CRISPR/Cas9介导的Pi21、Bsr-d1和Xa5三基因编辑技术为优质早季水稻提供了广谱抗病性，且不会影响产量

《Plant Science》：CRISPR/Cas9-Mediated triple gene editing of Pi21, Bsr-d1, and Xa5 confers broad-spectrum disease resistance in elite early-season rice without yield compromise

　　

姜洪瑞|杨树东|黄琪娜|苗天慧|任军|余坤宇|杨杰|杨长登|梁燕

中国国家水稻研究所水稻生物学国家重点实验室与中国国家水稻改良中心，杭州310006

摘要

稻瘟病和细菌性枯萎病是严重威胁全球水稻生产的毁灭性病害。为了在不降低产量的前提下开发持久的抗性，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除了两个优质早稻品种（ZZU53和ZZU100）中的三个负向免疫调节因子：Pi21、Bsr-d1和Xa5。我们成功获得了无转基因的同型三突变体，这些突变体对Magnaporthe oryzae（M. oryzae）和Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）表现出显著增强的抗性。这种广谱抗性与水杨酸（SA）途径（OsPR1a、OsPR1b和OsWRKY45）和茉莉酸（JA）途径（OsPR4）中关键防御基因的持续上调有关。全面的农艺评估表明，千粒重、穗结构、抽穗期和分蘖数等关键农艺性状与野生型植物相当，说明没有明显的产量损失。这种方法为开发抗病早稻品种提供了一种高效且无转基因的途径。现在需要开展多项环境田间试验来评估其长期的农业可行性。

引言

水稻是世界上最重要的主食作物之一，全球约90%的水稻生产和消费都发生在亚洲（Wiseman等人，2021年）。早季水稻品种有助于主要水稻生产区的双季种植系统，并对中国国家粮食安全至关重要（Deng等人，2019年）。在长江中下游地区，ZZU53和ZZU100等品种已成为主导的商业品种（Huang等人，2022年）。ZZU53具有较短的生长周期和优质的谷物品质。而ZZU100最近创下了早季水稻产量的新纪录，显示出巨大的增产潜力。水稻生产和品质面临多种病原体的严重威胁。值得注意的是，M. oryzae和Xoo是两种极具破坏性的病原体，分别引起稻瘟病和细菌性枯萎病。培育对这两种病原体都具有广谱抗性的水稻品种是最经济有效的控制策略。

为了抵御病原体感染，植物进化出了两层防御系统。第一层免疫：当病原体入侵时，植物细胞表面的模式识别受体（PRRs）可以识别保守的病原体相关分子模式（PAMPs）（Jones和Dangl，2006年）。这种识别会触发细胞壁修饰、胼胝质沉积和防御相关蛋白的激活等反应，这一过程称为PAMP诱导的免疫（PTI）。为了克服PTI，M. oryzae和xoo会分泌专门的效应蛋白来抑制并绕过这一层免疫（Mentlak等人，2012年）。作为响应，植物进化出了第二层防御系统，称为效应蛋白诱导的免疫（ETI）。在ETI中，植物产生相应的抗性蛋白（R蛋白）来识别和对抗病原体分泌的效应蛋白。这是一种高度特异性的防御机制，通过改变细胞内离子浓度（如Ca2?、K?、H?）、超氧化物和一氧化氮的积累以及程序性细胞死亡等过程在感染部位发挥作用，从而限制病原体的进一步入侵（Kaku等人，2006年）。

全面了解R蛋白介导的免疫机制将推动旨在实现持久抗性的水稻育种计划。迄今为止，已有超过34个抗稻瘟病基因和12个抗细菌性枯萎病基因被克隆并进行了研究。人们特别关注非典型的R基因Pi21（Xu等人，2021年）、防御相关基因Bsr-d1（Zhu等人，2020a）和转录因子IIA γ亚基Xa5（Yuan等人，2016a），因为这些突变能够在保持产量稳定的同时提供广谱抗性。pi21基因赋予水稻部分且持久的抗稻瘟病能力。其主要功能不是完全阻止感染，而是减缓疾病在植物体内的发展和传播。这种抗性由该基因的隐性等位基因介导，可能通过增强细胞壁等物理屏障或调节防御相关信号通路来实现（Fukuoka等人，2009年）。Bsr-d1基因的功能是负调控植物的防御反应。当该基因发生突变时，可以使植物产生更强、更快速的免疫反应，有效阻止病原体的入侵（Li等人，2017年；Li等人，2020年）。这种失活机制赋予了持久的广谱抗性（Zhu等人，2020b）。xa5基因赋予水稻对Xoo引起的细菌性枯萎病的抗性。这种蛋白质参与植物的基础转录机制。抗性xa5等位基因产生的TFIIAγ5蛋白有一个氨基酸的变化（缬氨酸变为谷氨酸）（Lyer-Pascuzzi等人，2008年）。据认为，这种改变的蛋白质会干扰特定细菌效应蛋白（转录激活因子样效应蛋白，TALEs）与宿主启动子序列结合并激活易感基因的能力（Yuan等人，2016b）。通过破坏这种病原体诱导的宿主转录操纵，xa5阻止细菌成功抑制植物的免疫反应，从而赋予抗性。

在这项研究中，我们使用CRISPR/Cas9系统在两个早季水稻品种ZZU53和ZZU100中生成了Pi21、Bsr-d1和Xa5基因的三重敲除突变体。与野生型对照相比，这些突变体对稻瘟病和细菌性枯萎病的抗性显著增强。这些发现表明，同时破坏这三个基因是实现广谱抗性而不影响农艺产量的有效策略。

章节片段

在ZZU53和ZZU100中生成Pi21、Bar-d1和Xa5基因的敲除突变体

为了生成pi21、bsr-d1和xa5三重突变体，我们构建了一个表达载体，其中包含由泛素启动子驱动的Cas9盒以及分别位于OsU3、OsU6a、OsU6b启动子下的三个单导向RNA（sgRNA）支架（基于Ma等人，2015年的研究）。这些重组表达载体通过Agrobacterium介导的转化技术被引入ZZU53和ZZU100品种。我们设计了三个针对Pi21、Bsr-d1早期编码区域的gRNA

结论

水稻生产极易受到多种植物病原体的影响，其中稻瘟病和细菌性枯萎病是两种最具破坏性的病害，导致全球产量大幅损失。开发抗病水稻品种已成为应对这些威胁的最有效策略之一。最近的研究表明，Pi21、Bsr-d1和Xa5是水稻免疫的关键负向调节因子，单独破坏这些基因可以增强抗性

梁燕：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。姜洪瑞：撰写——初稿、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念构思。余坤宇：研究。任军：正式分析。杨长登：撰写——审稿与编辑、监督。杨杰：研究。杨树东：概念构思。苗天慧：概念构思。黄琪娜：资金获取、概念构思。

相关新闻