滑膜间充质干细胞衍生的胞外囊泡LncRNA-SNHG14对软骨细胞损伤的影响及其机制

《Regenerative Therapy》：Effects and mechanisms of synovial mesenchymal stem cell–derived extracellular vesicular LncRNA-SNHG14 on chondrocyte injury

　　中国浙江省慈溪市少博邹慈溪市急救中心，邮编315300

摘要

目的：研究滑膜间充质干细胞（SMSC）来源的细胞外囊泡（EVs）中的长链非编码RNA（LncRNA）核小RNA宿主基因14（SNHG14）对软骨细胞损伤的影响及其潜在机制。

方法：通过透射电子显微镜、纳米粒子追踪分析、Western blot和EVs摄取实验分离并鉴定SMSC的EVs。用转染了sh-NC或sh-SNHG14的SMSCs分离出的EVs处理经白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的软骨细胞。使用CCK-8检测和流式细胞术检测大鼠软骨细胞的增殖和凋亡情况。通过ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的水平。Western blot用于检测与凋亡相关的蛋白质[Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、细胞色素C（Cyt c）]以及与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白质[性别决定区域Y-box蛋白9（SOX9）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、胶原II型α1（COL2A1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）]的表达。分析LncRNA-SNHG14对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信号通路的影响。通过激活该通路，进一步分析LncRNA-SNHG14的表达及其对上述指标的影响。

结果：SMSC中的LncRNA-SNHG14可以在EVs中富集并分泌，软骨细胞能够成功摄取EVs。IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中LncRNA-SNHG14的表达水平升高，细胞存活率降低，凋亡率、TNF-α、IL-6水平以及Bax、caspase-3、Cyt c、MMP-13蛋白水平升高，IGF-1水平及SOX9、COL2A1、bFGF蛋白水平降低，HMGB1、TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白水平升高（P < 0.05）。沉默SMSC-EVs中的LncRNA-SNHG14可提高细胞存活率，降低凋亡率及Bax、caspase-3、Cyt c、MMP-13蛋白水平，同时降低TNF-α、IL-6水平及HMGB1、TLR4、NF-κB的表达水平，提高IGF-1水平及SOX9、COL2A1、bFGF蛋白水平（P < 0.05）；过表达HMGB1后，LncRNA-SNHG14的表达水平升高，细胞存活率降低，凋亡率及Bax、caspase-3、Cyt c、MMP-13蛋白水平升高，IGF-1、SOX9、COL2A1、bFGF水平降低，TNF-α和IL-6水平升高（P < 0.05）。

结论：在IL-1β诱导的软骨细胞损伤的体外模型中，SMSC-EVs沉默LncRNA-SNHG14可以促进软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡和炎症反应。这些效应与HMGB1/TLR4/NF-κB通路组分的表达减少有关，表明该通路参与了这一过程。

1. 引言
骨关节炎（OA）的特点是软骨进行性退化、滑膜炎症和骨赘形成。关节软骨是一种高度分化的组织，自我修复能力非常有限。目前尚无能够治愈骨关节炎的疾病修饰疗法；大多数现有治疗方法主要缓解疼痛，而非恢复正常的软骨功能。因此，有效的软骨修复仍然是OA管理中的核心目标[1]。滑膜间充质干细胞（SMSC）具有自我更新和多向分化潜能，已成为一种有前景的基于细胞的组织修复策略。它们的治疗效果主要通过细胞外囊泡（EVs）实现，这些EVs将生物活性分子传递给受体细胞，从而促进软骨细胞增殖、抑制软骨退化并协调后续的再生过程；SMSC来源的EVs与OA密切相关，并已被证明可以增强软骨细胞再生和改善细胞外基质稳态[2]。软骨损伤和退化是OA的核心病理基础，因此识别参与软骨细胞损伤的关键调控基因对于开发有效的治疗策略至关重要。EVs含有多种功能性非编码RNA，其中长链非编码RNA（lncRNAs）在OA发病机制中起关键作用，并直接参与软骨细胞损伤过程[3,4]。长链非编码RNA核小核RNA宿主基因14（LncRNA-SNHG14）参与染色质重塑和转录调控，调节炎症反应，并与神经元损伤以及增殖和凋亡等基本细胞过程有关[5,6]。先前的研究表明，在碘乙酸钠诱导的大鼠软骨细胞损伤中，LncRNA-SNHG14的表达显著上调，其抑制可以减轻软骨细胞损伤[7]。然而，尚不清楚LncRNA-SNHG14是否通过SMSC来源的EVs进行转运来发挥其作用。基于此背景，本研究旨在探讨SMSC来源的EVs中的LncRNA-SNHG14在软骨细胞损伤中的作用，并阐明其潜在的分子机制。这项工作旨在为骨关节炎的发病机制提供新的见解，并为其临床诊断和治疗提供潜在的方向。

2. 材料与方法
2.1. 实验细胞和主要试剂
从武汉普赛尔生命科技有限公司购买了原代大鼠软骨细胞（目录号CP-R087，5 × 10^5细胞/T25孔）和滑膜间充质干细胞（SMSC，目录号CP-R304，5 × 10^5细胞/T25孔）。这两种细胞类型均通过供应商的短串联重复序列（STR）分析进行鉴定，并通过基于PCR的检测确认无支原体污染。所有实验均使用第3代细胞以保持一致性和可重复性。EVs分离试剂盒来自广州Gesea生物技术公司，而HMGB1过表达质粒及相应的空载体则来自山东伟振生物技术公司。转染试剂、CCK-8试剂盒、重组人白细胞介素-1β（IL-1β）和凋亡检测试剂由北京Solarbio科技有限公司提供。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒来自上海酶联生物技术公司。针对Bax、caspase-3、细胞色素c（Cyt c）、SOX9、MMP-13、胶原II型α1（COL2A1）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的一抗和二抗来自Abcam（美国），而针对HMGB1、Toll样受体4（TLR4）、核因子κB（NF-κB）和内参GAPDH的抗体来自Santa Cruz生物技术公司（美国）。总RNA提取试剂盒、蛋白质定量试剂盒和增强化学发光（ECL）试剂来自北京TransGen生物技术公司。逆转录试剂盒和定量实时PCR（qRT-PCR）试剂盒来自大连Takara Bio Inc.，PCR引物由上海Sangon生物技术公司合成。针对SNHG14的短发夹RNA（sh-SNHG14）和阴性对照序列（sh-NC）来自上海GenePharma有限公司。SpectraMAX Plus 384微孔板读数仪来自Molecular Devices（美国），PIKORed 96实时荧光定量PCR系统来自Thermo Fisher Scientific（美国）。荧光倒置显微镜使用Olympus显微镜（日本），纳米粒子追踪分析使用ZetaView仪器（Particle Metrix，德国），流式细胞术使用Beckman Coulter流式细胞仪进行。

2.2. 方法
2.2.1. SMSC的形态观察和鉴定
将滑膜间充质干细胞（SMSC，第3代）接种在培养瓶中，并维持在新鲜培养基中，每3天更换一次培养基。当细胞密度达到约70–80%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并进行传代，然后在倒置相位对比显微镜下检查其形态特征。通过流式细胞术根据表面标志物CD29、CD34和CD45的表达来鉴定SMSC。

2.2.2. EVs的分离
将SMSC以每孔2 × 10^5细胞的密度接种到六孔板中，在缺乏EVs的血清中培养48小时。收集培养上清液，根据ExoQuick-TC EVs分离试剂盒的制造商说明分离EVs。将获得的EVs重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以3000 r/min的速度在4°C下离心30分钟，弃去上清液后重新悬浮在缓冲液中。通过Western blot检测细胞外囊泡标志蛋白CD63和CD81的表达。

2.2.3. EVs的鉴定
将EVs稀释至1 × 10^7颗粒/mL的浓度，然后加载到ZetaView仪器的样品室中进行纳米粒子追踪分析，记录颗粒的布朗运动。对于透射电子显微镜观察，将EVs悬浮液滴在铜网上并在室温下风干，然后用3%磷钨酸负染色2小时，再用2%醋酸铀盐复染30秒。随后使用透射电子显微镜检查并成像。

2.2.4. 软骨细胞对EVs的摄取追踪
使用Exo-Green示踪剂对SMSC来源的EVs进行荧光标记。简要来说，将EVs重新悬浮在500 μL PBS中，与60 μL Exo-Green充分混合，然后在37°C下孵育10分钟；加入90 μL ExoQuick-TC试剂终止反应，随后在冰上孵育30分钟。将混合物以12,000 r/min的速度离心5分钟，收集沉淀物，并将标记的EVs重新悬浮在500 μL PBS中。然后将Exo-Green标记的EVs加入培养的大鼠软骨细胞中，使用荧光成像系统观察EVs的摄取情况。

2.2.5. 细胞处理和实验分组
在正常条件下培养48小时的软骨细胞被指定为对照组（Con）。为了建立体外损伤模型，向软骨细胞中加入重组人IL-1β至最终浓度10 ng/mL[8]，然后孵育48小时（IL-1β组）。为了评估SMSC的旁分泌效应，将IL-1β刺激的软骨细胞与SMSC共培养48小时，使用Transwell系统（孔径0.4 μm），允许可溶性因子交换而不直接接触细胞。这组被定义为SMSC组。对于EV干预实验，首先将SMSC以每孔1 × 10^5细胞的密度接种到六孔板中。当细胞密度达到约80%时，使用Lipofectamine 3000转染sh-NC或sh-SNHG14。6小时后，用超速离心（120,000×g，18小时）制备的缺乏EVs的培养基替换培养基，再培养48小时。然后收集培养上清液，并根据制造商的方案使用ExoQuick-TC试剂盒分离EVs。将分离出的EVs重新悬浮在PBS中，并使用BCA试剂测定蛋白质浓度。对于处理组，将IL-1β预处理的软骨细胞（10 ng/mL，48小时）与50 μg/mL的EVs（基于总蛋白）共培养48小时。这些组分别被定义为IL-1β + sh–NC–EV组和IL-1β + sh-SNHG14-EV组。为了研究HMGB1在软骨细胞损伤中的作用，将SMSC以每孔1 × 10^5细胞的密度接种到六孔板中，并在80%细胞密度时使用Lipofectamine 3000转染空载体（20 μmol/L）或HMGB1过表达质粒（20 μmol/L）。然后将转染的SMSC与IL-1β诱导的软骨细胞（10 ng/mL）使用Transwell系统共培养48小时。这些组分别被定义为IL-1β + 空载体组和IL-1β + HMGB1过表达组。

2.2.6. LncRNA-SNHG14、HMGB1、TLR4和NF-κB mRNA表达的定量实时PCR分析
收集第1.2.5节中描述的各组的软骨细胞，使用商业RNA分离试剂盒提取总RNA。在含有2 μL RNA、2 μL 10 × RT缓冲液、0.4 μL dNTPs、1 μL MultiScribe逆转录酶、2 μL 10 × 随机引物和ddH2O的20 μL反应体系中进行逆转录，然后进行cDNA合成。根据制造商的说明使用SYBR Green检测系统进行定量实时PCR。每个反应混合物（20 μL）包含10 μL SYBR Green Master Mix、0.8 μL正向和反向引物、1 μL cDNA模板和ddH2O至体积。扩增程序包括在95°C下初始变性5分钟，然后是40个循环的95°C变性30秒、60°C退火30秒和72°C延伸30秒。使用2?ΔΔCt方法计算LncRNA-SNHG14、HMGB1、TLR4和NF-κB的相对mRNA表达水平，以GAPDH作为内参。引物序列如下：LncRNA-SNHG14正向引物为5′-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3′，反向引物为5′-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3′；GAPDH正向引物为5′-ATCTGAGCAGGTTGCTCCAC-3′，反向引物为5′-GGCCCTTTACACTGTGAGCC-3′；HMGB1正向引物为5′-AAAGGAGATCCTAAGAAGCCGA-3′，反向引物为5′-TCATAACGAGCCTTGTCAGCC-3′；TLR4正向引物为5′-CCAGGTGTGAAATTGAGACAATTG-3′，反向引物为5′-AAGCTGTCCAATATGGAAACCC-3′；NF-κB正向引物为5′-CAGATACCACTAAGACGCACCC-3′，反向引物为5′-CTCCAGGTCTCGCTTCTTCACA-3′。

2.2.7. CCK-8细胞增殖测定
将第1.2.5节中描述的各组的软骨细胞以每孔8 × 10^3细胞的密度接种到96孔板中，在37°C下孵育24小时。然后向每个孔中加入新鲜培养基（100 μL）和CCK-8溶液（10 μL），在37°C下孵育2小时，之后使用微孔板读数仪在450 nm处测量吸光度。细胞活力计算公式为：实验组OD值 / 对照组OD值 × 100%。

2.2.8. 流式细胞术分析凋亡
将各组的软骨细胞以每孔1 × 10^5细胞的密度接种到六孔板中。用5 μL Annexin V-FITC染色细胞，在室温下避光孵育15分钟，然后在光保护条件下用10 μL propidium iodide（PI）染色溶液孵育10分钟。随后通过流式细胞术确定凋亡细胞的比例。

2.2.9. ELISA检测炎症细胞因子
收集各组软骨细胞的培养上清液，每孔加入100 μL到ELISA板中。密封后，将平板在室温下孵育2小时，然后用生物素标记的抗体溶液（每孔100微升）在室温下孵育1小时。之后清洗平板，与辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素孵育20分钟，并用四甲基联苯胺（TMB）底物显色20分钟，然后终止反应。在450纳米处测量吸光度，并根据标准曲线计算TNF-α、IL-6和IGF-1的浓度。

2.2.10. 西部印迹分析
从每组中提取软骨细胞以提取总细胞蛋白，并在分析前确定蛋白浓度。蛋白质通过SDS-PAGE在80伏特下分离30分钟，然后在120伏特下分离90分钟，接着使用湿转移系统在300毫安下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上90分钟。
转移后，膜在室温下封闭1小时，并在4摄氏度下与针对Bax、caspase-3、细胞色素c（Cyt c）、SOX9、MMP-13、COL2A1、bFGF、HMGB1、TLR4和NF-κB的一抗孵育24小时（所有抗体均稀释1:1000），使用GAPDH作为内部加载对照（1:1000）。然后在室温下与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育1小时，并使用增强化学发光（ECL）检测系统可视化蛋白条带。通过凝胶成像系统进行密度分析来量化条带强度。

2.3. 统计分析
使用SPSS版本25.0进行统计分析。所有定量数据以平均值±标准差（±s）表示。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，本研究中的所有数据均符合正态分布（P > 0.05）。两组之间的比较使用独立样本t检验进行，而多组之间的比较则通过单因素方差分析（ANOVA）进行分析，随后使用最小显著差异（LSD）t检验进行成对比较。选择LSD检验是因为它适用于具有相等组大小和均匀方差的规定比较，其使用与探索性机制研究中的既定实践一致。所有实验都进行了九次独立的生物学重复（n = 9），这意味着每个重复代表一个独立培养和处理的样本。P值< 0.05被认为是统计学上显著的。

3. 结果
3.1. EVs的鉴定和SMSC表型的验证
形态观察显示，培养的细胞排列紧密，外观均匀，显示出典型的纺锤形形态（图1A）。流式细胞术分析表明，分离的细胞对MSC标志物CD29高度阳性（99.2% ± 0.5%），而对造血谱系标志物CD34（1.1% ± 0.3%）和CD45（0.9% ± 0.4%）呈阴性。这种免疫表型（CD29+CD34–CD45–）证实了分离群体的间充质基质/干细胞身份，与ISCT指南一致（图1B）。在透射电子显微镜下，源自SMSC的EVs（SMSC-Exo）显示出具有凹面的特征性半球形形态（图2A）。ZetaView纳米粒子追踪分析显示，EVs的平均直径约为130纳米（图2B）。SMSCs中的CD63蛋白表达水平为（0.46 ± 0.08），而在SMSC-EVs中为（0.92 ± 0.11），CD81在SMSCs中的表达水平为（0.50 ± 0.09），在SMSC-EVs中为（0.88 ± 0.13）。LncRNA-SNHG14、CD63和CD81的水平在SMSC-Exo中显著高于SMSCs（P < 0.05），证实了成功分离了源自SMSC的EVs，并表明LncRNA-SNHG14通过EVs富集和分泌（图2C）。

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图1. A：在倒置显微镜下观察到的SMSCs的形态特征。显示了三个独立实验的代表性图像（n = 3）（比例尺 = 100微米）。B：流式细胞术分析确认了SMSC表型。细胞对间充质标志物CD29高度阳性，而对造血标志物CD34和CD45呈阴性。这种特征（CD29+CD34–CD45–）与间充质干细胞的ISCT标准一致（n = 3）。
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图2. A：通过透射电子显微镜观察到的源自SMSC的外泌体的形态。显示了三个独立实验的代表性图像（n = 3）（比例尺 = 100微米）。B：通过纳米粒子追踪分析分析的外泌体的大小分布和浓度（n = 3）。数据代表三个独立实验的平均值±标准差。C：细胞外囊泡表面标志蛋白的表达（n = 3）。分子量标记：CD63约26 kDa，CD81约22 kDa，GAPDH约37 kDa。

3.2. LncRNA-SNHG14沉默对软骨细胞增殖和凋亡的影响
与对照组（Con）相比，IL-1β组显示LncRNA-SNHG14表达显著增加，伴随细胞活力降低和凋亡增加，以及Bax、caspase-3和细胞色素c（Cyt c）的蛋白水平升高（P < 0.05）。相比之下，与IL-1β组相比，SMSC组表现出较低的LncRNA-SNHG14表达，细胞活力较高，凋亡减少，同时Bax、caspase-3和Cyt c的表达也降低（P < 0.05）。
当与SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组相比时，IL-1β + sh-SNHG14-Exo组进一步降低了LncRNA-SNHG14表达，增强了细胞活力，并显著减少了凋亡，同时Bax、caspase-3和Cyt c的水平也降低（P < 0.05）。在这些指标上，SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组之间没有显著差异（P > 0.05）。这些结果总结在图3和表1中。

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图3. LncRNA-SNHG14沉默对软骨细胞凋亡的影响。A：软骨细胞的凋亡率。显示了三个独立实验的代表性点图（n = 3）。B：Bax、caspase-3和Cyt c的蛋白表达水平。显示了三个独立实验的代表性印迹（n = 3）。分子量标记：Bax约21 kDa，caspase-3约35 kDa（pro-form）和约17 kDa（cleaved form），Cyt c约15 kDa，GAPDH约37 kDa。
表1. LncRNA-SNHG14沉默对软骨细胞增殖和凋亡的影响（x￣ ±s，n = 9）。
组别 LncRNA-SNHG14 细胞存活率（%）凋亡率（%）
Con组 1.00 ± 0.02 100.01 ± 0.00 16.96 ± 2.63 0.28 ± 0.03 0.19 ± 0.02 0.21 ± 0.02
IL-1β组 5.57 ± 1.03a 46.85 ± 9.46a 62.28 ± 7.76a 0.87 ± 0.10a 0.91 ± 0.09a 0.93 ± 0.08a
SMSC组 3.96 ± 0.57ab 60.13 ± 8.15ab 40.11 ± 3.37ab 0.60 ± 0.05ab 0.62 ± 0.10ab 0.64 ± 0.10ab
IL-1β+sh–NC–Exo组 3.88 ± 0.62ab 60.85 ± 7.63ab 40.05 ± 3.59ab 0.58 ± 0.06ab 0.61 ± 0.11ab 0.63 ± 0.12ab
IL-1β+sh-SNHG14-Exo组 1.36 ± 0.18abcd 88.74 ± 6.69abcd 23.11 ± 2.18abcd 0.35 ± 0.04abcd 0.33 ± 0.03abcd 0.40 ± 0.05abcd
F9 2.79 58 5.18 11 46.44 11 31.68 51 12.31 49 8.90 7
P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
注：与Con组相比，aP < 0.05；与IL-1β组相比，bP < 0.05；与SMSC组相比，cP < 0.05；与IL-1β + sh–NC–Exo组相比，dP < 0.05。

3.3. LncRNA-SNHG14沉默对炎症反应和与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达的影响
与Con组相比，IL-1β组显示TNF-α和IL-6的水平显著增加，以及MMP-13蛋白表达升高，而IGF-1水平和SOX9、COL2A1和bFGF的表达显著降低（P < 0.05）。与IL-1β组相比，SMSC组表现出减弱的炎症反应，表现为TNF-α和IL-6水平降低以及MMP-13表达降低，同时IGF-1水平升高和SOX9、COL2A1和bFGF表达上调（P < 0.05）。此外，与SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组相比，IL-1β + sh-SNHG14-Exo组表现出较低的TNF-α和IL-6水平以及MMP-13表达降低，同时IGF-1水平升高和SOX9、COL2A1和bFGF表达升高（P < 0.05）。SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组之间没有显著差异（P > 0.05）。这些结果在图4和表2中呈现。

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图4. 与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达。Western blot分析SOX9、MMP-13、COL2A1和bFGF蛋白表达。显示了三个独立实验的代表性印迹（n = 3）。分子量标记：SOX9约65 kDa，MMP-13约60 kDa（潜伏形式）和约48 kDa（活性形式），COL2A1约140 kDa，bFGF约17.5 kDa，GAPDH约37 kDa。
表2. LncRNA-SNHG14沉默对炎症反应和与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达的影响（x￣ ±s，n = 9）。
组别 TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）IGF-1（ng/mL）SOX9蛋白 MMP-13蛋白 COL2A1蛋白 bFGF蛋白
Con组 63.58 ± 11.19 116.39 ± 28.79 63.29 ± 11.09 0.96 ± 0.05 0.22 ± 0.03 0.98 ± 0.07 0.97 ± 0.06
IL-1β组 274.15 ± 31.38a 585.54 ± 115.18a 13.24 ± 2.41a 0.32 ± 0.03a 0.89 ± 0.10a 0.30 ± 0.02a 0.26 ± 0.04a
SMSC组 186.30 ± 22.13ab 316.29 ± 85.43ab 30.06 ± 5.02ab 0.51 ± 0.04ab 0.70 ± 0.11ab 0.55 ± 0.09ab 0.48 ± 0.05ab
IL-1β+sh–NC–Exo组 184.27 ± 30.61ab 312.27 ± 92.31ab 31.54 ± 8.51ab 0.53 ± 0.06ab 0.68 ± 0.12ab 0.57 ± 0.10ab 0.50 ± 0.07ab
IL-1β+sh-SNHG14-Exo组 98.10 ± 20.71abcd 188.21 ± 22.73abcd 50.02 ± 7.45abcd 0.74 ± 0.07abcd 0.40 ± 0.08abcd 0.77 ± 0.08abcd 0.70 ± 0.10abcd
F 104.06 247.35 259.90 619.90 072.55 598.50 214 2.00 9
P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
注：与Con组相比，aP < 0.05；与IL-1β组相比，bP < 0.05；与SMSC组相比，cP < 0.05；与IL-1β + sh–NC–Exo组相比，dP < 0.05。

3.4. LncRNA-SNHG14沉默对HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响
与Con组相比，IL-1β组显示HMGB1、TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平显著增加（P < 0.05）。相比之下，与IL-1β组相比，SMSC组显示HMGB1、TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白水平显著降低（P < 0.05）。此外，与SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组相比，IL-1β + sh-SNHG14-Exo组显示HMGB1、TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表达显著降低（P < 0.05）。SMSC组和IL-1β + sh–NC–Exo组之间没有显著差异（P > 0.05）。这些结果在图5和表3中呈现。

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图5. 与HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关的蛋白表达。Western blot分析HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表达。显示了三个独立实验的代表性印迹（n = 3）。分子量标记：HMGB1约30 kDa，TLR4约92 kDa，NF-κB p65约65 kDa，GAPDH约37 kDa。
表3. LncRNA-SNHG14沉默对HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响（x￣ ±s，n = 9）。
组别 mRNA 蛋白
HMGB1 TLR4 NF-κB
Con组 1.00 ± 0.01 1.01 ± 0.03 1.00 ± 0.03 0.20 ± 0.02 0.18 ± 0.01 0.22 ± 0.03
IL-1β组 5.54 ± 1.16a 5.63 ± 1.12a 6.02 ± 1.08a 0.93 ± 0.03a 0.95 ± 0.04a 0.97 ± 0.05a
SMSC组 3.13 ± 0.57ab 3.10 ± 0.62ab 3.25 ± 0.63ab 0.80 ± 0.06ab 0.76 ± 0.05ab 0.81 ± 0.04ab
IL-1β+sh–NC–Exo组 3.11 ± 0.52ab 3.08 ± 0.55ab 3.21 ± 0.71ab 0.78 ± 0.07ab 0.80 ± 0.06ab
IL-1β+sh-SNHG14-Exo组 1.62 ± 0.13abcd 1.77 ± 0.14abcd 1.82 ± 0.83abcd 0.41 ± 0.05abcd 0.39 ± 0.03abcd 0.44 ± 0.07abcd
F 70.75 070.95 159.57 734 2.54 950 1.87 931 6.23 3
P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
注：与Con组相比，aP < 0.05；与IL-1β组相比，bP < 0.05；与SMSC组相比，cP < 0.05；与IL-1β + sh–NC–Exo组相比，dP < 0.05。

3.5. HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活对软骨细胞增殖和凋亡的影响
与IL-1β + 空载体组相比，IL-1β + HMGB1过表达组显示LncRNA-SNHG14的表达显著增加，同时HMGB1、TLR4和NF-κB的蛋白水平升高（P < 0.05）。这些变化伴随着细胞活力降低和凋亡增加，以及Bax、caspase-3和Cyt c的蛋白水平升高（P < 0.05），如图6和表4所示。

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图6. HMGB1/TLR4/NF-κB通路激活对软骨细胞凋亡的影响。A：软骨细胞的凋亡率。显示了三个独立实验的代表性点图（n = 3）。B：Bax、caspase-3和Cyt c的蛋白表达水平。显示了三个独立实验的代表性印迹（n = 3）。分子量标记：Bax约21 kDa，caspase-3约35 kDa（pro-form）和约17 kDa（cleaved form），Cyt c约15 kDa，GAPDH约37 kDa。
表4. HMGB1过表达对软骨细胞增殖和凋亡的影响（x￣ ±s，n = 9）。
组别 LncRNA-SNHG14 HMGB1蛋白 TLR4蛋白
Con组 1.01 ± 0.03 0.63 ± 0.08 0.61 ± 0.09 0.57 ± 0.11 59.63 ± 9.25 40.16 ± 3.67 0.55 ± 0.04 0.61 ± 0.05 0.62 ± 0.09
IL-1β+过表达组 2.57 ± 0.18 0.81 ± 0.17 0.85 ± 0.16 0.90 ± 0.12 47.01 ± 3.62 51.19 ± 4.16 0.68 ± 0.08 0.78 ± 0.16 0.81 ± 0.13
t 25.64 62.87 43.92 26.08 23.81 15.96 54.83 73.04 23.60 5
P 0.000 0.011 0.001 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000 0.008

3.6. HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活对炎症反应和与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达的影响
与IL-1β + 空载体组相比，IL-1β + HMGB1过表达组显示TNF-α和IL-6的水平显著增加，以及MMP-13蛋白表达升高（P < 0.05）。同时，IGF-1水平和SOX9、COL2A1和bFGF的表达显著降低（P < 0.05），如图7和表5所示。

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图7. 与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达。显示了三个独立实验的代表性印迹（n = 3）。分子量标记：SOX9约65 kDa，MMP-13约60 kDa（潜伏形式）和约48 kDa（活性形式），COL2A1约140 kDa，bFGF约17.5 kDa，GAPDH约37 kDa。
表5. HMGB1/TLR4/NF-κB通路激活对炎症反应和与软骨细胞增殖和再生相关的蛋白表达的影响（x￣ ±s，n = 9）。
组别 TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）IGF-1（ng/mL）SOX9蛋白 MMP-13蛋白 COL2A1蛋白 bFGF蛋白
IL-1β+空载体组 187.41 ± 20.16 312.58 ± 86.31 30.11 ± 4.15 0.52 ± 0.05 0.71 ± 0.08 0.54 ± 0.08 0.47 ± 0.06
IL-1β+HMGB1过表达组 225.71 ± 20.31 508.54 ± 75.49 20.16 ± 3.05 0.40 ± 0.06 0.81 ± 0.07 0.30 ± 0.04
t 4.01 55.12 75.79 64.60 92.82 23.66 97.07 2
P 0.001 0.000 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000 0.002在神经元模型中，LncRNA-SNHG14可以抑制miR-22-3p并激活NF-κB信号通路，最终导致神经元凋亡增强[13]。此外，LncRNA-SNHG14还被证明可以作为miR-30e-5p的分子海绵，从而调节SOX4的表达并减轻其对下游炎症和氧化应激相关基因的抑制作用。沉默LncRNA-SNHG14可以增加miR-30e-5p的表达，抑制NF-κB通路的激活，增强抗氧化酶的表达，并减轻细胞损伤[14]。在缺血性中风的小鼠模型中，LncRNA-SNHG14的表达显著上调，其敲低可以通过捕获miR-199b间接调节水通道蛋白4（AQP4）的表达，从而减少炎症和氧化应激反应，缓解缺血性脑损伤[15]。Li Ming等人[16]证明，在骨关节炎的大鼠模型中，过表达LncRNA-SNHG14的间充质干细胞来源的外泌体（EVs）可以促进软骨修复并减轻炎症反应。虽然这两项研究都在骨关节炎的背景下探讨了间充质干细胞来源的EVs和LncRNA-SNHG14，但本研究在几个关键方面有所不同。首先，Li等人关注的是过表达LncRNA-SNHG14的效果，而我们的研究则是探讨沉默LncRNA-SNHG14的影响，为它在软骨细胞损伤中的作用提供了互补的证据。其次，我们的研究特别考察了HMGB1/TLR4/NF-κB通路的机制参与，这在之前的报告中没有涉及。第三，我们采用了一种不同的实验方法，使用纯化的EVs（浓度为50 μg/mL）而不是共培养系统，从而更精确地将观察到的效果归因于EVs传递的LncRNA-SNHG14。这些差异共同扩展了我们对LncRNA-SNHG14在骨关节炎发病机制中的作用及其作为治疗靶点的潜力。其他研究表明，LncRNA-SNHG14可以通过靶向miR-137激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，从而调节软骨细胞凋亡，诱导线粒体功能障碍，并加剧炎症和细胞外基质降解[17]。

当前的外泌体研究主要集中在microRNAs上，而蛋白质组学分析表明，外泌体也可以通过其蛋白质载荷发挥生物学作用，无论是通过向邻近细胞释放蛋白质还是通过膜融合传递蛋白质。鉴于LncRNA-SNHG14在骨关节炎组织中持续高表达，它可能成为骨关节炎的一个有前景的治疗靶点。在本研究中，IL-1β刺激显著增加了软骨细胞中的LncRNA-SNHG14表达，这与先前的报告一致[17]。值得注意的是，我们的发现扩展了现有知识，表明间充质干细胞来源的EVs通过传递LncRNA-SNHG14参与软骨细胞损伤；这种lncRNA在间充质干细胞来源的EVs中富集，可以高效分泌，并被软骨细胞容易摄取。进一步分析显示，在间充质干细胞组中，LncRNA-SNHG14表达减少与细胞活力增强和凋亡减少相关，同时Bax、caspase-3和细胞色素c（Cyt c）的表达水平也降低。重要的是，沉默LncRNA-SNHG14对软骨细胞增殖和凋亡具有更明显的保护作用。作为关键的凋亡相关因子，Bax、caspase-3和Cyt c促进软骨细胞凋亡，损害软骨功能，并参与骨关节炎的发病机制[18,19]。总体而言，这些发现表明，沉默LncRNA-SNHG14可能通过竞争性的内源性RNA（ceRNA）介导的miRNA–mRNA调控网络调节软骨细胞功能，影响自噬活性，并抑制凋亡。这些多方面的调控作用表明，靶向LncRNA-SNHG14可能为干预骨关节炎提供一种新的、多用途的策略。

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）可以通过降低软骨细胞的增殖能力并促进基质降解酶的表达来损害软骨细胞，从而延缓软骨修复。相比之下，胰岛素样生长因子-1（IGF-1）具有抗炎作用，减轻软骨细胞凋亡，并缓解炎症损伤[20,21]。基本成纤维细胞生长因子（bFGF）可以增强软骨细胞增殖，加速软骨组织修复，并诱导间充质干细胞分化为软骨细胞，支持软骨再生。SOX9作为软骨生成分化的早期标志物，促进COL2A1的表达，有助于间充质干细胞向软骨生成方向分化。相反，基质金属蛋白酶-13（MMP-13）会降解胶原蛋白和其他基质成分，导致软骨破坏和软骨细胞损伤[22],[23],[24]。在本研究中，沉默间充质干细胞来源的LncRNA-SNHG14导致TNF-α、IL-6和MMP-13的水平降低，同时IGF-1、SOX9、COL2A1和bFGF的表达增加，表明LncRNA-SNHG14的敲低可以抑制炎症反应并促进软骨细胞增殖和再生。从机制上讲，沉默LncRNA-SNHG14可能作为一种竞争性的内源性RNA（ceRNA），通过捕获miRNAs如miR-223-3p，从而间接调节下游基因（包括Foxo3a和TLR4），抑制NF-κB通路的激活，并减少炎症介质（如TNF-α和IL-6）的表达。这种调控机制也可能驱动II型胶原蛋白和聚集蛋白基因的转录，恢复软骨细胞的合成活性，抑制凋亡，并平衡软骨中的分解代谢和合成代谢过程。

HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的激活会损害软骨细胞，并在骨关节炎的发病机制中起关键作用。因此，阻断这一通路可能代表了一种可行的骨关节炎治疗策略[25]。通路激活会加剧炎症和氧化应激，促进软骨细胞凋亡，并加速软骨的病理变化。TLR4是HMGB1的主要受体，与HMGB1相互作用以激活下游的NF-κB信号通路，诱导核转位并上调白细胞粘附分子。激活的NF-κB进一步调节SOX9、COL2A1和bFGF的表达，从而加重骨关节炎大鼠的软骨退化[26],[27],[28],[29]。Qi等人[30]证明，HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的激活可以促进软骨细胞凋亡并加剧炎症反应，表明这一通路可能成为骨关节炎的潜在治疗靶点。在本研究中，IL-1β诱导的软骨细胞表现出HMGB1、TLR4和NF-κB的表达水平升高，而沉默LncRNA-SNHG14则显著降低了它们的表达。这些发现表明，LncRNA-SNHG14的沉默与HMGB1/TLR4/NF-κB信号级联中关键分子的表达减少相关。然而，应承认两个重要的限制。首先，这些数据展示了组分表达的变化，而不是通路激活或抑制的直接证据；要明确评估NF-κB通路的活性，需要额外的功能指标，如p65的核转位、p65的磷酸化或IκBα的降解。其次，在HMGB1过表达实验中，HMGB1是在间充质干细胞中过表达的，而不是直接在受体软骨细胞中；因此，目前的数据不能确定HMGB1是在软骨细胞中下游作用，还是在间充质干细胞中上游作用，或者通过其他分泌因子间接作用。未来的研究应在受体软骨细胞中直接操作HMGB1，并结合功能通路测定，以明确确定HMGB1/TLR4/NF-κB通路在介导间充质干细胞来源的LncRNA-SNHG14效应中的机制层次。进一步支持这一机制的是，HMGB1过表达增加了LncRNA-SNHG14的水平，上调了HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白的表达，降低了软骨细胞的活力，并增加了凋亡，同时拮抗了LncRNA-SNHG14沉默对炎症反应和软骨细胞增殖及再生相关蛋白的调控作用。这些发现表明，沉默LncRNA-SNHG14在软骨细胞损伤中的保护作用可能是通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路来实现的。

应当注意的是，本文引用的许多研究使用“外泌体”一词来描述从间充质干细胞中分离出的小 extracellular vesicles。根据MISEV指南，我们对自己的分离物采用了更为保守的术语“extracellular vesicles (EVs)”，因为所使用的聚合物沉淀方法不能明确区分外泌体亚型和其他小 extracellular vesicles。在比较我们的发现与以往的报告时，应考虑这一术语上的区别。此外，还应承认关于EV分离和表征的几个方法学限制。在本研究中，EVs是使用聚合物沉淀试剂盒（ExoQuick-TC）分离的。尽管这种方法能有效从培养上清液中回收 vesicles，但它也可能共沉淀非EV成分，如蛋白质聚集体、脂蛋白和其他大分子复合物，这可能会影响EV的纯度。对分离出的EVs的表征主要基于透射电子显微镜、纳米粒子追踪分析和Western blot检测CD63和CD81。没有进行密度梯度超速离心，也没有通过脂蛋白或RNA结合蛋白标记物系统排除常见的非EV污染物。因此，不能完全排除一些观察到的生物学效应部分归因于共分离的非EV物质的可能性。未来应采用更严格的纯化方法，如密度梯度离心或尺寸排阻色谱，以确认EV传递的LncRNA-SNHG14在软骨细胞损伤中的具体作用。

总之，在IL-1β诱导的软骨细胞损伤模型中，沉默LncRNA-SNHG14的间充质干细胞来源的EVs增强了软骨细胞增殖，抑制了凋亡，并减轻了炎症反应。这些对软骨细胞损伤的保护作用与HMGB1/TLR4/NF-κB通路组分的表达减少相关，表明这一通路可能参与了其中的机制。这些结果为进一步的体内研究奠定了基础，以验证靶向LncRNA-SNHG14在关节软骨损伤中的治疗潜力，并使用直接的通路激活测定来确认HMGB1/TLR4/NF-κB信号的功能参与。

伦理声明
本研究中使用的所有原代大鼠软骨细胞和滑膜间充质干细胞均来自Procell Life Science & Technology Co., Ltd.（中国武汉）。使用这种商业可获得的细胞系不需要伦理批准，因为它不涉及人类或动物受试者。

资金
本研究没有获得任何资助。