NAT10依赖的ac4C mRNA修饰程序性调控系统性硬化中成纤维细胞的致病性

《Pharmacological Research》：NAT10-dependent ac4C mRNA modification programs fibroblast pathogenicity in systemic sclerosis

　　

系统性硬化（Systemic sclerosis, SSc）以由真皮成纤维细胞持续活化驱动的进行性纤维化为特征，然而维持成纤维细胞致病性的表观遗传和表观转录组机制仍未完全阐明。本研究探讨了N-乙酰转移酶10（N-acetyltransferase 10, NAT10）介导的N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine, ac4C）RNA修饰在成纤维细胞活化和纤维化重塑中的作用。整合单细胞转录组学、人SSc皮肤样本、体外实验、体内模型以及成纤维细胞特异性敲除小鼠的分析表明，NAT10在致病的成纤维细胞群体中上调，并促进了纤维化进展。NAT10的基因敲除或药理学抑制在不同实验体系中均减弱了成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积。多组学分析鉴定出COL11A1和ZNF621是与NAT10相关的下游靶点，并在两种转录本上检测到位点特异性的ac4C修饰。从机制上讲，NAT10依赖的ac4C沉积与这些促纤维化基因的mRNA稳定性和转录输出增加相关。值得注意的是，抑制ZNF621可部分逆转由NAT10过表达诱导的促纤维化表型，支持了其在下游的功能相关性。总之，这些发现定义了一种参与SSc中成纤维细胞活化的表观转录组机制，并提示靶向NAT10-ac4C轴可能代表纤维化疾病的一种潜在治疗策略。

研究背景与目的

系统性硬化（Systemic sclerosis, SSc）是一种以微血管损伤、免疫失调和由持续活化的真皮成纤维细胞驱动的进行性组织纤维化为特征的严重自身免疫性疾病。尽管免疫调节疗法改善了炎症控制，但其对已形成纤维化的疗效仍然有限。越来越多的证据表明，允许的遗传背景与表观遗传失调共同作用，在SSc中维持病理性的成纤维细胞活化。虽然DNA甲基化和组蛋白修饰已被广泛研究，但这些基于染色质的机制本身并不能完全解释纤维化转录程序的稳定性，表明转录下游存在其他调控层次的参与。表观转录组RNA修饰已成为慢性纤维化疾病中基因调控的另一个层次。其中，N4-乙酰胞苷（ac₄C）可增强mRNA稳定性和翻译效率，并保护转录本免于降解。ac₄C依赖性调控已被证实与血管生成、细胞命运决定和纤维化重塑有关。然而，ac₄C是否以及在多大程度上促成SSc中的成纤维细胞活化，以及哪些转录本受到该修饰的功能性调控，尚不清楚。ac₄C是一种保守且丰度较高的RNA修饰，代表了RNA上唯一已知的乙酰化标记，其普遍性与5′ 7-甲基鸟苷帽相当。其沉积由N-乙酰转移酶10（NAT10）催化，NAT10是一种与mRNA稳定性和翻译控制相关的GCN5相关N-乙酰转移酶（GNAT）。基于这些观察，研究人员假设NAT10介导的ac₄C修饰通过稳定包括COL11A1和ZNF621在内的纤维化相关转录本，促进了成纤维细胞的活化。

研究方法概述

研究人员整合运用了多种关键技术与模型。样本来源包括健康志愿者和SSc患者的皮肤活检组织，所有SSc患者均符合美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟的标准。核心技术方法主要包括：1. 单细胞转录组测序分析，用于描绘SSc皮肤组织中GNAT家族成员的表达谱和成纤维细胞异质性。2. 免疫组织化学、免疫荧光染色、蛋白质印迹和RT-qPCR等技术，在蛋白和mRNA水平验证NAT10、ac₄C水平及相关纤维化标志物的表达。3. 体外功能实验，包括在人类真皮成纤维细胞（HDFs）中进行的基因沉默（siRNA）、基因过表达、药理抑制（使用Remodelin）、细胞划痕愈合、克隆形成和细胞周期分析等。4. 体内功能验证，建立了博来霉素（Bleomycin, BLM）和TGF-β受体I活化诱导的小鼠皮肤纤维化模型，并使用了成纤维细胞特异性敲除（Col2a1-Cre^ERT2; Nat10^flox/flox）小鼠。5. 多组学分析，包括ac₄C-RIP-seq（RNA免疫沉淀测序）以鉴定NAT10介导的ac₄C修饰的转录本，以及RNA测序进行转录组和通路富集分析。6. 生物信息学分析，利用公共数据库（如GEO）和计算工具（如PACES、PLIP）预测和验证ac₄C修饰位点及相互作用。

研究结果与解读

3.1. NAT10在高增殖性乳头状成纤维细胞中选择性诱导

研究人员通过单细胞转录组测序分析了SSc皮肤组织。分析鉴定出12种主要细胞类型，并发现健康与SSc皮肤之间细胞比例存在显著改变。在GNAT家族成员中，NAT10是唯一在SSc患者皮肤中一致上调的成员，特别是在具有高增殖能力的乳头状成纤维细胞亚群中表达显著升高。免疫组化和免疫荧光染色证实，NAT10在SSc纤维化真皮中表达增加，且与成纤维细胞标志物波形蛋白（Vimentin）共定位，但与免疫细胞标志物（CD3, CD68）重叠较少。蛋白质和mRNA水平分析及ac₄C斑点印迹均显示，NAT10及其催化的ac₄C修饰水平在SSc皮肤中升高。这些结果表明NAT10在致病的成纤维细胞亚群中优先上调，并与SSc中ac₄C修饰增加相关。

3.2. NAT10在多种纤维化模型中持续上调

研究人员在博来霉素（BLM）注射和TGF-β受体I活化诱导的小鼠皮肤纤维化模型中进一步评估了NAT10的作用。免疫组化显示，在纤维化进展过程中，NAT10在真皮中的表达增加，并主要富集在波形蛋白（Vimentin）阳性的成纤维细胞中。在体外，划痕实验、M5细胞因子混合物或TGF-β1刺激均可诱导人真皮成纤维细胞中NAT10的表达上调。来自SSc患者的原代成纤维细胞在mRNA和蛋白水平也表现出更高的NAT10表达和更强的纤维化活性。此外，在肾纤维化和伤口瘢痕等其他纤维化背景下，NAT10表达同样升高。这些发现表明NAT10在多种纤维化环境中持续上调，并与纤维化进展相关。

3.3. NAT10是成纤维细胞增殖和迁移的重要调节因子

为了明确NAT10在成纤维细胞活化中的功能作用，研究人员在HDFs中沉默了NAT10。NAT10敲低显著降低了纤维化标志物（α-SMA、CTGF、COL1A1）的表达，并损害了成纤维细胞的迁移能力。同样，使用Remodelin进行药理学抑制也减弱了TGF-β1诱导的纤维化标志物表达和细胞迁移。RNA测序分析显示，TGF-β1刺激富集了与核糖核蛋白复合物生物发生和G2/M细胞周期转换相关的通路，而NAT10敲低则使基因特征转向细胞迁移、ECM重塑和运动减少。功能上，NAT10沉默或抑制减弱了TGF-β1诱导的S期和G2/M期细胞群扩增，并抑制了集落形成能力。这些结果表明NAT10促进了成纤维细胞的增殖和迁移。

3.4. NAT10在SSc中加重皮肤纤维化

研究人员在HDFs中进行了NAT10的慢病毒过表达。NAT10过表达与CTGF、COL1A1和α-SMA在mRNA和蛋白水平升高相关，免疫荧光分析显示Ki67和波形蛋白阳性增加，表明增殖和肌成纤维细胞相关特征增强。相反，NAT10敲低或Remodelin抑制降低了这些标志物。功能上，NAT10增强了成纤维细胞的迁移能力，而这种效应可被siNAT10或Remodelin逆转。这些结果证明NAT10自主驱动成纤维细胞活化和基质产生表型，从而独立于上游TGF-β活化而加重纤维化。

3.5. 鉴定NAT10介导的ac₄C修饰的转录本

为了确定与NAT10相关的ac₄C调控情况，研究人员在野生型和NAT10沉默的HDFs中进行了ac₄C-RIP-seq。基序分析显示ac₄C修饰区域内富集了CXX共有序列。ac₄C峰主要定位于编码区（CDS）和3′-UTR。整合乙酰化水平降低的峰与转录组变化，研究人员鉴定出与ECM组织、DNA链延伸和胶原转换相关的NAT10调控基因模块。通过验证，ZNF621和COL11A1成为优先靶点，因为它们在炎症和肿瘤相关成纤维细胞中具有已知的相关性。

3.6. NAT10催化靶标mRNA（包括COL11A1和ZNF621）的ac₄C修饰以增强其稳定性

蛋白质印迹分析显示，ZNF621和COL11A1可被TGF-β1诱导，并且在SSc来源的HDFs中升高。ac₄C-RIP-seq显示，NAT10敲低后，ZNF621和COL11A1的CDS和3′UTR区域内的ac₄C峰显著丢失。放线菌素D追踪实验证实了mRNA衰变加速。研究人员构建了NAT10的G641E催化位点突变体。与野生型NAT10不同，突变体未能增加ZNF621和COL11A1的mRNA和蛋白丰度。RIP-RT-qPCR进一步证明NAT10与两种转录本直接结合，而这种结合被G641E突变显著削弱。计算预测和PLIP建模支持NAT10与mRNA的直接相互作用。RNA-EMSA分析证实，针对COL11A1和ZNF621 mRNA上保守ac₄C位点的突变消除了ac₄C修饰，而NAT10过表达则增强了ac₄C修饰，此效应可被催化结构域点突变消除。这些结果证明NAT10介导的ac₄C修饰增强了COL11A1和ZNF621 mRNA的稳定性。

3.7. ZNF621在调节SSc HDF增殖、迁移和纤维化中的作用

研究人员在SSc来源的HDFs中沉默了ZNF621。ZNF621耗竭显著降低了成纤维细胞增殖和纤维化标志物表达，并显著损害了集落形成和迁移能力，即使在NAT10表达升高的条件下也是如此。免疫荧光分析显示ZNF621敲低后Ki67和PCNA表达减少。流式细胞术进一步显示S期细胞群减少。这些发现表明ZNF621有助于成纤维细胞增殖和纤维化活化，并可能作用于NAT10信号的下游。

3.8. NAT10抑制减轻SSc模型中的皮肤纤维化严重程度

研究人员在HDFs中敲低了NAT10，显著降低了ZNF621和COL11A1的升高表达，破坏NAT10乙酰转移酶活性同样减弱了它们的上调。研究人员在体内使用了条件性Nat10敲除小鼠模型（Col2a1-Cre^ERT2; Nat10^flox/flox）。在BLM诱导的纤维化模型中，野生型小鼠出现明显的真皮增厚和胶原沉积，而敲除小鼠的纤维化明显减轻。敲除小鼠的真皮成纤维细胞中Ki67阳性细胞减少，波形蛋白、COL1A1、ZNF621、COL11A1等纤维化标志物表达降低。最后，体内使用Remodelin治疗也减轻了BLM诱导的真皮增厚和成纤维细胞活化。