植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）通过调节TLR4和DC-SIGN基因，在口腔鳞状细胞癌大鼠模型中激活NF-κB信号通路

《Cancer Reports》：Activation of the NF-?B Signaling Pathway by Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei Through Modulation of TLR4 and DC-SIGN Genes in an Oral Squamous Cell Carcinoma Rat Model

　　**摘要**

**背景**
口腔和肠道微生物群的组成被认为与口腔癌（OC）的发展有关。模式识别受体（PRRs）的慢性激活已被证实与多种癌症的侵袭性和不良预后相关。因此，针对PRRs成为癌症预防的一种有前景的策略。

**目的**
研究植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, LP）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei, LC）对口腔鳞状细胞癌（OSCC）大鼠模型中CLRs下游信号通路的影响。

**方法与结果**
在本研究中，我们将35只大鼠分为五组：健康对照组、癌症对照组、接受活LP治疗的组、接受灭活LP治疗的组以及接受活LC治疗的组。我们重点研究了健康对照组和癌症对照组中TLR4、DC-SIGN、NF-κB和BCL2基因的表达情况。我们建立了一个4NQO诱导的大鼠舌癌模型，并使用益生菌乳杆菌进行治疗。随后，我们重新评估了TLR4、DC-SIGN、NF-κB和BCL2基因的表达。通过纸片扩散法确认了LP和LC的抗菌活性。组织病理学分析证实了OSCC的发生。与对照组相比，4NQO处理组中NF-κB、BCL2、DC-SIGN和TLR4基因的表达显著增加。我们的研究结果表明，与健康大鼠相比，活LP和灭活LP以及活LC显著降低了癌症大鼠中NF-κB、BCL2、DC-SIGN和TLR4基因的表达。

**结论**
我们的发现表明，给予LP和LC益生菌可能是治疗OSCC的一种有前景的方法。LP和LC可以通过调节TLR4和DC-SIGN基因的表达来激活NF-κB信号通路。然而，需要进一步的研究来完全阐明这些效应的机制，并确定最佳的治疗剂量和持续时间。

**1 引言**
头颈部癌症的特点是起源于上呼吸道和消化道上皮细胞的恶性肿瘤，这些肿瘤有可能转移到身体的其他部位[1]。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种起源于口腔（包括舌头、牙龈和脸颊）细胞的头颈部癌症[2]。根据世界卫生组织的数据，每年大约有30万例新的口腔癌病例被诊断出来，其中超过90%是OSCC[3]。在伊朗，OSCC是第四大常见癌症，其发病率近年来一直在上升[4]。与其他癌症一样，OSCC受到多种因素的影响，包括生活方式、遗传和环境[5]。新兴的证据表明，饮食因素（如铁缺乏[7]）和感染因子（如人乳头瘤病毒（HPV）[8]也可能在OSCC的发展中起作用[9]。关于OSCC患者微生物组成的研究很少。最近的研究发现，健康个体与OSCC患者的微生物群之间存在显著差异[10, 11]。因此，进行进一步的研究对于加深我们对OSCC生物学机制的理解以及识别能够改善治疗结果的新生物标志物和预测因子至关重要。益生菌是存在于发酵食品和补充剂中的有益微生物，可能具有抗癌特性，并能增强免疫系统对抗癌症的能力[12]。一些最常见的益生菌包括乳杆菌[13]、双歧杆菌[14]和酿酒酵母亚种Boulardii[15]。乳酸菌在益生菌中尤为重要，乳杆菌和双歧杆菌是消化系统和发酵食品的天然成分[16]。人们越来越关注探索益生菌作为辅助疗法在癌症治疗中的潜在用途[17]。干酪乳杆菌（L. casei, LC）已被用作食品工业中的益生菌，并可能具有抗癌特性[18-20]。然而，研究表明，植物乳杆菌（L. plantarum, LP）可以通过减少炎症和促进口腔微生物组中有益细菌的生长来改善口腔健康[21, 22]。一些研究还表明，LP具有抗癌特性，可以抑制OSCC细胞的生长和扩散[23]。目前尚不清楚导致LC和LP诱导癌细胞死亡的精确免疫学因素；细菌的病原相关分子模式（PAMPs）可能通过模式识别受体（PRRs）激活先天免疫。PRRs是先天免疫系统细胞使用的蛋白质，有助于细胞摄取病原体并介导抗菌和促炎效应[24, 25]。已知的模式识别受体包括Toll样受体（TLRs）[26]、Nod样受体[27]、RIG-I样受体[28]、C型凝集素受体（CLRs）[29]和环GMP-AMP合成酶[30]。TLR4是一种在调节炎症和免疫反应中起关键作用的中心受体[31]。NF-κB转录因子控制与细胞存活、增殖、凋亡、侵袭和转移相关的靶基因的转录[32]。CLRs在识别病原体和调节免疫反应中也至关重要，其中DC-SIGN是一种特异性受体，能够识别病毒、细菌和真菌上的高甘露糖N-糖苷[29]。最近的研究表明，DC-SIGN除了作为粘附分子外，还可以通过调节TLRs来启动先天免疫[22]。因此，本研究旨在了解LP（灭活或活）和LC对OSCC大鼠模型中CLRs下游信号通路的影响。本研究使用4NQO诱导的大鼠模型来探讨LP和LC对OSCC的影响，检查它们在调节免疫相关基因（TLR4、DC-SIGN、NF-κB和BCL2）中的作用，并比较活菌与热灭活菌的治疗潜力。鉴于OSCC发病率的上升和治疗选择的有限，这项研究强调了益生菌作为未来癌症治疗的有希望的替代方案。

**2 材料与方法**
2021年4月至3月期间，在伊朗戈勒斯坦医科大学（GoUMS）先进医学技术学院干细胞研究中心进行了一项实验研究。从波斯类型培养物收藏中心（PTCC）获得了干酪乳杆菌（L. casei, PTTC:1608）和植物乳杆菌（L. plantarum, ATTC:8014）用于治疗大鼠的口腔癌。使用MRS琼脂（HiMedia, Mumbai）作为标准培养基来培养这些微生物。通过一系列生化测试确认了LP和LC的益生菌特性。用于治疗的乳杆菌悬浮液含有约10^8 CFU/mL的细菌浓度，并制备在0.85%的盐水中。为了评估在MRS琼脂上生长的乳杆菌的特性，进行了多种测试，包括显微镜检查（革兰氏染色）、过氧化氢酶活性测定、在不同NaCl浓度下的生长情况以及碳水化合物的发酵情况。此外，还评估了其对胆汁和酸的耐受性以及抗生素敏感性[33]。

**2.2 动物分组与处理**
从伊朗马赞德兰省阿莫尔的巴斯德研究所获得了35只平均体重为300克的雄性Wistar大鼠。这些大鼠被隔离至少1周，并接受了体检以确保它们适合进行研究。它们被关在带有硬木垫料的聚碳酸酯鞋盒笼子里，每笼7只大鼠，置于无窗房间内，光照/黑暗周期为12/12小时。标准维护条件为18°C–22°C、20%–25%的湿度。大鼠可以自由获取Purina 5001实验室饲料和自来水，每周更换两次。大鼠被分为五组：第1组（n=7）作为对照组，仅给予食物和自来水；第2组（n=7）接受4NQO处理以诱导癌症；第3组（n=7）在致癌后接受活LC处理2周；第4组（n=7）接受活LP处理；第5组（n=7）接受灭活（加热）LP处理（图1）。所有动物实验均得到了伊朗达姆甘伊斯兰自由大学研究伦理委员会的批准（代码编号：1401.002）。

**2.3 生成4NQO诱导的OSCC动物模型**
为了诱导大鼠的OSCC，口服给予来自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）的4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）。通过腹腔注射氯胺酮对大鼠进行麻醉，并在用4NQO溶液处理前用3号骆驼毛刷擦拭它们的舌头。处理后的一小时内，大鼠不允许饮水。将含有20 ppm该物质的溶液溶解在丙二醇中，每周给大鼠注射三次，持续16周[34]。每次使用新鲜的溶液，并每周称重大鼠并检查它们舌头的外观变化。

**2.4 获取组织样本和病理检查**
16周后，对大鼠进行麻醉，然后使用CO2箱实施安乐死。通过穿刺活检获取组织样本。将腭黏膜和舌头切成两半，测量任何可见的异常，并在液氮中冷冻后储存在-70°C。腭黏膜沿垂直平面切割，而舌头则沿水平方向切割。冷冻组织切成6–8 μm厚的切片，固定在10%甲醛中，并用苏木精和伊红（H&E）染色。

**2.5 实时PCR基因表达测定**
本研究利用实时PCR来评估致癌前后大鼠血液样本中TLR4、NF-κB、DC-SIGN和BCL2的表达。使用RNeasy KMini试剂盒（Yekta Tajhiz Azma, 德黑兰, 伊朗）从0.5–1 mL全血中提取RNA，并通过光密度测量和凝胶电泳评估其数量和质量。使用QuantiTect逆转录试剂盒（Yekta Tajhiz Azma）合成cDNA，并使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Yekta Tajhiz Azma）进行RT-PCR。在Stratagene Mx3000P上进行三次重复的比较实时PCR。Oligo7程序生成了所使用的引物对（表1）。实时PCR的温度程序如下：95°C（10分钟），39个循环（每个循环95°C 15秒，60°C 20秒，72°C 20秒）。使用2^-ΔΔCt方法评估基因表达的变化倍数，以肌动蛋白作为内参基因[28, 29]。引物列表见表1。

**2.6 统计分析**
数据分析旨在比较对照组与LC或LP处理组之间TLR-4、NF-κB和DC-SIGN基因表达的差异。使用p值<0.05来评估统计显著性。基因表达水平通过双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey事后检验来确定。

**3 结果**
3.1 乳杆菌的抗菌活性
使用改良的双层培养方法评估了LC和LP完整培养物对病原菌（包括大肠杆菌（PTCC: 1396）和金黄色葡萄球菌（ATCC: 25923）的抗菌活性。结果显示，LC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平均生长抑制直径分别为34毫米和33.2毫米。同样，LP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果分别为33毫米和35毫米（图2）。使用硝呋妥因和复方新诺明作为对照进行比较。

**3.2 临床和病理发现**
暴露于致癌化合物4NQO后，大鼠的体重在16周内下降。这种体重下降在图3中有所体现，并从实验开始每周进行测量。在对照组大鼠的口腔腭黏膜或其他黏膜表面未发现肿瘤（图4a）。此外，在接受4NQO治疗的大鼠中，直到第8周都没有观察到任何肉眼可见的变化。然而，从第10周开始，观察到舌头出现白色增厚现象，并且腭部结构有些模糊。此外，在接受4NQO治疗的大鼠体表没有发现转移灶或区域淋巴结肿胀的迹象。图3（在图查看器中打开）PowerPoint

Wistar大鼠在不同时间点的体重变化。结果显示，随着时间的推移，接受4NQO治疗的大鼠体重逐渐下降。L. casei Z：活的L. casei；L. plantarum D：死的L. plantarum。图4（在图查看器中打开）PowerPoint

4NQO治疗前后小鼠舌部肿块的病理学发现。(a) 正常大鼠舌上皮的显微观察结果。(b) 接受4NQO治疗的大鼠舌组织切片显示恶性上皮肿瘤。肿瘤细胞表现出异常特征，包括角蛋白颗粒的形成；受影响区域周围也观察到强烈的淋巴细胞浸润。该肿块被诊断为分化良好的鳞状细胞癌(SCC)。(c) 接受Lactobacillus plantarum治疗的大鼠舌肿块切片。显微镜切片较低层次的角蛋白细胞比例较低，表明较高层次的组织正在愈合。(d) 接受Lactobacillus casei治疗的大鼠舌组织切片。在该切片中，较低层次的角蛋白细胞比例也较低。（组织中的变形和肿瘤细胞用箭头标出）。此外，接受4NQO治疗的大鼠的舌头大小有所增加。在致癌过程中，后舌背出现了白斑、侵蚀、溃疡和乳头状改变等肉眼可见的变化。病理学变化从增生（HP）和轻度至中度异型增生（mmDP）发展到重度异型增生（sDP）和原位癌（ISC），并进一步发展为分化良好的侵袭性鳞状细胞癌（SCC）。病变的严重程度与治疗时间相关；例如，接受4NQO治疗9周、13周和16周的大鼠中，舌癌的发病率分别为50%、62.5%和77.8%（图4b）。图4c显示了接受LP治疗的大鼠舌组织切片。显微镜切片较低层次的角蛋白细胞比例较低，表明较高层次的组织正在愈合。接受LC治疗的大鼠舌组织切片显示较低层次的角蛋白细胞比例较低（图4d）。

3.3 活菌与死菌乳酸菌的DC-SIGN表达比较

活菌LC组与死菌LP组之间的DC-SIGN基因表达没有显著差异；两组都将目标基因的表达降低了相似的程度。活菌LP组的该基因表达与前两组不同，被单独归为一类，如图5所示（p值<0.0001）。我们的研究发现，LC组的DC-SIGN平均表达量为1.249，而死菌LP组的平均表达量为3.295。另一方面，癌组的DC-SIGN平均表达量为9.945，与前三组有显著差异。换句话说，癌组的DC-SIGN表达较高，而益生菌降低了癌鼠中的这种表达（图5）。图5（在图查看器中打开）PowerPoint

不同组别的DC-SIGN基因表达。在癌组中，DC-SIGN表达增加，而本研究中使用的益生菌降低了癌鼠中的这种表达。活菌Lactobacillus casei与死菌Lactobacillus plantarum之间没有显著差异（ANOVA后进行Tukey事后分析），两者都将目标基因的表达降低了几乎相同的程度。****p值<0.0001。

3.4 活菌与死菌乳酸菌的TLR4基因表达比较

我们的研究发现，在大鼠癌症初期TLR4表达增加。然而，我们观察到给予益生菌后，这种基因的表达显著降低（图6）。活菌LC组与死菌LP组之间的TLR4基因表达没有显著差异，两组都表现出相似程度的降低。LC组的TLR4平均相对表达量为-0.97，死菌LP组的TLR4平均相对表达量为-0.731。相比之下，癌组的TLR4平均相对表达量为9.884（p值<0.0001）（图6）。图6（在图查看器中打开）

不同组别的TLR4基因表达。在癌组中，TLR4表达增加，而本研究中使用的益生菌降低了癌鼠中的这种表达。活菌Lactobacillus casei与死菌Lactobacillus plantarum之间没有显著差异（ANOVA后进行Tukey事后分析），两者都将目标基因的表达降低了几乎相同的程度。****p值<0.0001。

3.5 活菌与死菌乳酸菌的NF-κB基因表达比较

研究表明，益生菌可以降低癌鼠中升高的NF-κB基因表达。根据图7中的数据，接受死菌LP治疗与活菌LP治疗的组别之间NF-κB基因表达没有显著差异。此外，所有三组（包括活菌LC组）的目标基因表达降低的程度相似。图7显示，活菌LP组的NF-κB相对表达量为-2.635，死菌LP组的平均NF-κB相对表达量为0.676，而活菌LC组的NF-κB平均相对表达量为1.095。相比之下，癌组的NF-κB平均表达量为12.483，与其他三组有显著差异（p值<0.0001）。图7（在图查看器中打开）

不同组别的NF-κB基因表达。在癌组中，NF-κB表达增加，而本研究中使用的益生菌降低了癌鼠中的这种表达。活菌Lactobacillus casei与死菌Lactobacillus plantarum之间没有显著差异（ANOVA后进行Tukey事后分析），两者都将目标基因的表达降低了几乎相同的程度。****p值<0.0001。

3.6 活菌与死菌乳酸菌的BCL2基因表达比较

图8中的结果表明各组之间存在显著差异。具体来说，接受活菌LP、活菌LC和死菌LC治疗的组别中BCL2基因表达均降低。图8中的数据显示，活菌LP的平均BCL2表达量为0.694，活菌LC的平均表达量为1.486，死菌LP的平均表达量为2.655。相比之下，癌组的BCL2相对表达量为12.595，与其他三组有显著差异（p值<0.0001）。这些发现表明，癌组中的大鼠BCL2表达最高，而益生菌治疗显著降低了所有治疗组中的BCL2表达。图8（在图查看器中打开）

不同组别的BCL2基因表达。结果显示癌鼠中的BCL2基因表达增加，而益生菌降低了BCL2表达。各组之间存在显著差异，接受活菌Lactobacillus plantarum、活菌Lactobacillus casei或死菌Lactobacillus plantarum治疗的组别中BCL2基因表达均降低。****p值<0.0001。

4 讨论

口腔癌（OC）是全球第16大常见癌症，在伊朗也是十大常见癌症之一[3, 4]。最近的研究表明，这种癌症与口腔和肠道微生物群的组合有关[11]。在实验室动物上进行的研究表明，益生菌可能通过抑制肿瘤生长来降低癌症风险[31]。虽然预防和及时诊断对于管理癌症的不可逆并发症至关重要，但开发非侵入性和有效的治疗方法以替代当前的侵入性治疗手段（如手术、化疗、放疗等）并减轻其众多副作用具有极其重要的意义[35]。作为最常见的胃肠道癌症之一，口腔癌由于其诊断延迟而成为十大死亡原因之一。这通常是由于早期阶段没有症状、临床表现与其他病变相似以及临床表现的多样性等多种因素造成的[36]。随着癌症治疗的最新进展，包括靶向治疗和免疫治疗，人们对成功治疗各种类型的癌症（包括口腔癌）重新抱有希望[37]。虽然遗传因素在癌症风险中确实起作用，但个体的免疫状态也与益生菌和典型的肠道菌群密切相关，因此也有重要影响。利用特定细菌的特性进行癌症预防和治疗使益生菌菌株成为一种有前景的选择[38]。临床研究表明，益生菌摄入可以增强自然杀伤细胞（NK细胞）的活性和免疫球蛋白水平。此外，Askari等人发现，食管癌患者的BCL2表达（2.04%）高于正常组织[39]。我们的研究证实，益生菌治疗可以降低BCL2表达，表明癌细胞的凋亡潜力增加。本研究旨在评估LP和LC作为口腔癌动物模型中有前景的益生菌治疗选项的治疗效果。具体来说，我们旨在研究凝集素受体的下游信号通路，包括NF-κB、DC-SIGN、TLR4和BCL2的调节作用。在本研究中，我们发现LP（死菌和活菌）降低了癌鼠中DC-SIGN、TLR4、NF-κB和BCL2的相对表达。Pasterkamp等人证明DC-SIGN可以通过调节TLR信号来启动针对肥大细胞的先天免疫反应[40]。TLR由多种细胞类型表达，包括抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）、成纤维细胞和上皮细胞[26]。然而，Ridnour等人研究了TLR表达与癌症预后的关系。例如，同一受体在不同癌症中可能与良好的或不良的结果相关（如TLR9），或者通常与不良结果相关（如TLR4）[41]。这种复杂性突显了在癌症发生和进展中研究TLR的挑战，并表明在不同类型的癌症中研究单一受体可能不是最有效的方法。我们的研究表明，癌组中的DC-SIGN表达显著增加，但在益生菌治疗后显著降低。此外，OSCC大鼠中的TLR4表达显著上调，表明其在促进肿瘤进展和炎症中的作用。然而，我们也提供了新的证据，表明益生菌治疗显著降低了TLR4表达，表明通过益生菌干预靶向TLR4可能有助于抑制肿瘤相关的炎症和免疫逃逸机制。TLR随后被激活并招募免疫细胞内的其他蛋白质，从而放大抗原诱导的信号通路。招募的蛋白质激活下游蛋白质，包括蛋白激酶，进而放大信号并最终导致调节炎症反应和基因转录的基因上调或下调[42]。这些过程影响不同的细胞群体，如癌干细胞、癌细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤相关成纤维细胞，这些细胞可能表现出不同的TLR表达和对TLR刺激的反应[43]。本研究中观察到接受乳酸菌治疗的小鼠中DC-SIGN表达降低，可能有助于改善癌症预后并减少侵袭性。乳酸菌仅影响TLR4，DC-SIGN表达的降低伴随着TLR4表达的降低，这可能导致癌细胞激活减少。我们还评估了活菌和死菌LP以及活菌LC治疗对癌鼠TLR4基因表达的影响，并与对照组进行了比较。结果显示，癌组与接受细菌治疗的三个组之间存在显著差异。细菌治疗组的TLR4表达低于癌组，其中活菌LP治疗组的降低更为明显。因此，可以推断活菌LP在降低TLR4基因表达方面更为有效。夏等人的研究与我们的一致，发现LP和LC在减少上皮损伤指数和改善结肠健康（提高10%–30%）方面比其他菌株有效两到三倍，同时保持了患结肠炎大鼠的上皮屏障的完整性。该研究还表明，益生菌的抗炎作用与小鼠结肠组织中hemoxygenase-1（HO-1）表达的增加以及TLR4/MyD88/NF-kB通路表达的减少有关。此外，他们还表明，补充LP可以部分减轻由DSS（三甲基硅丙基磺酸钠）治疗引起的肠道微生物群失调[44]。刘等人发现LP能够调节与脂质转移和TLR4/NF-κB信号通路激活相关的基因表达，这与我们的发现一致[45]。Elshaer等人强调了LP通过抑制TLR4/CXCL9/PREX-2在预防肝硬化中的作用，并发现与我们的研究一致，早期给予LP可以显著降低TLR4、CXCL9和PREX-2的表达，同时改善肝功能并防止病理变化[46]。然而，需要注意的是，TLR4不仅存在于癌细胞中，也存在于免疫细胞中，正如这项研究所评估的那样。因此，这个标志物可能具有双重效应，就像一把双刃剑。虽然乳酸菌在癌细胞中的激活可能减缓癌症进展，但在免疫细胞中的同时激活可能会增加炎症，并对癌细胞的反应产生矛盾的影响。为了全面理解这些矛盾，建议在更广泛的研究中进行评估。在当前的研究中，评估了接受活LP和死LP及LC治疗的对照组和癌组中的NF-κB基因表达。结果显示，接受活LP治疗的组与癌对照组之间存在显著差异。接受活LP治疗的组中NF-κB基因表达的降低更为明显。这些结果与黄等人的研究结果一致[47]，他们也报告了癌细胞中NF-κB表达的增加以及乳酸菌治疗后NF-κB表达的显著降低。岳等人对LP及其无细胞上清液对小鼠结肠癌的影响进行了研究。结果表明，这种治疗通过调节免疫系统、减少炎症细胞因子（IL-6、IL-17F和IL-22）的表达以及限制炎症细胞的浸润来预防结肠肿瘤和黏膜损伤。此外，LP抑制了NF-κB和Wnt信号通路的激活，同时将肠道微生物群组成恢复到与野生型小鼠相似的水平[48]。青等人发现LP可以预防黄曲霉素B1（AFB1）和霉菌毒素引起的慢性肝损伤。这是通过调节TLR2/NF-κB和TLR4/NF-κB通路来实现的，从而导致抗炎细胞因子的分泌[49]。在这项研究中，评估了接受活LP和死LP及LC治疗的对照组和患者组中的BCL2基因表达。癌组显示出最高的BCL2基因表达，而益生菌治疗则导致所有治疗组中的BCL2基因表达显著降低[50]。Sentürk等人研究了LP的次级代谢物对人类乳腺癌细胞系（MCF-7）和黑腹果蝇的毒性。研究发现，这两种物种中抗凋亡基因BCL2和BUFFY（BCL2-48AE）的表达水平降低，而凋亡基因DECAY（与Apopain/Yama相关的死亡执行者半胱天冬酶）、FADD（通过死亡结构域与Fas相关）和RAS64B（64B位的Ras癌基因）在果蝇中的表达增加[51]。Kim等人证明LP提取物抑制了金黄色葡萄球菌在人类上皮细胞系HT-29中诱导的细胞死亡[52]。我们关于LC对OSCC大鼠模型影响的研究发现，活LC治疗组与癌对照组之间存在显著差异。具体来说，LC治疗组的DC-SIGN基因平均表达为1.249，显著低于癌组的9.945。Soltan Dallal等人证明了LC在实验动物模型中预防移植肿瘤生长的有效性[53]。我们还发现，接受LC治疗的组中TLR4基因的平均表达为0.97，与癌组的平均9.884有显著差异。Chung等人的研究与我们发现一致，评估了LC对结肠相关微生物群、黏膜细胞因子平衡和TLR表达的影响。研究发现，直肠给予LC显著降低了TLR-4和IL-1β的mRNA水平，同时显著增加了黏膜IL-10水平[54]。Watanabe等人研究了LC对吲哚美辛引起的小肠损伤的影响。与当前研究相反，他们的发现表明，一周的活LC治疗增加了小肠中的乳酸浓度，抑制了髓过氧化物酶活性的增加，并减少了TNF-α mRNA的表达。然而，这种治疗并未影响TLR4。重要的是要记住，激活TLR4通路可能会触发炎症反应，增强癌细胞的致癌潜力，并帮助它们逃避免疫系统。因此，与OC细胞相比，本研究中特定乳酸菌处理组观察到的TLR4表达降低可能有利于减少TLR4依赖的炎症，最终降低癌细胞的致癌潜力。根据当前研究的发现，LC治疗组的NF-κB平均表达为1.095，显著低于癌组的12.483。这些结果与刘等人的研究一致，他们报告了乳酸菌对NF-κB相关通路的抑制或调节作用，导致该基因表达降低[45]。Tilborghs等人表明，NF-κB信号通路在许多恶性肿瘤中持续激活，特别是在胃肠道癌症中，导致异常的细胞增殖和分化、转移增加以及治疗抵抗[55]。本研究证明，乳酸菌治疗导致NF-κB的表达降低，与癌组织相比。因此，预计肿瘤的细胞增殖、存活、血管生成、炎症和转移将会减少。然而，需要进一步的研究来更详细地评估这些假设。当前研究还发现，LC治疗组的BCL2平均表达为1.486，显著低于癌组的12.595。癌细胞中BCL2的过表达可能会抑制促凋亡信号，使癌细胞在压力条件下存活。Kang等人报告说，高水平的促凋亡蛋白随后通过增加的BCL2表达被清除，可能导致一种称为“原发状态”的现象[56]。本研究显示，接受乳酸菌治疗的组中BCL2的表达低于癌组，表明表达降低可能与细胞增殖、存活、血管生成、炎症和肿瘤扩散的减少有关。然而，需要进一步的研究来更详细地评估这些假设。我们还比较了活LP和死LP与LC的效果。这些结果表明，暴露于活LP、死LP或LC的癌细胞表现出TLR、DC-SIGN、BCL2和NF-κB基因的表达降低，与癌对照组相比。然而，各组之间的基因表达比较显示，活LP对癌细胞的抑制效果优于死LP或活LC。此外，活LP和LC中这些基因的表达降低速率相似，表明这两种细菌具有相当的抗癌特性。因此，我们得出结论，活LP是测试菌株中对癌细胞最有效的细菌。

5 结论
在这项研究中，使用4NQO诱导的OC动物模型来研究LP和LC益生菌在正常免疫反应条件下的潜在治疗效果。在确认模型后，评估了益生菌对DC-SIGN、TLR4、NF-κB和BCL2基因的影响。尽管接受活LC和活LP或死LP的三个组之间没有显著差异，但所有治疗组的这些基因表达都显著低于癌组。这种基因表达的降低表明慢性炎症和炎症因子及细胞因子的产生减少，同时增加了诱导癌细胞凋亡的可能性。总体而言，使用益生菌，特别是乳酸菌，可以积极影响下游信号通路，如NF-κB。

6 局限性和优势
这项研究表明LP和LC通过调节免疫通路（包括NF-κB、TLR4和DC-SIGN）对OSCC治疗具有潜力。使用OSCC大鼠模型增强了其相关性，而分子和组织病理学分析提供了对益生菌效果的全面评估。比较活菌和死菌提供了关于细菌在癌症调节中的活力的见解。伦理合规性确保了研究的可信度，进一步证明了益生菌作为一种有前景的治疗方法。然而，这项研究也有局限性。它缺乏长期肿瘤进展分析，以评估益生菌对肿瘤生长和转移的持续影响。详细的免疫学评估，包括细胞因子分析，将增强机制上的理解。缺乏在人类OSCC细胞系中的验证限制了其转化应用的可行性。此外，没有探索益生菌剂量和微生物组组成的变化，限制了对其效果的全面理解。通过剂量-反应研究和微生物组分析来解决这些空白对于阐明益生菌在OSCC治疗中的治疗潜力至关重要。

作者贡献
Vahideh Faghanizadeh：调查、撰写——初稿、审阅和编辑、正式分析、数据管理。
Malihe Naderi：撰写——初稿、方法学、审阅和编辑、正式分析。
Nazila Arbab Soleimani：概念化、调查、资金获取、撰写——初稿、审阅和编辑、可视化、验证、方法学、软件、正式分析、项目管理、资源管理、数据管理、监督。
Ayyoob Khosravi：概念化、方法学、项目管理、监督、撰写——初稿、审阅和编辑。
Mohammad Mahdi Forghanifard：撰写——初稿、审阅和编辑、方法学、数据管理、软件。

致谢
我们感谢G0UMS高级医学技术学院的实验室工作人员。

资金
这项研究没有接受任何外部资助。所有费用均由作者个人承担。

伦理声明
我们确认这项动物研究已获得伊朗达姆甘伊斯兰阿扎德大学动物研究伦理委员会的批准，批准号为1401.002。我们尽一切努力最小化动物的不适、痛苦，并且研究是按照最高的伦理和科学标准进行的。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据可根据合理请求从相应作者处获得。