所开发的工作流程都取得了成功，得到的解的 R 因子和 RMSD 值都在可接受的范围内，与从头算得到的结构相当。

1. 引言
微晶电子衍射（MicroED），也称为三维电子衍射（3DED），在过去十年中在晶体学领域得到了稳步的发展（Shi 等人，2013；Jones 等人，2018；Mu 等人，2021；Gemmi 等人，2019；Danelius 等人，2023b；Haymaker & Nannenga，2024）。对于小分子结构，继早期直接从粉末样品进行从头算确定之后（Gorelik 等人，2012；van Genderen 等人，2016；Jiang 等人，2022），最近的进展表明可以确定氢原子位置（Palatinus 等人，2017）和绝对构型（Brázda 等人，2019），这突显了该方法的潜力和适用性。样品制备的简便性是 MicroED 对小分子的一大优势，也极大地促进了其作为结构测定技术的广泛应用。相比之下，大分子 MicroED 中的样品制备仍然是一个具有挑战性的限制步骤。对于小分子分析，通常可以直接从粉末样品获得纳米晶体材料，从而省去了结晶筛选的步骤。然而，粉末衍生的样品仍可能因结晶度不足或数据采集过程中电子束引起的辐射损伤而难以获得高分辨率的衍射数据（Hattne，2021）。这些限制使得许多 MicroED 实验的数据集（根据我们的经验，大约 50% 的复杂分子数据集）无法通过直接方法进行相位测定，即仅基于衍射振幅来解决相位问题（Sheldrick 等人，2012）。在数据分辨率不足以使用直接方法的情况下，全局优化技术（如模拟退火）已成功用于从 ED 数据中确定晶体结构（Feyand 等人，2012；Burla 等人，2015；Gemmi 等人，2019；Woollam 等人，2020；Andrusenko 等人，2020；Lightowler 等人，2022）。全局优化利用了关于分子连接性的知识（Brunger，1991；Burla 等人，2015；Woollam 等人，2020），这在许多情况下是成立的。

在蛋白质晶体学领域，由于类似的低结晶度，衍射数据质量较差是常态（Timofeev & Samygina，2023），分子替换（MR）是最有效且广泛使用的替代从头算方法的方法，占蛋白质数据库（PDB）中存储的 X 射线结构的 80% 以上（Burley & Berman，2021）。MR 是一种概念上简单的方法，通过一系列平移和旋转函数优化晶体中试验结构的位置和方向，以最佳匹配特定晶格位置的计算结构因子振幅与实验衍射数据确定的结构因子（Rossmann，1990）。试验结构的一个主要片段需要与正确结构具有相同的构象才能成功进行 MR。如果该片段未知，则需要使用模拟退火等全局优化方法进行构象搜索。由于 MR 算法中的优化基础严重依赖于计算数据和实验数据之间的结构因子差异，因此输入到 MR 算法中的试验结构的构象至关重要。只有当试验模型与真实结构非常相似时，MR 才能成功（Abergel，2013）。

随着大型、复杂且构象灵活的分子作为药物候选物的流行，这些分子能够靶向以前无法成药的蛋白质（例如，没有明显结合位点的平坦或无特征的蛋白质（DeGoey 等人，2018）），对这些化合物的结构阐明对于进一步开发非常重要。这类化合物被称为“超越规则 5”（bRo5）化合物，因为它们的分子性质（分子量、亲脂性、氢键供体和受体数量）超出了 Lipinski 规则 5（Lipinski 等人，1997）。bRo5 化合物，如 macrocycles，已知具有内在的灵活性，最好描述为溶液中的构象集合。由于 macrocycles 中的键旋转受到高度约束且相关性强，生成完整的构象空间在计算上要求很高；因此，全局优化方法很少作为生成 macrocyclic 构象集合的主要方法。相反，存在许多基于不同方法的构象生成器（例如机器学习（Jiang 等人，2022）、分子力学（Watts 等人，2014）、分子动力学（Poongavanam 等人，2018）和距离几何学（Seidel 等人，2023）。最近的研究表明，距离几何学方法能够采样构象空间，为这些复杂分子生成的结构与实验确定结构的 RMSD 剪裁值在 2 ? 以内，其效率明显高于传统的分子力学方法（Seidel 等人，2023）。虽然 2 ? 的 RMSD 在蛋白质晶体学中的 MR 中是建议的限值，但对于小分子，MR 的 RMSD 剪裁值要低得多（van de Streek & Neumann，2010）。一些最近的研究表明，当将这种相位方法与将目标分子分割成刚性片段以及使用多组分 MR 搜索进行构象筛选相结合时，确实可以将其应用于小分子系统（Gorelik 等人，2023；Deschner 等人，2025）。这种方法对于可以容易分割成刚性部分的传统 Ro5 化合物非常有用，但对于缺乏明显分割模式的 bRo5 候选物则不太适用。

在这里，我们通过设计一种算法来扩展 MR 在小分子系统中的应用能力，该算法使用 MicroED 数据自动化解决 macrocyclic bRo5 分子的结构，而无需任何分割。我们自动化 MR 的输入集合是使用开源构象集合生成工具 CONFORGE（Seidel 等人，2023）计算的。为了采样 macrocycle 构象，该工具采用基于距离几何学和力场驱动的结构精炼的纯随机方法。选择 paritaprevir 和 grazoprevir [图 1(a) 和 (b)] 作为验证结构，以确保高通量自动化分子替换（HAMR，图 2）算法正常工作，并选择 corilagin [图 1(c)] 作为一种新型结构来展示算法的能力。

下载：下载高分辨率图像（35KB）
下载：下载全尺寸图像
图 1. 用于验证 HAMR 方法的 macrocyclic “超越规则 5”（bRo5）分子：(a) paritaprevir，(b) grazoprevir 和 (c) corilagin。
下载：下载高分辨率图像（157KB）
下载：下载全尺寸图像
图 2. (a) 应用于验证化合物 paritaprevir-α 的 HAMR 算法逻辑的可视化表示，数据分辨率为 1.4 ?。(b) HAMR 算法中涉及的最重要步骤的通用逻辑流程图。在步骤 2 中，可以通过 LLG 或 R 因子对解决方案进行排序。在步骤 3 中，ΔRMSD 表示每次 10° 旋转 360° 时的平均 RMSD 变化。在步骤 6 中，可以在设置时指定过滤量，以更全面地搜索构象空间。

paritaprevir 和 grazoprevir 都是很好的验证目标，因为它们是早期在临床中成功应用的 bRo5 化合物，都是 FDA 批准的 macrocyclic 药物，并且它们的 MicroED 结构都是通过从头算方法解决的（Danelius 等人，2023a；Bu 等人，2024；Wieske 等人，2026）。此外，paritaprevir 是一个特别好的验证候选物，因为它有两种已知的多态构象（这里称为 paritaprevir-α 和 paritaprevir-β），全原子 RMSD 大约为 0.8 ?，因此开发的方法能够正确区分这两种构象对于可能包含多种构象的 MicroED 数据非常有用。最后，选择 corilagin 是因为文献中记录了它的多种潜在医疗用途（Li 等人，2018），并且它是一个尽管有大量高质量数据但仍无法通过从头算方法解决的 MicroED 数据集的实际案例。

2. 材料与方法
2.1. 材料
Corilagin 可从 Invivochem 购买。大约 0.5 mg 的粉末溶解在超纯 H2O 中，置于 4 ml 的闪烁瓶中，并在通风橱中空气干燥。干燥后的残留物从玻璃壁上刮下。

2.2. 格子制备
格子制备遵循之前的程序（Unge 等人，2024；Lin 等人，2024）。一个涂有连续碳支撑膜的 TEM 格子（200 网目，3.05 mm 外径，Ted Pella）通过在 PELCO easiGlow（Ted Pella）中以 15 mA 的电流在负模式下每侧放电 60 秒来制备。将格子轻轻与闪烁瓶中的干燥残留物混合，然后取出并夹紧以装载到冷冻 TEM 中。

2.3. MicroED 数据收集
MicroED 数据收集遵循之前的程序（Unge 等人，2024；Lin 等人，2024），使用 EPU-D（Thermo Fisher Scientific）在 Talos Arctica 冷冻透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific）上进行，操作温度为 80 K，加速电压为 200 kV，对应波长为 0.0251 ?。整个格子的图谱以 210× 的放大倍数获取。微晶体的筛选放大倍数为 3400×。在识别出单个微晶后，插入选定的区域孔径大小 50（直径 1.4 μm），然后将显微镜切换到衍射模式，在等心高度和平行电子束条件下拍摄静态衍射图像（C2 镜头强度 45.2%，C2 孔径大小 70，光斑大小 11）。一旦观察到高分辨率的衍射斑点，就在 Falcon III 探测器（Thermo Fisher Scientific）上连续记录 MicroED 数据，曝光率为每帧 1 秒，同时样品台以每秒 0.6° 的速度从 ?69° 旋转到 +69°。每个单晶数据集以 MRC 格式作为电影收集，总电子通量为 2.30 e ??2。

2.4. MicroED 数据处理
对于每个单晶数据集，使用免费提供的 MRC2SMV 软件（https://cryoem.ucla.edu/microed）从原始 MRC 电影中提取衍射图像并转换为 SMV 格式（Hattne 等人，2015）。在 XDS 中处理衍射图像，应用分辨率剪裁条件，即平均 I/σ(I) ≥ 1.0 和 CC1/2 ≥ 0.3（Kabsch，2010；Brehm 等人，2023）。不同单晶数据集的反射强度在 XSCALE（Kabsch，2010；Brehm 等人，2023）中进行了缩放和合并。反射在 XDSCONV（Kabsch，2010；Brehm 等人，2023）中转换为 SHELX HKL 格式。对于 corilagin，由于使用 SHELXT 或 SHELXD（Sheldrick，2015；Schneider & Sheldrick，2002）无法通过从头算相位得到解，因此反射在 XDSCONV（Kabsch，2010；Brehm 等人，2023）中转换为 CCP4 MTZ 格式，以便使用 MR 进行相位测定。对于 grazoprevir、paritaprevir-α 和 paritaprevir-β，直接使用先前发表的 MicroED 结构的反射文件（Danelius 等人，2023a；Bu 等人，2024；Wieske 等人，2026），并通过 CCP4i 程序套件中的 F2MTZ 将它们从 SHELX HKL 格式转换为 CCP4 MTZ 格式（Potterton 等人，2003）。使用 CCP4 程序套件中的 mtzutils 将分辨率剪裁为 1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5 和 3.0 ?，以模拟 paritaprevir-α、paritaprevir-β 和 grazoprevir 的低分辨率数据（Potterton 等人，2003）。科里拉金（corilagin）的晶体学数据可以在表2中找到，而格拉佐普雷维尔（grazoprevir）、帕里塔普雷维尔-α（paritaprevir-α）和帕里塔普雷维尔-β（paritaprevir-β）的数据则位于支持信息中的表S3–S25.2中。自动化分子替换过程首先使用CONFORGE软件包从SMILES表示法生成初始构象，该软件包是C++ CDPKit库的Python绑定的一部分。默认设置包括20 kcal mol?1的能量窗口、300个输出构象、构象间的最小RMSD为0.5 ?以及最大生成时间为2小时（Seidel等人，2023年）。此外，对于科里拉金，CONFORGE构象生成的采样数量是不受限制的，这是为了采样该分子更广泛的构象空间。使用RDKit的EKTDGV3也采用了类似的设置进行构象生成（Wang等人，2020年）。在HAMR循环过程中，通过C++ RDKit库的Python绑定修改二面角来生成构象。结构因子是使用C++ gemmi库的Python绑定通过电子散射模式中的电子密度计算器计算的，并进行了近似各向同性温度因子的拟合和缩放，没有使用溶剂掩模（Wojdyr，2022年）。分子替换是使用CCP4程序套件中提供的PHASER方法进行的，直接利用了二进制可执行文件（Potterton等人，2003年；McCoy等人，2007年）。在PHASER中开始MR之前，算法会进行组成检查，以确保结构的体积能够适应由单元格尺寸定义的非对称单元（ASU）（McCoy等人，2007年）。然而，由于PHASER主要是为蛋白质和其他大分子开发的，仅对作为蛋白质配体的小分子有少量支持，因此这种组成检查对于小分子来说往往不准确，导致预验证检查失败。为了解决这个问题，采用了一种变通方法，即将单元格的组成定义为单个氢原子，这样总是能通过预验证检查。在预验证成功完成后，再根据实际提供的结构更新这个组成，从而不会降低MR结果的任何有效性。

2.6. 精细化
在完成HAMR循环后，使用PHENIX程序套件中提供的refine程序进行细化，直接利用了二进制可执行文件（Liebschner等人，2019年）。每次细化之前都会生成Rfree测试集，其强度为总强度的5%，除了帕里塔普雷维尔-α的分辨率为1.8 ?时使用总强度的10%。对于所有细化，都分别对倒易空间中的单个位点、实空间中的单个位点、各向同性原子位移参数、笛卡尔空间和扭转空间的模拟退火、XYZ权重的优化以及使用电子散射形状因子的ADP权重优化进行了五次循环。

3. 结果
3.1. 已知结构的初始碎片化MR
最初，我们尝试使用Gorelik等人开发的基于碎片化的多组分搜索MR方法来处理小分子（Gorelik等人，2023年）。然而，如图1#所示，无论是帕里塔普雷维尔还是格拉佐普雷维尔的结构，都缺乏将化合物明确分割成纯刚性片段的明显方法。虽然帕里塔普雷维尔含有刚性 的嘧啶和苯并喹啉侧链，但其磺酰侧链和核心具有显著的灵活性；同样，格拉佐普雷维尔含有刚性的叔丁基侧链，但其磺酰侧链和核心也具有显著的灵活性。尽管如此，我们还是采用了碎片化策略作为初步尝试，将大环核心和所有侧链（无论其灵活性如何）分离成单独的片段，作为适当的MR搜索输入结构的最佳近似。不幸的是，尝试所有可能的片段和核心组合并没有得到解决的结构，这突显了在使用基于碎片化的MR方法时刚性部分的必要性。

3.2. 初始构象生成分析
我们设计了一种新策略，为每种化合物生成一系列构象，然后使用Python脚本以自动化的方式分别进行MR相位校正。我们测试了两种基于距离几何学的开源免费构象生成器（CONFORGE和EKTDGV3）来进行构象生成。初始MR相位校正的结果通过对数似然增益（LLG）和平移函数Z-score（TFZ）来评估，这两种指标是使用MR时预测模型准确性的最佳指标（McCoy等人，2005年）。尽管有研究表明对于小分子，基于TFZ和LLG的数据分析可能无法轻易区分与正确结构相似的结构（Gorelik等人，2023年），但这些指标确实有助于排除与正确结构完全不相似的错误解。我们的分析显示，在两种构象生成器中，帕里塔普雷维尔、帕里塔普雷维尔-α和帕里塔普雷维尔-β的平均LLG和TFZ得分最高的是CONFORGE，这表明这种构象生成器为我们的方法产生了最高质量的构象（表S1）。尽管这一趋势是有用的，并且指出了正确的方向，但我们无法得到具有可接受Rwork、Rfree或与通过ab initio方法细化后找到的结构相比质量较低的RMSD的解，因此需要进一步修改构象才能通过MR成功得到有效的解。

3.3. 格拉佐普雷维尔、帕里塔普雷维尔-α和帕里塔普雷维尔-β的HAMR
我们设计了一种方案，涉及通过单独修改每个二面角来自动化修改CONFORGE生成的构象，并使用最初相位校正后的静电势图的R因子和重新相位校正后的构象的LLG来确定这些修改后构象的准确性，如图2#所示。这个过程以自动化的方式重复进行，对于不在大环核心内的每个二面角都如此——由于在保持正确化学键合的同时修改循环结构内的二面角非常复杂，因此避免了这种情况。相反，大环核心的构象空间采样由CONFORGE处理，因为在每次HAMR尝试中都会优化具有不同核心构象的不同输入结构。该系统被设计为一个遗传算法，其中每个循环的最佳解被用作下一个循环的起始模型，直到所有二面角都被完全优化，因为这个问题可以被视为一个简单的LLG全局优化问题，非常适合遗传算法（Katoch等人，2021年）。在选择最佳CONFORGE构象并修改选定的二面角后，使用与之前相位校正结果相同位置的修改后构象的R因子作为过滤标准，以确定哪些修改后的构象值得进行MR。这是因为MR过程是该算法中的最大瓶颈，根据我们的测试，这个R因子可以作为确定修改后构象初始有效性的近似代理，尽管仍需要MR来确定构象在晶体晶格中的姿态以得到最终解决的结构。同样，为了避免不必要的MR计算，每个循环都会进行去重检查，其中与已相位校正的解相差0.02 ? RMSD的构象会被丢弃，因为测试的构象多样性增加代表了更广泛的构象空间搜索。

如前所述，该方法应用于格拉佐普雷维尔、帕里塔普雷维尔-α和帕里塔普雷维尔-β，在每个数据集的最高分辨率（分别为0.99、0.85和0.95 ?）以及1.0、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0和2.5 ?的分辨率下进行了模拟，以获得较低质量的数据，所有结果总结在表1#中；进一步的细化统计信息提供在表S3–S27中。所有验证化合物的示例静电势图包含在图3#中，显示所有原子都位于静电势图内，但随着分辨率的降低，图的清晰度显著下降。我们通过对ab initio解决的结构进行相同的MR和细化来研究观察到的RMSD、Rwork和Rfree趋势，并观察到与HAMR解决的结构相似的趋势（表S2）。

表1. 不同数据分辨率限制下所有验证化合物的HAMR解决结构的细化统计信息以及HAMR解决结构与之前通过ab initio方法解决的结构的RMSD差异
空单元
分辨率限制（?）
最高
1.0
1.2
1.4
1.5
1.6
1.8
2.0
2.5
格拉佐普雷维尔
R work 0.21
99
0.22
95
0.19
62
0.20
39
0.18
74
0.16
93
0.16
84
0.13
44
0.28
81
R free 0.25
06
0.24
29
0.23
98
0.22
41
0.22
60
0.18
59
0.20
66
0.16
16
0.51
64
RMSD（?）
0.08
0.30
0.11
0.17
0.29
0.17
0.19
0.29
1.06
帕里塔普雷维尔-α
R work 0.23
60
0.20
77
0.19
76
0.20
15
0.17
85
0.21
71
0.16
83
0.16
06
0.30
29
R free 0.25
62
0.23
53
0.20
37
0.20
48
0.19
01
0.22
45
0.19
09
0.17
30
0.52
51
RMSD（?）
0.06
0.05
0.07
0.10
0.09
0.28
0.12
0.14
2.29
帕里塔普雷维尔-β
R work 0.21
16
0.20
47
0.17
25
0.18
88
0.17
49
0.15
44
0.14
34
0.14
01
0.37
16
R free 0.22
37
0.22
79
0.19
55
0.19
48
0.18
01
0.18
43
0.15
43
0.14
42
0.46
99
RMSD（?）
0.05
0.05
0.06
0.11
0.65
0.65
0.66
0.66
2.92
调整后的RMSD（?）
0.05
0.05
0.06
0.11
0.10
0.10
0.13
0.14
2.92
下载：下载高分辨率图像（319KB）
下载：下载全尺寸图像

图3. 不同分辨率下帕里塔普雷维尔-α（a–c）、帕里塔普雷维尔-β（d–f）和格拉佐普雷维尔（g–j）的HAMR结构解（浅蓝色棒状图），以及相应的2mFo ? DFc图（深蓝色网格）。2mFo ? DFc图分别在1.0、1.5和2.0 ?分辨率截止值时轮廓化为平均值以上3.0、2.5和1.5σ。

3.4. 科里拉金的HAMR
在验证了格拉佐普雷维尔、帕里塔普雷维尔-α和帕里塔普雷维尔-β的方法后，我们着手使用这种方法来解决另一种没有已知结构的大环化合物——科里拉金的结构，我们的实验室之前无法用ab initio方法解决这个问题，可能是由于六元环和多个羟基团的存在（Willart等人，2010年）。我们将HAMR方法应用于科里拉金的过程与验证化合物完全相同，只是在初始CONFORGE构象生成时增加了一个设置。在CONFORGE中，通常默认限制为2000个的采样构象数量被设置为不受限制。这种分子的灵活性比验证化合物稍低，导致CONFORGE在采样构象空间不足的情况下提前退出，因为出现了许多重复的构象。HAMR输出的结构在晶体学a轴上显示出空洞体积[图4#(b)]。虽然空洞本身并不妨碍结构确定，但它们可能会由于相对较差和低效率的晶体堆积而导致使用ab initio方法解决结构时遇到困难（Steed & Steed，2015年）。此外，与我们的验证化合物不同，在HAMR输出中观察到了弱的正静电势差密度，这归因于两个未建模的水分子位点部分占据了空洞体积，因为科里拉金的制备涉及从水中重新结晶。目前HAMR不支持自动添加溶剂分子，因此这些水分子被手动添加到晶体结构中，并使用之前的相同设置再次进行细化，以得到最终结构。从这次HAMR运行中获得的科里拉金解决结构的数据总结在表2#中，结构显示在图4#(a)中。

下载：下载高分辨率图像（181KB）
下载：下载全尺寸图像

图4. (a) 1.1 ?分辨率下科里拉金的HAMR解决结构（浅蓝色棒状图）以及相应的2mFo ? DFc图（深蓝色网格）。2mFo ? DFc图轮廓化为平均值以上3.0σ。
(b) HAMR输出结构的晶体堆积分析显示了晶体学a轴上的空洞体积。

表2. 科里拉金晶体结构确定的实验细节
化学式：C27H22O18·2H2O
晶体系统：正交晶系，P21221
温度（K）：80
a, b, c（?）：6.96, 15.89, 24.41
α, β, γ（°）：90, 90, 90
辐射类型，λ（?）：电子，0.0251
晶体数量：2
分辨率（?）：1.1
数据收集：Talos Arctica TEM
观察到的反射数：8981
唯一反射数：1096
完整性（%）：84.7
R meas：0.28
I/σ(I)：6.42
CC1/2（%）：98.4
细化：
Rwork, Rfree：0.20
38, 0.21
细化中的反射数：1026
RMSD：2.0
角度（°）：2.0
RMSD：0.014

4. 讨论
如表1#所示，R因子通常随数据分辨率的提高而降低——即低分辨率的MicroED数据产生更好的统计结果，直到达到一个绝对限制，此时从MicroED数据中只能解析出有限的有用结构信息，对于所有验证化合物来说，这个限制是2.5 ?。这种反向趋势主要是由于低分辨率壳层的I/σ(I)显著增加，如图5#所示；因为R因子是作为强度标准误差的函数计算的，所以随着标准误差的降低，R因子应该会降低，这正是我们所观察到的。此外，ab initio解决的结构与HAMR解决的结构之间的RMSD趋势相反，通常随着分辨率的降低而增加。再次强调，这一点在直觉上是有道理的：随着分辨率的降低，反射的数量也会减少，从而导致从反射中可以确定的结构信息减少，模型的准确性也随之降低。然而，所有的RMSD值都是合理的，并没有表明HAMR与从头算方法相比产生了不同的构象，因为RMSD值远低于通常用于判断独特构象的0.5 ? RMSD阈值（Olanders等人，2020年）。相反，RMSD值显示的是每个原子的坐标存在轻微差异，而不是构象发生了巨大变化（见图S1–S3）。下载：下载高分辨率图像（75KB）下载：下载全尺寸图像

图5. 对于应用了分辨率限制的数据集，HAMR解决方案的Rwork值与I/(I)σ值的比较，显示出这两个统计量之间存在反比关系。

4.2 HAMR的局限性
如前所述，HAMR能够可靠地解析paritaprevir和grazoprevir的结构，分辨率达到2.0 ?。然而，超过这个分辨率后，该方法就无法提供有意义的结构信息。这一阈值从R因子中可以明显看出，所有结构的R因子在2.5 ?时都超过了0.45。相应地，我们验证化合物的RMSD值也显著增加——在所有情况下都超过了1 ?——这进一步表明实际的下限分辨率大约为2 ?，这一点从可观察到的R因子中可以得到体现。

此外，在所有化合物的较低分辨率（>1.4 ?）下，静电势图变得不那么详细，如图3#所示。这是预期之中的，但这会导致相似散射体无法区分。在这种分辨率下，这种无法区分是一个明显的局限性，如表1#所示，paritaprevir-β在1.5 ?以上的未调整RMSD值远高于较高分辨率下的RMSD值。由于碳和氮的散射因子有些相似，再加上电子密度的模糊，该方法在较低分辨率下难以区分这些原子。因此，paritaprevir中的嘧啶环侧链在HAMR方法输出的结构中呈现出伪C2对称性。这导致paritaprevir-β在1.4 ?以上的分辨率下，其嘧啶环的位置没有固定，可能在取代环所在的平面上翻转180°。因此，我们在表1#中承认了这一局限性，并通过仅基于重原子的位置计算RMSD来修正了paritaprevir-β的RMSD值，这一修正后的值在表中显示为调整后的RMSD。进行这种修正后，观察到了与paritaprevir-α和grazoprevir相似的趋势——即随着分辨率的提高，RMSD略有下降。然而，在高分辨率下，该方法能够轻松区分这些原子，并得出paritaprevir-α和paritaprevir-β的正确结构。

有趣的是，我们在paritaprevir-α中没有观察到同样的无法区分问题，这可能是由于这两个数据集的数据质量不同；尽管两个数据集的完整性都很高，分别为89.0%和98.4%，但paritaprevir-α的信噪比明显高于paritaprevir-β：最高分辨率数据集的I/σ(I)值分别为2.8和2.3。因此，paritaprevir-α数据集改进后的I/σ(I)包含了足够的信息，可以有效地区分碳和氮，这表明HAMR方法对数据完整性的小差异相对稳健，但对数据的噪声非常敏感。我们还观察到这种相关性也体现在R因子上——即随着I/σ(I)的增加和数据噪声的减少，Rwork和Rfree都有所改善，如图5#所示。这解释了为什么尽管在较低分辨率下信息量减少，代表模型准确性的R因子仍然会提高，并进一步支持了我们的方法对数据噪声的敏感性。

最后，我们仅在该方法对药物相关的大环小分子有效的情况下对其进行了测试。虽然原则上该方法也应该适用于非大环分子，但这仍然是一个未探索的领域。同样，我们仅在该方法对MicroED数据有效的情况下进行了测试；然而，PHASER和PHENIX的实现都可以轻松地对X射线数据进行相同的计算，而这些数据应该与该HAMR方法兼容。

4.3 预计完成时间
如前所述，该算法的最大瓶颈是MR过程，因为使用HAMR的默认设置时，需要通过MR对数千个构象进行相位分析。由于应用于小分子的MR领域在系统上尚未得到充分探索，因此很难预测单次MR计算需要多长时间，在方法开发过程中也难以推断出这一趋势。平均而言，在个人笔记本电脑上，所有化合物在最高分辨率下的完成时间大约为一到五小时。除了非常低的分辨率（约≥1.5 ?）外，所有分辨率下的完成时间大致相同，在这种分辨率下，由于LLG作为度量的区分能力下降，必须进行多次HAMR循环，从而导致完成时间显著增加。

5. 结论
在本文中，我们报告了一种利用自动化MR和MicroED数据确定药物相关分子结构的新颖高通量工作流程。该方法在1.0至2.0 ?的分辨率范围内进行了验证，与三个从头算解决的结构进行了比较，所有HAMR解决方案与相应的从头算结构都显示出良好的一致性，并且获得了可发布的R因子。此外，该方法还用于解决了一个具有药物相关性的新型大环化合物corilagin，该化合物无法通过从头算方法解决。我们预测，该方法将广泛应用于比这里描述的更复杂和构象更灵活的分子，包括重要的生物活性肽、毒素和天然产物，这些分子的分辨率通常大于1.0 ?。该工具可根据请求下载。