社交活动和饮食在解释倭黑猩猩肠道微生物群差异中的重要性

《American Journal of Primatology》：The Importance of Sociality and Diet in Explaining Variation in the Bonobo Gut Microbiota

　　**摘要**

肠道微生物群落或肠道微生物组因其在营养、发育、健康和疾病中的重要作用而受到越来越多的关注。在灵长类动物中，已经发现社会性和饮食等因素对肠道微生物组的结构具有重要影响。然而，对于倭黑猩猩（Pan paniscus）而言，社会性与饮食的相对重要性尚未得到研究。本文描述了2017年6月至10月在刚果民主共和国Lomako森林Iyema地区收集的252份倭黑猩猩粪便样本的饮食、社会性和肠道微生物组数据。我们提取了DNA，制备了16S rRNA文库，并使用Illumina MiSeq进行测序，然后将测序结果与群体的动态和进食行为数据进行了关联分析。研究发现，Lomako森林中倭黑猩猩肠道微生物组的α多样性在统计上显著受到群体成员身份（群体成员资格的衡量指标）、巢穴数量（群体规模的衡量指标）和月份（季节性的衡量指标）的影响。群体成员身份解释了倭黑猩猩肠道微生物组β多样性的19.48%–20.28%（基于Bray-Curtis差异度量方法），而月份解释了17.06%–21.38%的β多样性（基于Aitchison距离度量方法）。我们的广义差异模型结果显示，与饮食变量相比，社会性变量（如地理距离）解释了更多的变异。这些结果表明，社会性可能在构建Lomako森林中倭黑猩猩的肠道微生物组方面起着特别重要的作用。因此，在研究人类近亲中微生物与其宿主的共同进化历史时，社会性可能比饮食更具信息量。

**1 引言**

肠道微生物组在营养、发育、健康和疾病中起着重要作用（Allaband等人，2019年；Dantas等人，2013年；Dillon等人，2005年；Koch和Schmid-Hempel，2011年）。肠道微生物组受到多种内在和外在因素的影响。社会性和饮食在多大程度上塑造了肠道微生物组，目前尚不完全清楚，并且可能因物种而异。研究表明，社会性是哺乳动物和非哺乳动物物种中的一个重要解释因素（Archie和Tung，2015年；Gilbert，2015年；Koch和Schmid-Hempel，2011年；Trossvik等人，2018年）。虽然饮食对许多哺乳动物的肠道微生物组很重要（Ley等人，2008年；McKenzie等人，2017年；Moeller和Sanders，2020年），但社会性和饮食如何具体影响肠道微生物组的变异尚不清楚。非人类灵长类动物（NHP）是研究社会性、饮食和肠道微生物组如何共同变化的优秀模型（Amato等人，2016a；2016b；Amato等人，2014年，2015年；Archie和Theis，2011年；Archie和Tung，2015年；Baniel等人，2020年；Trossvik等人，2018年）。非人类灵长类动物相对容易获得详细的行为观察数据，并且可以非侵入性地收集粪便样本，以检验关于社会性、饮食和肠道微生物组之间关联的假设（Amato等人，2016a；2016b；Bj?rk等人，2019年；Stumpf等人，2016年）。早期的研究集中在饮食如何影响多种非人类灵长类动物的肠道微生物组，包括 Gelada 猿（Theropithecus gelada，Baniel等人，2020年；Trossvik等人，2018年）、黑吼猴（Alouatta pigra，Amato等人，2014年，2015年）、白脸卷尾猴（Cebus capucinus，Mallott等人，2017年；Mallott等人，2018年）、鞍背狨猴（Leontocebus weddelli；Garber等人，2019年）、低地大猩猩（Gorilla gorilla gorilla；Gomez等人，2016年；Hicks等人，2018年）、山地大猩猩（Gorilla beringei beringei；Gomez等人，2016年）和黑猩猩（Pan troglodytes；Hicks等人，2018年）。除了饮食之外，社会性也是肠道微生物组传播和维持的重要途径，并且也被发现是构建非人类灵长类动物肠道微生物组的重要因素（Amato等人，2017年；Moeller等人，2016年；Raulo等人，2018年；Sarkar等人，2020年；Tung等人，2015年；Wikberg等人，2020a，2020b）。对非人类灵长类动物肠道微生物组的研究强调了社会性对肠道微生物组的影响（Archie和Theis，2011年；Archie和Tung，2015年）。Moeller等人（2016年）得出结论，社会性是构建倭黑猩猩和黑猩猩微生物组的重要因素。社会接触、接近性和关联网络对于灵长类动物肠道微生物组的传递和维持至关重要（例如，Amato等人，2017年；Moeller等人，2016年；Raulo等人，2018年；Wikberg等人，2020a，2020b）。因此，社会互动、社会性和群体生活高度预测了非人类灵长类动物肠道微生物组的相似性（Archie和Tung，2015年；Tung等人，2015年；Wikberg等人，2020a，2020b）。这导致许多共享同一社会群体的灵长类动物具有相似的微生物特征（Degnan等人，2012年；Springer等人，2017年）。然而，对于倭黑猩猩（Pan paniscus）而言，社会性或饮食哪个因素对肠道微生物组更为重要，目前尚不清楚。倭黑猩猩是研究社会性和饮食对肠道微生物组影响的优秀模型物种，因为它们与人类在杂食性饮食和分裂-融合社会动态方面具有相似性（Gruber和Clay，2016年；White，1996b）。倭黑猩猩主要以水果为食，据报道它们会和平地分享和食用肉类，甚至会与邻近群体分享肉类（Fruth和Hohmann，2018年；Wakefield等人，2019年；White，1994年）。倭黑猩猩的饮食因具体地点而异，但所有倭黑猩猩都是以水果为主的（Furuichi，1989年；Hohmann和Fruth，2003年；Kano和Mulavwa，1984年；Loudon等人，2019年；Serckx等人，2015年；Wakefield等人，2019年；White，1988年；White，1994年；White，1998年）。据报道，倭黑猩猩的食物包括新叶、昆虫、脊椎动物、陆地草本植物、花朵和肉类（Furuichi，1989年；Hohmann和Fruth，2003年；Kano和Mulavwa，1984年；Loudon等人，2019年；Serckx等人，2015年；Wakefield等人，2019年；White，1988年；White，1994年；White，1998年）。倭黑猩猩的饮食具体取决于它们生活的地点和环境（Fruth和Hohmann，2018年；Kano和Mulavwa，1984年；Oelze等人，2011年；Surbeck和Hohmann，2008年；Serckx等人，2015年）。之前在Iyema进行的研究使用每月的饮食多样性指数得出结论，该地点的倭黑猩猩饮食是所有大猿中最为多样化的（Hickmott等人，2021年）。了解饮食如何影响饮食多样性最高的地点的肠道微生物组，可以揭示饮食和社会性如何构建倭黑猩猩的肠道微生物组。倭黑猩猩作为研究社会性和饮食如何影响肠道微生物组的良好模型，还因为它们生活在每天都会发生分裂-融合的混合雄雌群体中（Gruber和Clay，2016年；White，1996b）。这些分裂-融合事件意味着倭黑猩猩群体的组成会在一天内发生变化（Aureli等人，2008年；White，1988年）。倭黑猩猩像黑猩猩（Pan troglodytes）一样，会建造类似人类床铺或睡眠平台的巢穴（Fruth等人，2018年；Samson等人，2017年；Stewart，2011年）。这种筑巢行为加上它们的分裂-融合群体动态意味着倭黑猩猩与谁一起筑巢通常反映了它们白天与谁社交。因此，筑巢群体、筑巢规模和巢穴之间的距离是衡量倭黑猩猩社会性的指标，我们将其称为“筑巢社会性”。由于可以在这些巢穴下收集粪便样本，因此可以利用这些粪便样本来测试近距离筑巢的倭黑猩猩在肠道微生物组组成上是否比地理距离较远的倭黑猩猩更具相似性。我们的目标是测试筑巢社会性和饮食这两个因素如何构建倭黑猩猩肠道微生物组的变异。我们研究了筑巢社会性和饮食如何构建倭黑猩猩肠道微生物组的α多样性和β多样性，并验证了我们的假设，即由于Lomako森林中的倭黑猩猩表现出高度的亲和力和社会性行为，筑巢社会性将解释倭黑猩猩肠道微生物组变异的更大比例。对于我们的筑巢社会性测量，我们使用了群体信息，包括群体成员身份、群体规模、群体分布和地理距离；对于饮食测量，我们比较了饮食指标，包括主要食物种类和食物类型，以确定筑巢社会性和饮食如何构建倭黑猩猩的肠道微生物组。

**2 方法**

**2.1 数据收集**

研究地点是位于刚果民主共和国Lomako河以北的Iyema野外营地（北纬00°55，东经21°06）。该地点主要由具有坚实土壤的原始森林覆盖，还有一些沼泽（Cobden，2014年；Dupain等人，2000年）。2017年6月至10月期间，作为安特卫普动物园持续驯化项目的一部分，我们跟随倭黑猩猩到它们的夜间巢穴进行数据收集。标记了夜间巢穴的位置，并在第二天早上重新访问每个巢穴。我们试图在每只倭黑猩猩离开巢穴时识别它，并为巢穴中的每个个体收集10毫升粪便样本，放入含有10毫升RNALater的试管中。在每个巢穴下记录了GPS坐标（纬度和经度），并与该巢穴的任何粪便样本相关联。我们在一个15平方公里的路径系统中收集了61个巢穴位置的群体数据。然后我们创建了一个筑巢地图，用于将粪便样本与特定巢穴关联起来（表1）。群体中的巢穴数量被用作群体规模的衡量指标（表1）。一个群体中的平均巢穴数量为6.7个。这个数字不包括太小而无法自己筑巢的婴儿或幼崽，因此可能是群体规模的最小估计值。对于每个群体，我们根据三个类别对群体的分布进行了分类：1=<10米，2=10–40米，3=>40米（表1）。大多数巢穴分布在10–40米范围内，巢穴之间的距离平均约为9米。粪便样本被储存在凉爽干燥的地方，直到被送往俄勒冈大学的分子人类学实验室进行进一步分析。收集后的每个粪便样本中的RNALater剩余部分被带回营地，使用营地炉子干燥，然后放入装有干燥剂的袋子中，用于粪便糖皮质激素分析。

**2.2 饮食数据**

我们使用了每15分钟一次的群体扫描数据（N=498次）。由于本研究关注的是总体每周的饮食模式，因此将饮食数据汇总为每天的主要食物种类和类型（表1）。当观察到进食行为时，我们记录了每个群体成员所消耗的树木种类和植物部分。在这些分析中，我们将整个群体的饮食数据合并，并使用当天最主要的食品种类作为主要的“食物种类”（表1）。我们将当天的主要食物种类定义为当天消耗最多的种类（参见Hickmott等人，2021年关于Lomako地区倭黑猩猩饮食多样性的研究）。我们根据“食物类型”对每种食物进行了分类：水果、花朵、叶子或肉类（表1）。每次粪便收集都与当天的饮食数据相关联。每个群体还与一个“月份”相关联，以考察时间上的差异并控制食物消费的季节性变化（表1）。

**2.3 16S rRNA测序数据**

我们使用QIAamp DNA Mini Stool试剂盒（QIAGEN）从252份保存在RNALater中的倭黑猩猩粪便样本中提取了DNA。然后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit协议在Qubit 2.0荧光计上定量提取后的DNA量（Thermo Fisher Scientific）。所有252个样本的DNA含量至少为1.0 ng/μL，并被送往俄勒冈大学的基因组学和细胞特征核心设施，对细菌16S核糖体RNA的V-4高变区进行测序（补充表1）。使用Illumina 515F和806R引物对样本进行条形码标记，然后在PCR扩增过程中针对这些条形码（Illumina）。我们使用了Illumina MiSeq平台（Illumina）对150对末端序列进行了测序。平均采样深度为79,058 ± 45,272，我们移除了少于315个和超过100,000个的序列。我们使用QIIME2流程处理了这些序列，包括使用DADA2（Caporaso等人，2010年）进行解复用和去噪。我们使用Greengenes分类器来识别和分配扩增子序列变异体（ASVs），作为QIIME2流程的一部分（Caporaso等人，2010年；DeSantis等人，2006年）。然后我们根据QIIME2流程的输出计算了观察到的ASVs。

2.4 数据分析

我们测试了筑巢群体、巢穴数量、巢穴分布、月份、食物种类和食物类型作为预测变量。统计分析在R版本4.0.2中运行（R核心团队，2021年）。食物种类和食物类型是根据当天消耗最多的种类和类型确定的。对于肠道微生物的α多样性（或个体内的多样性），我们使用“vegan”包（McMurdie和Holmes，2013年）在R中计算了观察到的ASVs和Shannon指数。我们使用R的“vegan”包（McMurdie和Holmes，2013年）对筑巢群体、巢穴数量、巢穴分布、食物种类、月份和Shannon指数进行了方差分析（ANOVA），以衡量α多样性。为了研究社会性和饮食对倭黑猩猩肠道微生物组的影响，我们使用“vegan”R包中的“adonis2”函数进行了999次置换的多元方差分析（PERMANOVA）（Oksanen等人，2007年）。我们对肠道微生物的β多样性进行了PERMANOVA分析，使用了Bray–Curtis差异度量和Aitchison距离，以筑巢群体、巢穴数量、巢穴分布、食物种类和月份作为预测变量（表1）。我们使用Aitchison距离，因为它是一个保持潜在群落分类比例的组成平衡度量，与其他度量不同，后者倾向于根据稀有或主导的分类群来加权（Aitchison等人，2000年；Gloor等人，2017年）。我们使用R包“gdm”中的广义差异建模（GDM）（Mokany等人，2022年）来测试地理距离、在筑巢群体中的存在以及两个饮食变量中的一个对β多样性的影响。地理距离是根据巢穴下的GPS坐标点测量的，因此每个与巢穴相关的粪便样本都有相应的纬度和经度。我们使用Aitchison距离作为β多样性的度量，因为它给出了与Bray–Curtis差异度量相似的结果，并且它不根据微生物群落中的稀有或丰富分类群来加权（Aitchison等人，2000年；Gloor等人，2017年）。

3 结果

3.1 α多样性

观察到的ASVs的平均数量为249.7 ± 9.92，置信区间下限为111.5，上限为370.2。四个变量显著解释了α多样性的变化：（1）筑巢群体（F[57, 174] = [3.036]，p < 0.001）（图1和图2），巢穴数量（F[11, 240] = [3.297]，p < 0.001）（图2和图3），食物种类（F[14, 237] = [2.231]，p = 0.007）（图3和图4），以及月份（F[4, 247] = [6.166]，p < 0.001）（图4）。巢穴分布和食物类型没有显著影响。图1：Shannon的α多样性指数与筑巢群体的关系。筑巢群体显著解释了Lomako倭黑猩猩肠道微生物群的α多样性。箱形图按食物类型着色，但这与Shannon指数没有显著关系。图2：Shannon的α多样性指数与巢穴数量的关系。巢穴数量显著解释了Lomako倭黑猩猩肠道微生物群的α多样性，其中10个巢穴的平均Shannon多样性最低，6个巢穴的最高。图3：Shannon的α多样性指数与食物种类的关系。食物种类显著解释了Lomako倭黑猩猩肠道微生物群的Shannon多样性，其中Anothonota frangran和Carpodinous gentili食物种类的Shannon多样性最高，而Strombosiopsis tetandra的食物种类最低。图4：Shannon的α多样性指数与月份的关系。月份显著解释了Lomako倭黑猩猩肠道微生物群的α多样性，其中8月份的α多样性最低，10月份的α多样性最高。我们还测试了另一种α多样性度量Chao指数，并将其与主要变量进行了比较。Chao指数倾向于比Shannon多样性指数更重视群落中的稀有分类群，因此使用Chao指数时，稀有微生物分类群更有可能与显著解释Chao指数变化的五个变量相关。我们发现（1）筑巢群体（F(57, 194) = [2.873]，p < 0.001）（2）巢穴数量（F(11, 240) = [3.243]，p < 0.001），（3）食物种类（F(14, 237) = [3.524]，p < 0.001），（4）食物类型（F(5, 246) = [3.878]，p = 0.002），（5）月份（F(4, 247) = [8.875]，p < 0.001）。巢穴分布没有显著影响。食物类型是两个指数之间唯一的差异变量，这表明罕见的而非常见的肠道微生物分类群可能与食物类型有显著关系。

3.2 β多样性

我们运行了多个模型，使用不同的度量方法来分解每个变量解释的相对百分比方差。我们使用了两种不同的β多样性度量（Bray–Curtis和Aitchison距离），因为它们对多样性的组成部分有不同的权重。对于所有模型，我们都添加了一个月份变量来控制筑巢群体、食物种类和食物类型的季节性变化。我们用来测试社会性和饮食的模型是Bray–Curtis ~ 月份 + 食物类型 + 食物种类 + 筑巢群体。月份显著解释了3.50%的变异，食物类型显著解释了2.35%，食物种类显著解释了4.27%，筑巢群体解释了20.28%的倭黑猩猩肠道微生物组的变异（表2）。我们用来仅测试社会变量的模型是Bray–Curtis ~ 月份 + 巢穴数量 + 巢穴分布 + 筑巢群体。月份显著解释了3.53%，巢穴数量显著解释了4.96%，巢穴分布显著解释了1.28%，筑巢群体解释了19.49%的倭黑猩猩肠道微生物组的变异（表2）。表2：Bray–Curtis对月份、筑巢群体、食物种类、食物类型、巢穴数量和巢穴分布的PERMANOVA结果。β多样性指数

因子 df 平方和 R2 F p

Bray–Curtis 4 3.670 0.03503 2.7179 0.001***

食物类型 5 2.463 0.02351 1.4592 0.001***

食物种类 10 4.474 0.04270 1.3253 0.001***

筑巢群体 48 21.247 0.20279 1.3112 0.001***

残差 216 72.919 0.69597

Bray–Curtis 4 3.670 0.03530 2.7220 0.001***

巢穴数量 11 5.195 0.04958 1.4011 0.001***

巢穴分布 3 1.336 0.01275 1.3212 0.012*

筑巢群体 45 20.416 0.19486 1.3460 0.001***

残差 220 74.156 0.70778

* p < 0.05 *** p < 0.001。我们还对Aitchison距离进行了PERMANOVA，比较了社会性和饮食，模型为：（1）Aitchison距离 ~ 月份 + 食物种类 + 筑巢群体和（2）Aitchison距离 ~ 月份 + 食物类型 + 筑巢群体。我们在模型Aitchison距离 ~ 月份 + 巢穴数量 + 巢穴分布 + 筑巢群体中比较了所有社会变量。Aitchison距离测量了用于比较微生物物种计数的欧几里得距离，然后进行了中心对数比率转换（Aitchison，1982年）。对于模型Aitchison距离 ~ 月份 + 食物种类 + 筑巢群体，月份显著解释了2.60%，食物种类显著解释了5.97%，筑巢群体显著解释了18.26%的倭黑猩猩肠道微生物组的β多样性（表3）。对于模型Aitchison距离 ~ 月份 + 食物类型 + 筑巢群体，月份显著解释了2.60%，食物类型显著解释了2.31%，筑巢群体显著解释了21.38%的倭黑猩猩肠道微生物组的β多样性（图5；表3）。社会性模型显示月份显著解释了2.60%，巢穴数量显著解释了4.39%，巢穴分布显著解释了1.22%，筑巢群体解释了17.05%的倭黑猩猩肠道微生物组的变异（表3）。表3：Aitchison距离对筑巢群体、食物种类、食物类型、巢穴数量和巢穴分布的PERMANOVA结果。β多样性指数

因子 df 平方和 R2 F p

Aitchison距离 4 4377 0.02598 1.9174 0.001***

食物种类 14 10059 0.05970 1.2589 0.001***

筑巢群体 49 30774 0.18265 1.1004 0.001***

残差 216 123277 0.73167

Aitchison距离 4 4377 0.02598 1.9210 0.001***

食物类型 5 3902 0.02316 1.3699 0.001***

筑巢群体 56 36018 0.21377 1.1290 0.001***

残差 218 124190 0.73709

*** p < 0.001。图5：按11个随机筑巢群体着色的Aitchison距离的β多样性可视化。

3.3 广义差异建模（GDM）

为了确定最大、最具影响力的解释变量，并测试共享相同的筑巢群体、食物种类和类型解释了多少β多样性的变化，我们运行了GDMs。GDMs是一种工具，可以用来表征和预测哪些因素影响地理位置和随时间变化的β多样性（Mokany等人，2022年）。GDM分析中的Aitchison距离矩阵显示总解释的百分比方差为7.2%，模型是显著的（表4）。我们发现5.1%归因于共享的筑巢群体，地理距离解释了大约2.1%的变异，而食物类型和种类解释了0.0%的变异（表4）。GDM结果支持社会性比饮食更重要，因为我们的饮食变量在该模型中没有解释任何变异。表4：广义差异模型输出。差异度量

总解释的百分比方差 预测变量 解释的总百分比方差 模型p值

Aitchison 7.2 5.1 0.002**

地理距离 2.1 0.0

4 结论

饮食和社会性已知会影响肠道微生物群的多样性和组成，但每个因素对微生物群的相对重要性因研究的物种而异。饮食已被发现是构建NHP肠道微生物群的重要因素，这很可能是因为微生物在分解食物中的作用（Baniel等人，2020年；Trossvik等人，2018年；Amato等人，2014年，2015年；Mallott等人，2017年；Mallott等人，2018年；Garber等人，2019年；Gomez等人，2016年；Hicks等人，2018年；Gomez等人，2016年；Hicks等人，2018年）。社会性也被发现是解释NHP肠道微生物群大量变异的重要变量（Amato等人，2017年；Moeller等人，2016年；Raulo等人，2018年；Sarkar等人，2020年；Tung等人，2015年；Wikberg等人，2020a，2020b）。然而，饮食和社会性在构建倭黑猩猩（Pan paniscus）肠道微生物群中的相对重要性尚不清楚。倭黑猩猩是研究饮食和社会性对肠道微生物群影响的优秀模型物种，因为它们与人类在杂食性饮食和裂变-融合社会动态方面有相似之处（Gruber和Clay，2016年；White，1996a；White，1996b；White和Wood，2007年）。我们发现倭黑猩猩肠道微生物群的α多样性与处于相同的筑巢群体、巢穴数量、食物种类和月份显著相关。此外，处于相同的筑巢群体解释了β多样性指标（Bray–Curtis差异度和Aitchison距离）中的最大变异。饮食变量解释的β多样性变异量小于社会变量。对于其他社会性指标，巢穴数量和巢穴分布解释的变异量小于处于相同筑巢群体所解释的变异量。我们的GDM结果表明，地理距离解释了Lomako森林倭黑猩猩β多样性的最大百分比变异。这一结果表明，Lomako森林倭黑猩猩个体间肠道微生物群的许多变异是由于它们的社会接近性，这通过地理距离和处于相同筑巢群体来衡量。因此，更紧密的社会接近性增加了倭黑猩猩肠道微生物群之间的相似性，这通过个体间的β多样性指标得到了证明。Lomako森林倭黑猩猩的肠道微生物群受社会变量的驱动。社会接近性或处于相同筑巢群体解释的肠道微生物群变异量大于饮食，这可能是因为倭黑猩猩与其他灵长类动物相比具有更高的亲和力（Gruber和Clay，2016年；White，1996b；Degnan等人，2012年）。其他关于NHP的研究也发现社会接近性在构建肠道微生物群中很重要（Goodfellow等人，2019年；Wikberg等人，2012年）。在吼猴（Alouatta pigra）中，饮食、亲缘关系、社会接触和地理位置与肠道微生物群的差异有关（Amato等人，2017年）。在野生环尾狐猴（Lemur catta）中，社会群体是塑造肠道微生物群组成的重要因素，这表明社会性可能对肠道微生物群的建立、维持和组成至关重要（Bennett等人，2016年）。在安博塞利狒狒种群中，社会性和社交互动，尤其是梳理毛发网络，与肠道微生物群的组成有关（Tung等人，2015年）。这些来自其他新世界猴类的研究结果支持了我们的观点，即社会性和地理位置对于构建新世界猴类的肠道微生物群结构非常重要。社会性和地理距离在确保幼年灵长类动物获得对免疫系统发育至关重要的有益或非致病性微生物种类方面起着重要作用。黑猩猩和倭黑猩猩的社会网络结构和关联模式存在时间变化，这可能对病原体和微生物的传播产生深远影响（Rushmore等人，2013年）。虽然这种时间变化在疾病爆发时可能很重要，但它也可能在维持多样化的、可社会传播的肠道微生物群方面发挥更重要的作用，这对整体免疫系统的发育和健康至关重要。此外，黑猩猩和倭黑猩猩的社会性对于长期保持肠道微生物群的多样性也是必不可少的，并可能有助于免疫系统的功能（Hickmott等人，2022年；Moeller等人，2016年；Moeller等人，2016年）。饮食变量对肠道微生物组变异的解释程度低于社会变量，但饮食仍然对倭黑猩猩的肠道微生物组有一定影响。不同灵长类动物中饮食与肠道微生物群之间的关系已有充分记录（Amato等人，2020年；Bruorton等人，1991年；Burns等人，2017年；Hicks等人，2018年；Stephens等人，2015年）。在多项研究中，饮食被发现在解释肠道微生物群组成方面起着重要作用，例如杂食性的绿猴（Cercopithecus aethiops）和萨曼戈猴（Cercopithecus mitis）（Bruorton等人，1991年）。其他针对三种新世界猴类的研究——果食性的Varecia variegata、杂食性的Lemur catta和叶食性的Propithecus coquereli——也发现饮食确实是肠道微生物组成的重要因素（McKenney等人，2015年）。大猩猩（Gorilla gorilla gorilla）的肠道微生物群研究结果也支持了地理范围和饮食组成可能是调节肠道微生物群组成的重要因素的观点（Gomez等人，2015年）。对两种大猩猩物种（G. g. gorilla和G. b. beringi）的比较表明，肠道微生物群和代谢组显示出与不同饮食相关的显著差异（Gomez等人，2016年）。然而，我们的研究结果表明，虽然饮食对倭黑猩猩的肠道微生物群很重要，但社会性在个体间差异的构建中起着更大的作用。我们研究的局限性在于，研究对象仍处于适应阶段，因此我们使用了间接的社会性测量方法而非直接测量。例如，由于我们无法在全天行为观察中获取详细的梳理毛发网络和社交距离信息，我们使用了诸如筑巢群体中巢穴之间的地理距离等间接指标。然而，这些间接指标确实代表了倭黑猩猩社会性的一个重要方面。倭黑猩猩通常会与下午一起觅食的个体一起筑巢，而睡眠期间是两个个体保持社交接近的最长时间（通常为12小时）（Fruth等人，2018年）。其他局限性还包括我们的饮食测量只是对个体一天内饮食的粗略估计，因为我们无法跟踪各个群体从巢穴到巢穴的移动情况，也无法进行详细的焦点动物采样。我们的数据在量化饮食时没有采用详细的方法。我们对饮食变量的测量仅以一天内主要食物作为当天摄入的食物种类和类型的间接指标。这种数据对于描述饮食来说非常粗略，但由于我们关注的是社会性的总体情况，我们的饮食测量同样也是粗略的，可以很好地反映洛马科森林中倭黑猩猩一天内所吃的食物种类和类型。最后，我们在采样时无法可靠地识别个体，因此无法识别重复采样的个体。理想情况下，我们应该能够每天识别个体并跟踪它们，因为粪便样本是在同一天收集的，而饮食数据可能与微生物组多样性之间的关联并不理想，假设倭黑猩猩的肠道传输时间为1天。我们通过将分析停留在群体层面而非个体层面来解决这个问题，虽然这限制了我们的结论，但我们能够回答关于社会性和饮食对洛马科森林倭黑猩猩肠道微生物群重要性的广泛问题。未来的研究方向之一是对这些样本进行基因分型，以基因方式识别重复采样的个体，并能够在个体层面进一步探讨相关问题。总之，社会性，特别是地理距离这一社交接近性的衡量指标，比饮食更能解释倭黑猩猩肠道微生物群的变异。在我们的社会变量中，地理距离似乎解释了洛马科森林倭黑猩猩肠道微生物群变异的最大部分。这一结果与包括黑猩猩、黑白疣猴、狒狒和西法卡猴在内的多种灵长类动物的研究结果一致。此外，这也与其他研究社会性和倭黑猩猩肠道微生物群的研究结果相符。然而，饮食仍然是一个重要因素，类似于吼猴、黑猩猩和绿猴中的观察结果。未来的研究方向包括探讨性别差异和个体差异，以及饮食和季节性如何影响倭黑猩猩的肠道微生物群。

致谢
我们要感谢以下人士，没有他们的帮助，这项工作无法完成：Jef Dupain、Hugues Akpona和非洲野生动物基金会、Dipon Bomposo、Beken Bompoma、Teddy Bofaso、Christian Djambo、Mathieu Esaola、Bellevie Iyambe、Augustin Lofili、Isaac Lokoli、Gedeon Lokofo、Thomas Lokuli、Joel Bontambe、Abdulay Bokela、Paco Bertolani、Ian Takaoka以及许多在其他方面提供后勤支持和友谊的人士。同时，我们还要感谢灵长类动物骨骼学实验室和分子人类学实验室的成员在整个研究过程中提供的宝贵讨论。我们还要感谢多年来支持这项研究的众多资助机构。2017年的野外考察得到了Leakey基金会对M.L.W.的资助、National Geographic对C.M.B.的专业发展资助（WW-099ER-17）以及Global Oregon Award对C.M.B.的资助。实验室工作得到了Northern Kentucky大学对M.L.W.的资助和奖学金、Oregon大学Gary Smith夏季发展基金、Oregon大学人类学系对AJH的资助以及Oregon大学教员研究奖对F.J.W.的资助。

伦理声明
本研究在Oregon大学机构动物护理和使用委员会（AUP-17-10）的批准下进行，遵守了美国灵长类动物学家协会关于人类灵长类动物伦理处理的准则，并获得了刚果民主共和国负责管理Iyema野外站点所在的Lomako-Yokokala动物保护区的ICCN（许可号3058）的批准。许可是通过非洲野生动物基金会的任务订单（编号033/2017）获得的。

数据可用性声明
这项靶向位点研究项目已存放在DDBJ/EMBL/GenBank，访问号为KFUK00000000。本文描述的版本是第一个版本，KFUK01000000。更多信息请参见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample?Db=biosample&DbFrom=bioproject&Cmd=Link&LinkName=bioproject_biosample&LinkReadableName=BioSample&ordinalpos=1&IdsFromResult=794787。GenBank相关信息包括：SUBID=SUB10902613、BioProject=PRJNA794787、BioSample=SAMN24657338；Accession=KFUK00000000、Organism=gut metagenome。