使用缺乏Neospora caninum TKL1基因的菌株对C57BL/6小鼠进行免疫接种，可以保护它们免受新孢子虫病的侵害

《Animals and Zoonoses》：Immunization with the Neospora caninum TKL1-deficient Strain Protects C57BL/6 Mice against Neosporosis

　　王向杰|杜博雅|张云汉|王晓岑|李欣|刘珍珍|龚鹏涛|张楠|李贺|张旭|李建华
中国吉林大学兽医学院人畜共患病研究所、教育部人畜共患病重点实验室、严重人畜共患病诊断与治疗国家重点实验室，长春130062

**摘要**
犬新孢子虫（Neospora caninum）是一种顶复门原生动物，可导致牛和羊的生殖障碍，从而造成全球性的经济损失。然而，目前仍缺乏有效的药物和商业疫苗来预防和治疗新孢子虫病。深入了解犬新孢子虫毒力基因编码蛋白的鉴定和特性对于疫苗开发至关重要。酪氨酸激酶样蛋白（TKL）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族。弓形虫的TKL1（TgTKL1）已被证明与寄生虫的生长、黏附和侵袭有关，但犬新孢子虫的酪氨酸激酶样蛋白1（NcTKL1）的功能尚不清楚。本研究发现NcTKL1位于犬新孢子虫速殖子的细胞核中。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了NcTKL1缺失株（ΔNcTKL1），并研究了其表型特征和免疫保护作用。与野生型Nc-1株相比，ΔNcTKL1株的生长、侵袭和复制能力均受到抑制。ΔNcTKL1感染的小鼠存活率为100%，细胞因子（IL-6、TNF-α和IFN-γ）的分泌减少，寄生虫负荷降低，病理损伤减轻。进一步将ΔNcTKL1速殖子免疫小鼠10天、20天、30天和40天后，再用野生型Nc-1株进行攻击，以评估其对犬新孢子虫感染的保护效果。结果显示，在免疫后10天时，寄生虫负荷显著降低，IL-6、IL-12/IL-23（p40）、TNF-α和IFN-γ的分泌水平最高，存活率达到100%，感染小鼠的肝脏和肺部病理损伤明显减轻。这些结果表明，NcTKL1的缺失会影响寄生虫的生长、侵袭和复制。此外，用ΔNcTKL1株免疫可有效预防犬新孢子虫感染，表明其具有作为减毒活疫苗的潜力。

**1. 引言**
犬新孢子虫是一种细胞内寄生虫，可引起家养和野生动物中新孢子虫病。该病会导致多种临床症状，如流产、死产和胎儿木乃伊化，以及幼动物的运动和神经系统障碍。在美国，约42.5%的牛流产病例由犬新孢子虫感染引起；英国和日本奶牛的感染率分别为7.2%-17.1%和5.7%-20%。在中国，奶牛中新孢子虫的血清阳性率为约30%。新孢子虫病给全球牛羊产业带来了巨大的经济损失。据估计，新西兰肉牛场的感染经济损失达数百万美元，美国奶牛场的损失达数亿美元。随着育种和商业牛只的进口增加，预防和控制犬新孢子虫感染变得越来越重要。尽管此前已有NeoGuard灭活疫苗在多个国家使用，但由于其保护效果有限且不稳定，该疫苗已退出市场。尽管研究不断进行，但目前仍无有效的治疗药物或商业疫苗可用于预防或治疗新孢子虫病。

作为专性细胞内寄生虫，犬新孢子虫侵入宿主细胞并在寄生体吞噬泡（PV）膜内复制，该膜能抵抗与宿主细胞溶酶体区的融合。因此，犬新孢子虫高效侵入和从宿主细胞中释放的能力对其感染建立至关重要，这与其毒力密切相关。多种犬新孢子虫来源的蛋白（包括表面蛋白、微丝蛋白（MICs）、罗普特里蛋白（ROPs）和致密颗粒蛋白（GRAs）参与寄生虫的侵袭过程，并被视为有前景的疫苗候选分子。表面抗原1（SAG1）和SAG1相关序列2（SRS2）是犬新孢子虫的重要表面抗原，具有免疫原性和保护作用。MICs在侵袭过程中介导寄生虫黏附，以复合物形式从寄生虫顶端排出；重组NcMIC4免疫小鼠可诱导保护性体液免疫。在ROPs中，NcROP2被广泛研究作为疫苗候选分子。GRA67和GRA78也参与寄生虫侵袭，已被探索用于疫苗开发。因此，阐明犬新孢子虫的毒力相关效应蛋白对于确定有效的疫苗靶点至关重要。

**2. 材料与方法**
2.1. 细胞和寄生虫培养
犬新孢子虫速殖子（Nc-1株）、hTERT细胞和Vero细胞（用于培养犬新孢子虫速殖子）在我们实验室中维持。细胞在正常生长培养基Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）中培养，该培养基添加了10%胎牛血清（Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel）、2 mM L-谷氨酰胺和50 μg/mL青霉素-链霉素（Life Technologies, CA, USA），培养条件为37°C和5% CO2。寄生虫的纯化方法如前所述。

2.2. 动物实验和伦理声明
所有动物实验均严格遵循国务院批准的《实验动物管理条例》，并获得了吉林大学动物福利与研究伦理委员会的批准（IZA许可证号：SY202407010）。C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠购自辽宁长盛实验动物中心，饲养在吉林大学国家实验教学示范中心的空调动物设施中，提供充足的水和普通小鼠饲料。

2.3. NcTKL1蛋白表达和抗NcTKL1多克隆抗体的制备
采用Trizol方法提取犬新孢子虫的总RNA。将Trijol溶液（Tiangen, Beijing, China）加入纯化的犬新孢子虫速殖子中以获得RNA。RNA浓度通过Nanodrop ND-2000核酸微量滴定仪（Thermo, CA, USA）测定。提取的RNA使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（TransGen Biotech, Beijing, China）逆转录为cDNA。NcTKL1的序列通过ToxoDB网站（NCLIV_012770）获得，上游和下游引物由Sangon（Shanghai, China）设计并合成：上游引物序列为5′-CGCGGATCCCTGGACGCGTTCTTCGA-3′，下游引物序列为5′-ACGCGTCGACGAACTCGACGCGGAA-3′。以犬新孢子虫cDNA为模板进行PCR扩增，条件为98℃预热2分钟，随后进行30个循环：98℃ 30秒、56℃ 5秒、72℃ 3分钟，最后72℃延伸7分钟。正确克隆片段连接到pET-28a载体上，转化至Transetta（DE3）感受态细胞（Tiangen, Beijing, China）。IPTG诱导后纯化重组蛋白。

BALB/c小鼠接受纯化的NcTKL1蛋白免疫，每次注射50 μg蛋白，使用Freund's完全佐剂（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）（初次免疫）或Freund's不完全佐剂（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）（后续免疫）。免疫间隔14天，共注射三次。最后一次免疫后14天收集血清以获得抗NcTKL1多克隆抗体。抗体滴度通过ELISA测定，血清储存在-20℃备用分析。

2.4. 通过间接免疫荧光（IFA）检测NcTKL1在犬新孢子虫中的定位
将圆形盖玻片放入12孔细胞培养板中，每孔接种1×10^6个Vero细胞，再加入1×10^6个纯化的速殖子。感染15小时后，用戊二醛固定细胞15分钟，用Triton X-100溶液（Sigma Aldrich, Shanghai, China）渗透10分钟，然后用3%牛血清白蛋白（BSA, Biosharp, Beijing, China）封闭2小时。盖玻片在4℃下过夜孵育，加入一抗：小鼠抗NcTKL1多克隆抗体和兔抗NcSAG1多克隆抗体（NcSAG1为参考标记抗原）。洗涤后，在室温下加入二抗：Alexa Fluor 488荧光标记的抗小鼠IgG抗体和Alexa Fluor 594荧光标记的抗兔IgG抗体（1:200, Proteintech, Wuhan, China）孵育1小时。用DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚, Life Technologies, Carlsbad, USA）对细胞核进行染色。最后使用激光扫描共聚焦显微镜（FV1000, Olympus, Tokyo, Japan）获取图像。

2.5. 构建NcTKL1缺失株
通过ToxoDB网站（https://toxodb.org/toxo/app/）查询NcTKL1基因序列，筛选含有PAM序列的预间隔序列，并使用NEBase Changer网站（https://nebasechanger.neb.com/）设计插入前后的同源序列。引物序列如下：上游引物F1，下游引物R1。随后使用Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit（New England Biolabs, Massachusetts, USA）合成Nc-pSAG1-Cas9: U6-SgUPRT-NcTKL1载体，并通过PCR和测序验证。通过数据库查询NcTKL1基因信息，以pNC-DHFR为模板设计引物（上游引物F2，下游引物R2）。PCR扩增产物进行测序。将6 μg重组质粒与2 μg同源重组片段混合在100 μL Cytomix缓冲液中。犬新孢子虫速殖子纯化后计数，稀释至1×10^7/300 μL，与上述溶液混合。电穿孔后迅速转移至含有1 μmol/L嘧啶胺（Yuanye Biology, Shanghai, China）的hTERT细胞中。这些敲除菌株在96孔板中进行了单克隆筛选，并使用组织基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biochemical Technology，北京，中国）提取了单克隆菌株的基因组以进行PCR验证。如上所述，通过PCR和IFA正确鉴定了单克隆菌株。PCR引物如下：上游引物序列为F3，下游引物序列为R3。反应条件为98°C预热2分钟，随后进行30个循环：98°C 30秒、56°C 5秒、72°C 5秒，最后在72°C下延伸5分钟。

**名称** **序列（5' - 3'）**
F1 gcgagcgctgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCR
1 aggagacttcAAACAACAATGTCCCTTTG
F2 GGTGGCGTCGCGCGTGGGGGGAGGTAAGCTTTACTCGTCGCCAGCAGTR
R2 TTCCCTGTGGCGGTCGGCGCCGCGGGTCGGAATTTAGGTCGGAAAAGT
F3 AAGAAGCCGTCGATTTGGR

**2.6. 斑块测定**
通过Percoll方法纯化N. caninum速殖子，并将其加入到12孔板中的hTERT细胞单层培养物中（每孔100个速殖子）。然后将板子在37°C下孵育7天，期间不移动。之后用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤板子，用甲醇（Fuyu，天津，中国）固定，并用2%结晶紫（Sigma Aldrich，上海，中国）染色以观察宿主细胞损伤区域。

**2.7. 侵袭性和复制性测定**
1×10^6个Vero细胞在37°C下被3×10^6个纯化的N. caninum速殖子感染4小时。随后，细胞用无菌PBS洗涤三次，更换为含有1% FBS的RPMI-1640培养基，然后在37°C下孵育18小时。细胞再次用无菌PBS洗涤，接着分别用甲醛、Triton X-100溶液（Servicebio，武汉，中国）和3% BSA（Servicebio，武汉）进行固定和通透处理。接下来，使用小鼠抗N. caninum SAG1多克隆抗体作为一抗（1:50）和Alexa Fluor 594荧光标记的二抗（Proteintech，武汉，1:200）进行IFA。通过荧光显微镜计数每个病毒颗粒（PV）中的寄生虫数量。由于寄生虫的特性，在本文描述的侵袭实验中，侵袭率是基于综合表型（侵袭能力+早期复制能力）来测量的。侵袭率的百分比是指每个宿主细胞中的空泡数量；复制率的百分比是指每个空泡中包含1、2、4、8个速殖子的数量。

**2.8. 体内毒力测定**
将45只6周大的雌性C57BL/6小鼠随机分为三组，每组15只，包括一个Nc-1菌株感染组（每只小鼠腹腔内注射2.5×10^7个速殖子）、一个ΔNcTKL1菌株感染组（每只小鼠腹腔内注射2.5×10^7个速殖子）以及一个PBS对照组。每天称重并观察小鼠的存活情况（n=10）。五天后，每组随机处死五只小鼠。收集的血清用于根据制造商的说明使用ELISA试剂盒检测IL-6、IL-12/IL-23（总p40）、TNF-α和IFN-γ（Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）的分泌情况。从纯化的N. caninum速殖子（计数为1×10^7个寄生虫/mL）中提取基因组DNA，作为10倍梯度稀释的标准模板。每个稀释度都进行实时荧光定量PCR扩增，并根据获得的Ct值绘制标准曲线。提取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑组织进行定量PCR（qPCR）以检测寄生虫数量（上游引物：5'-ACTGGAGGCACGCTGAACAC-3'，下游引物：5'-AACAATGCTTCGCAAGGAA-3'）。同时，这些组织用苏木精-伊红染色，并在显微镜下观察组织病理变化。

**2.9. ΔNcTKL1速殖子的保护作用测定**
将90只6周大的雌性C57BL/6小鼠随机分为6组，每组15只，包括PBS组（小鼠注射等量的PBS缓冲液作为空白对照）、免疫后10天（d.p.i.）组（小鼠在免疫后10天注射2.5×10^7个Nc-1菌株和2.5×10^7个ΔNcTKL1速殖子）、免疫后20天（d.p.i.）组（小鼠在免疫后20天注射2.5×10^7个Nc-1菌株和2.5×10^7个ΔNcTKL1速殖子）、免疫后30天（d.p.i.）组（小鼠在免疫后30天注射2.5×10^7个Nc-1菌株和2.5×10^7个ΔNcTKL1速殖子）、免疫后40天（d.p.i.）组（小鼠在免疫后40天注射2.5×10^7个Nc-1菌株和2.5×10^7个ΔNcTKL1速殖子）以及未免疫组（小鼠未进行免疫注射2.5×10^7个Nc-1菌株）。观察每组10只小鼠的存活情况15天。每组剩余的五只小鼠在感染后5天被处死，并分离血清使用ELISA试剂盒检测细胞因子的产生（Thermo Fisher，马萨诸塞州，美国）。提取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑组织以观察组织病理变化并通过qPCR检测寄生虫数量。

**2.10. 统计分析**
数据使用GraphPad Prism版本6（GraphPad，美国）进行分析。使用非配对t检验比较两组数据，而使用单因素ANOVA和Tukey检验比较多组数据。使用log-rank（Mantel–Cox）检验比较组间的生存曲线。P < 0.05被认为具有统计学意义。

**3. 结果**
**3.1. NcTKL1蛋白位于N. caninum的细胞核中**
对信号肽（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）和跨膜结构域（https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM）的分析显示NcTKL1既不含信号肽也不含跨膜结构域（图1A，B）。为了研究NcTKL1在N. caninum中的亚细胞定位，获得了重组NcTKL1蛋白和抗NcTKL1多克隆抗体。通过PCR成功扩增了NcTKL1目标基因的1072 bp片段（图1C）。随后构建了重组质粒pET-28a-NcTKL1并通过双酶消化验证（图1D）。重组NcTKL1蛋白以可溶形式表达，分子量约为39 kDa（图1E）。IFA进一步证明NcTKL1定位于寄生虫的细胞核中（图1F）。

**3.2. NcTKL1缺失影响N. caninum的生长、侵袭性和复制性**
为了表征NcTKL1在N. caninum中的作用，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了ΔNcTKL1菌株，并展示了基因敲除的实验流程示意图（图2A）。通过PCR确认ΔNcTKL1菌株中NcTKL1基因的成功删除（图2B）。IFA进一步证明ΔNcTKL1速殖子中不存在NcTKL1表达（图2C），表明ΔNcTKL1菌株已成功建立。随后通过斑块测定、侵袭性和复制性测定进行了表型分析。结果显示，ΔNcTKL1的斑块大小（66.52%，P < 0.0001）和侵袭率（58.62%，P < 0.0001）显著低于野生型Nc-1菌株（图2D-F）。此外，ΔNcTKL1菌株的细胞内复制率也显著低于野生型菌株（图2G）。总体而言，这些数据表明NcTKL1缺失显著抑制了N. caninum的生长、侵袭性和复制性。

**3.3. NcTKL1对N. caninum毒力至关重要**
为了评估NcTKL1是否影响N. caninum的毒力，用野生型Nc-1或ΔNcTKL1速殖子感染小鼠。结果显示，注射野生型Nc-1菌株的小鼠在感染后10天内死亡，而所有ΔNcTKL1感染组的小鼠均存活（图3A）。血清细胞因子分析显示，ΔNcTKL1感染小鼠的IL-6、IFN-γ和TNF-α分泌水平显著降低（分别为69.69%、56.08%和30.79%），而IL-12/IL-23（总p40）的分泌水平两组之间没有显著差异（图3B）。ΔNcTKL1感染组的心脏（82.37%）、肝脏（86.77%）、脾脏（86.08%）、肺（87.85%）和肾脏（79.31%）组织中的寄生虫负荷显著低于Nc-1感染组，但大脑除外（图3C）。组织病理检查显示，Nc-1感染导致明显的组织损伤，包括大脑中的脑水肿和神经元萎缩、脾脏中动脉淋巴鞘周围的纤维蛋白沉积、肝脏中的脓肿灶以及肺中的间质塌陷和炎症细胞浸润。相比之下，ΔNcTKL1感染小鼠的这些病理变化显著减轻（图3D）。这些结果表明NcTKL1是N. caninum的关键毒力因子。

**3.4. 用ΔNcTKL1速殖子免疫可提供对N. caninum感染的保护**
为了确定ΔNcTKL1是否可作为疫苗候选株，C57BL/6小鼠被腹腔注射ΔNcTKL1菌株，并在免疫后10天、20天、30天和40天取样。细胞因子分析显示，免疫后10天组的小鼠血清中的IL-6、IL-12/IL-23（总p40）、TNF-α和IFN-γ水平最高（图4A-D）。随后，用ΔNcTKL1免疫的小鼠和未免疫对照组分别用Nc-1速殖子攻击，以评估保护效果，包括存活率、寄生虫负荷、细胞因子反应和病理变化。数据显示，免疫后10天时寄生虫负荷显著减少，心脏减少约73.3%（P < 0.001），肝脏减少69.45%（P < 0.05），脾脏减少73.73%（P < 0.01），肺减少74.74%（P < 0.05），肾脏减少74.51%（P < 0.01）（图5A）。相应地，免疫后10天、20天、30天和40天组的存活率分别为100%、90%、10%和0%（图5B）。组织病理检查显示，Nc-1感染导致严重的病变，包括肝脏小叶静脉周围的炎症细胞浸润和肝细胞变性、心肌纤维中的血管出血、脾脏中的出血、肺泡壁增厚以及肾脏中的炎症细胞浸润。相比之下，免疫ΔNcTKL1 10天和20天的小鼠在攻击后病理损伤显著减轻（图6）。这些结果表明，ΔNcTKL1菌株免疫为小鼠提供了有效的保护。

**3.4. 用ΔNcTKL1速殖子免疫可提供对N. caninum感染的保护**
为了确定ΔNcTKL1是否可作为疫苗候选株，C57BL/6小鼠被腹腔注射ΔNcTKL1菌株，并在免疫后10天、20天、30天和40天取样。细胞因子分析显示，免疫后10天组的小鼠血清中的IL-6、IL-12/IL-23（总p40）、TNF-α和IFN-γ水平最高（图4A-D）。随后，用ΔNcTKL1免疫的小鼠和未免疫对照组分别用Nc-1速殖子攻击，以评估保护效果，包括存活率、寄生虫负荷、细胞因子反应和病理变化。数据显示，免疫后10天时寄生虫负荷显著减少，心脏减少约73.3%（P < 0.001），肝脏减少69.45%（P < 0.05），脾脏减少73.73%（P < 0.01），肺减少74.74%（P < 0.01），肾脏减少74.51%（P < 0.01）（图5A）。相应地，免疫后10天、20天、30天和40天组的存活率分别为100%、90%、10%和0%（图5B）。组织病理检查显示，Nc-1感染导致严重的病变，包括肝脏小叶静脉周围的炎症细胞浸润和肝细胞变性、心肌纤维中的血管出血、脾脏中的出血、肺泡壁增厚以及肾脏中的炎症细胞浸润。相比之下，免疫ΔNcTKL1 10天和20天的小鼠在攻击后的病理损伤显著减轻（图6）。IL-6、IL-12/IL-23（总p40）、TNF-α和IFN-γ的分泌量是通过ELISA试剂盒测量的，数据表示为三次独立实验的平均值±标准差。**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，无显著性。**下载：下载高分辨率图片（508KB）**下载：下载全尺寸图片**图5. 用ΔNcTKL1速殖子免疫可以保护小鼠免受N. caninum感染。(A) 通过qPCR测量了未免疫组以及接种后10天、20天、30天和40天的小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和脑组织中的寄生虫负荷。(B) 记录了用ΔNcTKL1速殖子免疫的小鼠在接触Nc-1速殖子后的存活率。数据表示为三次独立实验的平均值±标准差。*P < 0.05；***P < 0.001，****P < 0.0001，NS，无显著性。**下载：下载高分辨率图片（2MB）**下载：下载全尺寸图片**图6. 用ΔNcTKL1菌株免疫的小鼠组织病理变化。观察了心脏、肝脏、脾脏、肺和脑的苏木精-伊红染色病理变化。比例尺，100 μm。**4. 讨论**在许多真核生物中，TKLs在结构和催化活性方面都作为丝氨酸/苏氨酸激酶发挥作用。TKL家族蛋白存在于各种生物中，包括动物、植物和原生生物，但在真菌中明显缺失。23 TKLs也广泛分布于顶复门寄生虫中，如T. gondii、Plasmodium和Cryptosporidium。在T. gondii中，TgTKL1和TgTKL2定位于细胞核，而TgTKL3和TgTKL4位于细胞质中，TgTKL5定位于内膜复合体。12 在Plasmodium中，PfTKL3对无性生殖阶段至关重要。然而，其他PfTKL成员的分子机制及其在致病中的作用仍不清楚。在Cryptosporidium中，CpTKL1和CpTKL2分别由大约659个和632个氨基酸组成，每个都在C端含有一个激酶结构域。此外，CpTKL1还包含一个无菌α基序（SAM）结构域。CpTKL3由751个氨基酸组成，其激酶结构域位于C端附近，并在N端区域包含膜占据和识别连接结构域以及SAM结构域。13 在本研究中，与TgTKL1类似，NcTKL1定位于寄生虫细胞核。NcTKL1的完整氨基酸序列缺乏信号肽，且没有跨膜结构域，预测它是一种非膜蛋白。24 TKL家族在不同寄生虫中扮演着多样且关键的角色，特别是在调节寄生虫生长和发育方面。例如，TgTKL4是一种细胞周期调控激酶，在S期和M/C（有丝分裂-胞质分裂）期表达达到峰值。TgTKL4缺陷的T. gondii表现出异常的细胞骨架结构，尤其是膜下微管变得更短且间距更宽。25 同样，PfTKL3功能的损伤会阻止寄生虫完成无性生殖阶段，导致血液阶段的增殖受阻。13 TKL还可能影响寄生虫的侵袭、附着和毒力。敲除TgTKL1会减少宿主细胞的附着和侵袭，并导致小鼠完全失去毒力。12 与这些发现一致，我们的研究表明，删除NcTKL1显著抑制了寄生虫的生长，这一点通过斑块测定得到证实。进一步的实验显示ΔNcTKL1的侵袭和增殖能力降低，影响了N. caninum的生长。此外，在ΔNcTKL1感染的小鼠中观察到组织损伤减轻。总体而言，NcTKL1的缺失导致N. caninum的生长、侵袭和复制能力受损。目前，疫苗接种仍然是预防N. caninum感染的主要策略。唯一的商业灭活疫苗（Neoguard?）由于免疫原性低且不稳定而被撤出市场。1 已有多种实验疫苗被报道，包括亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗。在减毒菌株中，ΔNcMYR1在小鼠中可提供100%的存活率。14 在本研究中，感染ΔNcTKL1菌株的小鼠也表现出100%的存活率，表明该菌株的毒力显著降低。此外，用ΔNcTKL1免疫10天的小鼠存活率为100%，肝脏、脾脏和脑中的寄生虫负荷显著减少，肝脏和肺部的病理病变也有所减轻。这些发现表明ΔNcTKL1菌株对N. caninum感染具有有效的保护作用，可能是一种有前景的减毒活疫苗候选者。然而，这项研究仍存在局限性。首先，所有实验都是在C57BL/6小鼠模型中进行的，这是一个用于研究新孢子虫病的成熟实验系统。然而，小鼠的免疫反应和疾病进展可能与自然宿主（牛和羊）有所不同。因此，需要在目标家畜物种中进行验证。我们未来将在羊身上进行进一步的研究。其次，保护性免疫的持续时间似乎有限，因为30天和40天免疫组的存活率较低，这表明ΔNcTKL1诱导的免疫记忆可能是短暂的。第三，没有构建互补（基因拯救）菌株；因此，未来的研究应包括这些菌株以确认观察到的表型确实是由NcTKL1缺乏引起的。总之，我们发现NcTKL1定位于N. caninum速殖子的细胞核中。其缺失与寄生虫生长、侵袭和复制能力降低有关。此外，用ΔNcTKL1速殖子免疫可以提供有效的N. caninum感染保护，表明其作为新孢子虫病疫苗候选者的潜力。**动物福利声明**根据吉林大学批准的方案，所有动物实验均严格遵循动物福利和研究伦理委员会（IACUC许可号：SY202407010）的指南进行。**资助**本工作得到了中国国家自然科学基金（编号32503071）和吉林省教育厅科研项目（编号JJKH20241318KJ）的支持。**CRediT作者贡献声明**张楠：撰写 – 审稿与编辑。龚鹏涛：研究。刘振珍：方法学。李欣：研究。王晓岑：研究。张云汉：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究。杜博雅：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究。王向杰：撰写 – 原稿、方法学、研究。李建华：撰写 – 审稿与编辑、概念化。张旭：方法学。李贺：撰写 – 审稿与编辑。**利益冲突声明**作者声明没有利益冲突。