白蛋白、球蛋白以及白蛋白与球蛋白比值与脑小血管疾病之间的关联

《Stroke and Vascular Neurology》：Associations of albumin, globulin and albumin-to-globulin ratio with cerebral small vessel disease

　　摘要
背景
白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）和白蛋白与球蛋白比值（AGR）与血管疾病有关，但它们与脑小血管疾病（CSVD）的关系尚未得到充分研究。本研究旨在探讨这些生物标志物与CSVD负担之间的关联。

方法
研究对象来自“多血管评估认知障碍和血管事件”（PRECISE）研究。CSVD的严重程度通过白质高信号（WMH）、基底节周围血管空间扩大（BG-EPVS）、腔隙和脑微出血等指标来评估。采用逻辑回归和双样本孟德尔随机化（MR）方法来估计关联性和潜在的因果效应。

结果
在3042名受试者（平均年龄61.2岁）中，调整混杂因素后，较低的ALB、较高的GLB和较低的AGR与较高的总CSVD负担和修正后的CSVD负担显著相关。具体而言，与相应参考组相比，最低ALB三分位数（校正后的比值比cOR 1.31，95% CI 1.07至1.60）、最高GLB三分位数（cOR 1.33，95% CI 1.09至1.63）和最低AGR三分位数（cOR 1.46，95% CI 1.19至1.79）的CSVD负担风险显著增加。WMH和BG-EPVS也表现出类似的模式。MR分析显示，遗传预测的ALB与WMH体积呈负相关（β ?0.07，95% CI ?0.13至?0.01），而遗传预测的GLB与WMH体积呈正相关（β 0.05，95% CI 0.01至0.10）。

结论
较低的ALB、较高的GLB和较低的AGR与CSVD负担增加有关。遗传证据支持ALB和GLB在WMH发展中的因果作用。

关于该主题的现有知识
脑小血管疾病（CSVD）是中风和认知衰退的主要诱因，尽管白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）和白蛋白与球蛋白比值（AGR）与血管健康有关，但它们与CSVD总负担和遗传因果关系的具体关联仍不明确。

本研究的新发现
本研究确定，较低的ALB和AGR以及较高的GLB水平与CSVD负担增加显著相关；特别是，孟德尔随机化分析提供了遗传证据，支持较低ALB和较高GLB与白质高信号体积增加之间的因果联系。

本研究对研究、实践或政策的可能影响
这些发现表明，血清蛋白生物标志物可以作为识别CSVD高风险个体的成本效益工具，并突出了潜在的系统性炎症和营养途径作为未来预防策略的目标。

引言
脑小血管疾病（CSVD）是最常见的神经病理过程，长期以来被认为与中风和痴呆有关，约占中风的20%和痴呆的45%。随着CSVD负担的增加，人们越来越关注可改变的风险因素，以减轻疾病负担。目前，系统性炎症被认为是CSVD的潜在病因因素。病理生理学和流行病学证据表明，炎症标志物与CSVD密切相关。血清白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）作为血清蛋白的关键成分，是血管疾病的传统炎症标志物，具有重要的预测和预后价值。ALB具有急性期负蛋白功能，而GLB主要由免疫球蛋白和急性期蛋白组成。低ALB和高GLB与血脑屏障损伤、慢性炎症反应和内皮功能障碍密切相关，可能影响CSVD的发展。最近的研究显示，GLB成分（尤其是C反应蛋白（CRP）与CSVD影像学表型呈正相关。证据表明，ALB水平降低在血管疾病的发病率和预后中起着重要作用。此外，包含ALB和GLB的白蛋白与球蛋白比值（AGR）与血管疾病患者的不良结局独立相关。然而，ALB、GLB和AGR与CSVD负担及神经影像学标志物的关联尚未完全明确。因此，本研究旨在探讨ALB、GLB和AGR与社区居民CSVD严重程度和神经影像学表型之间的关系。双样本孟德尔随机化（MR）分析评估了ALB和GLB与CSVD影像学标志物的遗传关联。

研究设计和参与者
本研究基于“多血管评估认知障碍和血管事件”（PRECISE）研究的基线数据。该研究的总体设计和原理已在早期出版物中详细说明。PRECISE是一项前瞻性、基于人群的队列研究，采用先进的血管成像技术，能够全面评估参与者的多区域动脉狭窄和斑块负担。该研究还前瞻性地收集血管事件数据并进行认知评估。参与者为50至75岁的社区居民，来自中国浙江省丽水市的四个社区和六个村庄，招募时间跨度为2017年至2019年。选择这些地点是因为其人口稳定且迁移较少。所有符合条件的个体（无CT血管造影（CTA）和MRI禁忌症）均被邀请参与。如果个体在至少三次不同日期的联系尝试后仍未回应，则被排除。共有3067名参与者完成了基线评估，其基线特征具有代表性。

基线数据收集
数据收集由接受过专业培训的研究人员按照标准化协议进行。通过面对面临床访谈和标准化体检系统地评估了基线人口统计特征（年龄和性别）、风险因素（血压、体重指数（BMI）、吸烟状况和饮酒情况）、疾病史（血脂异常、高血压和糖尿病）以及用药史（降脂药、降压药和降糖药）。基线时从同意的参与者处采集空腹静脉血。按照标准实验室程序测量肌酐、甘油三酯、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、糖化血红蛋白（HbA1c）和空腹血糖（FPG）。BMI使用广泛接受的公式计算（体重（公斤）除以身高（米）的平方）。当满足以下任一标准时，诊断为血脂异常：LDL-C水平≥160 mg/dL，HDL-C水平≤40 mg/dL，TC水平≥240 mg/dL，或医生确诊为血脂异常。糖尿病的诊断标准包括FPG水平≥7.0 mmol/L，2小时负荷后血糖水平≥11.1 mmol/L，HbA1c水平≥6.5%，或医生自我诊断为糖尿病，或正在接受降糖药物治疗。高血压的诊断标准为收缩压（SBP）≥140 mmHg，舒张压（DBP）≥90 mmHg，或医生诊断为高血压。

血清ALB、GLB和AGR
经过一夜禁食后，采集静脉血样本并冷冻保存以备分析。使用Abbott C16000分析仪（Abbott Laboratories，芝加哥，美国）通过比色法测定总蛋白（TP），通过溴甲酚绿法测定ALB。计算GLB浓度时，从TP值中减去ALB值，然后通过ALB浓度除以GLB浓度得到AGR。

MRI采集和评估
MRI数据使用3.0T MRI扫描仪（Ingenia 3.0T，Philips，荷兰Best）根据标准协议采集。成像序列包括三维T1加权磁化准备快速梯度回波（MPRAGE）、轴向T2加权成像液体衰减反转恢复（FLAIR）和轴向磁化率加权成像（SWI）。所有数字成像和通信医学（DICOM）数据存档并传输至北京天坛医院影像研究中心，进行集中分析和解释。

CSVD标志物的评估
根据“神经影像学变化报告标准”对CSVD标志物进行分类。白质高信号（WMH）表现为T2加权异常，周围脑室（PV-WMH）和深部WMH（D-WMH）的严重程度通过Fazekas量表分级。周围血管空间扩大（EPVS）表现为≤3毫米的点状/线性T2高信号，基底节EPVS（BG-EPVS）使用爱丁堡评分系统量化。腔隙表现为T2/FLAIR上的3–15毫米脑脊液等信号椭圆形病变，脑微出血（CMBs）表现为SWI上的2–10毫米低信号灶。为确保评估准确性，两名经过培训的评分者在不知道任何临床信息的情况下独立进行评估。在评分不一致的情况下，由资深神经科医生进行裁决，保持评审过程的公正性。使用Cohen’s kappa统计量定量分析评分者之间的一致性：WMH使用Fazekas量表（PV-WMH和D-WMH各0–3分），腔隙和CMBs基于存在/不存在（二分分类），EPVS根据基底节区域是否存在≥20个EPVS确定。分析显示所有标志物的可靠性良好（WMH：kappa=0.82；EPVS：kappa=0.90；腔隙：kappa=0.80；CMBs：kappa=0.80）。

总CSVD负担的评估
使用Wardlaw和Rothwell提出的两种成熟且经过验证的分级系统进行评估。总CSVD评分（Wardlaw量表；范围0–4）：（1）中度至重度WMH（周围脑室Fazekas评分3分和/或深部Fazekas评分2–3分）；（2）中度至重度BG-EPVS（基底节≥10个扩大血管空间）；（3）≥1个腔隙；（4）≥1个CMB。修正后的总CSVD评分（Rothwell量表；范围0–6）：（1）WMH负担，总Fazekas评分3–4分得1分，5–6分得2分；（2）BG-EPVS，中度至重度负担（基底节≥20个扩大血管空间）得1分；（3）腔隙，存在≥1个病灶得1分；（4）CMB负担，1–4个CMB得1分，≥5个CMB得2分。两种系统中，总分为0表示无CSVD影像学标志物，≥1表示存在CSVD标志物。

MR研究设计
进行双样本MR分析，以评估ALB和GLB与CSVD影像学标志物（包括WMH体积、BG-EPVS、腔隙性中风和CMBs）之间的关联。该方法利用减数分裂期间随机分配的遗传变异作为工具变量（IVs），从而在使用全基因组关联研究（GWAS）数据时最小化混杂因素。MR分析中使用的遗传工具必须满足三个基本原则：首先，遗传工具与暴露因素（ALB或GLB）密切相关；其次，遗传工具与潜在混杂因素无关；第三，遗传工具应通过暴露因素（ALB或GLB）影响疾病（CSVD影像学标志物），而非其他途径。

总结
本研究探讨了ALB、GLB和AGR与社区居民CSVD严重程度和神经影像学表型之间的关系。双样本孟德尔随机化（MR）分析评估了ALB和GLB与CSVD影像学标志物的遗传关联。在磁共振（MR）分析中使用的所有摘要统计数据主要来自由欧洲血统参与者组成的研究。统计分析中，分类变量以频率和比例表示，连续变量则报告为其平均值及其相应的标准差（SD）。通过比较Wardlaw和Rothwell团队开发的评分系统，评估了患有CSVD（总CSVD负担≥1）的个体与未患CSVD（总CSVD负担=0）的个体的特征。对于统计比较，使用χ2检验来分析分类变量，而t检验用于分析连续变量。为了评估ALB、GLB和AGR与CSVD负担及神经影像学标志物之间的关系，我们构建了二元和序数逻辑回归模型。序数逻辑回归模型提供了ALB、GLB和AGR与总CSVD负担、修正后的总CSVD负担以及特定CSVD影像学标志物（如修正后的WMH负担和CMB负担）之间关联的见解。计算了常见的比值比（OR）及其相应的95%置信区间（CI），以更清晰地展示这些关系。除了序数模型外，我们还使用二元逻辑回归模型进一步探讨了ALB、GLB和AGR与其他各种CSVD影像学标志物之间的关系。这涉及计算这些关系的OR及其相应的95% CI。对于每个因变量，我们构建了未调整和调整后的模型。在调整后的模型中，控制了潜在的混杂因素，包括年龄、性别、BMI、LDL-C、eGFR、当前饮酒情况、当前吸烟情况、糖尿病、高血压、血脂异常以及降脂药物的使用。为了进一步仔细研究ALB、GLB和AGR与总CSVD负担或修正后的总CSVD负担之间的关系，我们采用了包含限制性三次样条的序数逻辑回归模型。在这项分析中，我们使用第5、25、50、75和95百分位数作为样条节点，将ALB、GLB和AGR的第25百分位数指定为参考点。我们的统计分析非常严谨，并通过假发现率（FDR）校正进行了多重比较的调整，结果以P_FDR表示。应用P_FDR<0.05的阈值来定义统计显著性。我们还使用双样本MR来评估ALB和GLB对CSVD影像学标志物的因果效应。主要评估采用了随机效应逆方差加权（IVW）模型，通过广义加权线性回归结合了结果单核苷酸多态性（SNPs）对暴露SNPs效应的估计。我们从每个特征的摘要数据中选择了达到全基因组显著性水平（p<5×10^-8）的SNPs。这些SNPs被确保没有连锁不平衡，其r2值小于0.001。为了评估我们分析中使用的遗传变异的强度，我们计算了F统计量，并排除了任何低于10阈值的SNPs，因为担心它们的强度不足。为了识别结果中的任何潜在不一致性，我们使用了Cochran Q检验来评估数据中的异质性。此外，MR-Egger截距检验是评估任何潜在水平多效性效应的宝贵工具。为了增强我们发现的稳健性，我们进行了一系列敏感性分析，实施了多种替代的MR方法，包括加权模式、简单模式、加权中位数和MR-Egger回归。在呈现我们的效应估计时，我们报告了相对于暴露增加一个标准差（1-SD）的变化，对于连续结果以β系数表示，对于二分类结果以OR表示，两者都附有95% CI。所有分析都包含了FDR校正，统计显著性定义为P_FDR<0.05。

所有统计分析均使用SAS软件V 9.4（SAS Institute, Inc, Cary, NC）和R 4.0.3（R Development Core Team）进行。

在这项研究中，我们在基线时招募了3067名成年居民。排除19名患有严重肝胆疾病的个体、2名没有ALB或GLB数据的个体以及4名没有用于评估CSVD标志物的影像序列的个体后，最终分析了3042名受试者（见eFigure 1）。受试者的平均年龄为61.2±6.7岁，其中1631人（53.6%）为女性。根据总体CSVD评分，有926人（30.4%）患有CSVD；当考虑修正后的总CSVD评分时，这一数字增加到1265人（41.6%）。被诊断为CSVD的组别通常年龄更大，男性参与者比例更高。此外，该组别中高血压和糖尿病的患病率也显著增加。患有CSVD的参与者更依赖各种用于管理其病情的药物，包括抗高血压药、抗糖尿病药和降脂药。此外，他们在几个关键健康指标上的水平也更高，如SBP、DBP、FPG和GLB。相反，这一组的LDL-C、eGFR、ALB和AGR水平较低，详见表1。

图1显示了ALB、GLB和AGR三分位数之间的CSVD负担分布。在调整了潜在混杂因素后，ALB第一分位数的参与者与总CSVD负担（cOR 1.31，95% CI 1.07至1.60，p=0.01，P_FDR=0.045）和修正后的总CSVD负担（cOR 1.25，95% CI 1.04至1.50，p=0.02，P_FDR=0.045）增加有关（见图2和在线补充eTable 3）。GLB第三分位数的参与者与总CSVD负担（cOR 1.33，95% CI 1.09至1.63，p=0.01，P_FDR=0.045）和修正后的总CSVD负担（cOR 1.23，95% CI 1.02至1.48，p=0.03，P_FDR=0.09）增加有关（见图2和在线补充eTable 4）。AGR第二分位数的受试者总CSVD负担较高（cOR 1.31，95% CI 1.07至1.61，p=0.01，P_FDR=0.06），而AGR第一分位数的受试者总CSVD负担更高（cOR 1.46，95% CI 1.19至1.79，p=<0.001，P_FDR=0.005）和修正后的总CSVD负担更高（cOR 1.31，95% CI 1.09至1.58，p=0.004，P_FDR=0.01）（见图2和在线补充eTable 5）。限制性三次样条回归分析的结果进一步表明，较低的ALB水平、较高的GLB水平和较低的AGR水平与总CSVD负担和修正后的总CSVD负担增加有关（见图3）。ALB、GLB和AGR与CSVD影像学标志物也观察到了类似的关联。ALB第一分位数与修正后的WMH负担增加（cOR 1.25，95% CI 1.03至1.52，p=0.02，P_FDR=0.045）和中度至重度BG-EPVS的风险增加（OR 1.62，95% CI 1.17至2.25，p=0.004，P_FDR=0.03）有关，与第三分位数相比（见图4和在线补充eTable 3）。GLB第二分位数的受试者修正后的WMH负担增加（cOR 1.26，95% CI 1.03至1.54，p=0.02，P_FDR=0.18），而GLB第三分位数的受试者修正后的WMH负担增加（cOR 1.23，95% CI 1.01至1.50，p=0.04，P_FDR=0.09）和中度至重度BG-EPVS的风险增加（OR 1.70，95% CI 1.22至2.37，p=0.002，P_FDR=0.02）（见图4和在线补充eTable 4）。AGR第二分位数和第一分位数的参与者修正后的WMH负担增加（cOR 1.23，95% CI 1.01至1.50，p=0.04，P_FDR=0.09；cOR 1.34，95% CI 1.10至1.63，p=0.004，P_FDR=0.01）以及中度至重度BG-EPVS的风险增加（OR 1.54，95% CI 1.08至2.19，p=0.02，P_FDR=0.06；OR 2.17，95% CI 1.55至3.05，p<0.001，P_FDR=0.005）与第三分位数相比（见图4和在线补充eTable 5）。然而，ALB、GLB和AGR与腔隙和CMB之间没有统计学上的显著关系。

IVW分析显示，遗传上升的ALB与较小的WMH体积相关（β ?0.07，95% CI ?0.13至?0.01，每增加1个标准差的ALB，p=0.03，P_FDR=0.18），而遗传上升的GLB与较大的WMH体积相关（β 0.05，95% CI 0.01至0.10，每增加1个标准差的GLB，p=0.01，P_FDR=0.06）（见表2）。尽管Cochran Q检验显示IVW下的遗传变异存在异质性，但MR-Egger截距检验没有提供任何多效性效应的证据（见在线补充eTable 6）。值得注意的是，尽管这些关联未能通过FDR校正（所有P_FDR值均超过0.05），但在IVW和MR-Egger分析中观察到的一致模式和名义显著性（p<0.05）表明ALB和GLB可能参与了白质完整性（见在线补充eTable 7）。相比之下，ALB和GLB与腔隙性中风、BG-EPVS或CMB均无显著关联（见表2）。

我们的研究探讨了ALB、GLB和AGR与社区居住成人CSVD负担及神经影像学标志物之间的关系。我们发现，较低的ALB、较高的GLB和较低的AGR与更大的CSVD负担以及CSVD的神经影像学标志物WMH和BG-EPVS相关。此外，双样本MR分析揭示了遗传决定的ALB与WMH之间的负相关关系，以及遗传决定的GLB与WMH之间的正相关关系。ALB是一种负相蛋白，在炎症背景下会下降。相比之下，GLB包含多种与炎症相关的蛋白，反映了身体的炎症状态。同时考虑ALB和GLB的AGR可以更准确地指示身体的炎症状况。这三个标志物ALB、GLB和AGR是血管疾病的宝贵预测因子。大量研究表明，较高的GLB水平和较低的ALB及AGR水平与中风的发生率和不良结果独立相关。大量证据表明，CRP（GLB中最广泛研究的成分）与WMH和EPVS呈正相关。然而，另一项样本量较小的研究（n=396）未发现血清ALB与WMH之间的相关性。一些研究也报告说，升高的GLB与CMB数量增加有关，但并非所有研究都如此。尽管大多数关注腔隙的研究未能检测到显著关联。本研究扩展了关于ALB、GLB和AGR与社区居民CSVD负担及神经影像学标志物横断面关联的发现。与中风的结果一致，较低的ALB、较高的GLB和较低的AGR与更高的CSVD负担和WMH及BG-EPVS的风险增加相关。ALB和GLB对WMH的遗传预测效应也观察到了类似的关系。这些结果表明，ALB和GLB分别是CSVD的保护因素和风险因素。旨在提高ALB水平和降低GLB水平的策略可能有助于减少CSVD的负担。重要的是，即使在考虑了人口统计学差异、医疗史、药物使用、健康相关行为和其他CSVD风险因素等潜在混杂因素后，这些相关性仍然具有统计显著性。因此，这些发现突显了一个可能的目标生物途径，可以用来减轻CSVD负担。

几种可能的机制可以解释我们的研究结果。首先，ALB是血浆中的主要抗氧化剂，可以对抗外源性和内源性氧化应激。其次，ALB可以与各种内源性和外源性颗粒及药物结合。第三，ALB可能对与炎症反应和氧化应激相关的内皮功能障碍具有保护作用，而低白蛋白血症可能会增强这种病理生理机制。第四，ALB在维持毛细血管膜完整性和调节毛细血管壁的液体平衡方面起着重要作用。这一功能主要得益于其穿透胶体的能力及其与内皮细胞表面的糖萼的相互作用。第五，ALB还具有抗凝、抗血栓和抗血小板作用，有助于循环稳态。然而，GLB与CSVD之间的正相关机制尚不清楚。可能的解释包括：首先，GLB与ALB相互作用，因为它含有可以与ALB形成共价键的活性巯基。其次，血清GLB中升高的炎症细胞因子可能导致血清蛋白增加并抑制血清ALB的生物合成。第三，GLB可以在脑脊液中检测到，并参与神经炎症。尽管如此，还需要更多的研究来进一步阐明低血清ALB水平和高血清GLB水平与CSVD风险增加之间的机制。这项研究有几个显著的优点。首先，PRECISE研究采用了社区人群的集群抽样方法，确保参与者的 demographic characteristics（人口统计特征）与代表中国的全国性调查结果高度一致。这种一致性使得研究结果能够更自信地推广到更广泛的一般人群中，从而增强了从数据中得出的结论的相关性和影响力。其次，该研究使用了先进的成像技术，对CSVD（脑小血管疾病）进行了全面评估。然而，也存在一些局限性需要讨论。首先，本研究采用了横断面设计，这本质上限制了确定因果关系或捕捉CSVD标志物随时间动态变化的能力。尽管进行了MR（磁共振）分析以研究ALB（白蛋白）和GLB（葡萄糖醛酸结合蛋白）与特定CSVD表型之间的因果关联，但由于缺乏可用的GWAS（全基因组关联研究）汇总统计数据，ALB和GLB与CSVD负担之间的因果关系，以及AGR（年龄相关葡萄糖代谢）与CSVD负担及成像标志物之间的因果关系仍未得到研究。因此，我们的发现应被视为关联而非确定的因果路径。其次，MR分析主要使用了来自欧洲人群的汇总统计数据，而PRECISE研究则包括东亚参与者。东亚和欧洲人群之间的遗传差异可能导致偏差。有必要进行大规模的前瞻性研究和针对东亚血统个体的GWAS来验证我们的结果。

**结论**
总体而言，ALB水平降低、GLB水平升高以及AGR水平降低与CSVD负担以及CSVD的神经影像学标志物（如WMH和BG-EPVS）呈正相关。这表明ALB水平升高和GLB水平降低可能对脑小血管具有保护作用。其临床意义和潜在的生物学机制需要在大规模前瞻性研究中得到验证。

**脚注**
YL和SL的贡献相同。

**作者贡献**
YP负责整体内容的监督。
研究构思与设计：YL、SL、YH和YP。
数据收集：XC、MW、QZ、JJ、TW、YoW和YiW。
数据解读指导：YoW和YiW。
数据解读与手稿撰写：YL、SL、YH和YP。
手稿编辑：YL、SL、YH和YP。
所有作者均阅读并批准了最终稿件。

**资助**
本研究得到了中国国家自然科学基金（82073648）、国家重点研发计划（编号2022YFC3602500、2022YFC3602505）以及首都医科大学杰出青年人才项目（A2105）的资助。

**利益冲突**
无声明。

**来源与同行评审**
本研究未委托第三方进行同行评审，而是由外部专家进行了同行评审。

**补充材料**
该内容由作者提供，未经BMJ Publishing Group Limited（BMJ）审核，可能也未经过同行评审。任何观点或建议仅代表作者本人，并不代表BMJ的观点。BMJ不对基于该内容的任何依赖承担责任。如果内容包含翻译材料，BMJ不保证翻译的准确性和可靠性（包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药物名称和剂量），并对因翻译和改编等原因导致的任何错误或遗漏不承担责任。

**数据可用性声明**
**伦理声明**
患者同意发表：不适用。
伦理批准：本研究涉及人类参与者，已获得北京天坛医院伦理委员会（IRB批准编号：KY2017-010-01）和丽水医院伦理委员会（IRB批准编号：2016-42）的批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。参与者在参与研究前已明确表示同意。

**致谢**
我们首先感谢PRECISE研究的参与者。
图表数量：4；表格数量：2；补充图表数量：1；补充表格数量：7；总字数：7091。