《Current Opinion in Chemical Biology》：Proximity chemistries to study RNA biology at the subcellular scale
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Rachel Shu Ting Chan | Kanokpol Aphicho | Bryan C. Dickinson芝加哥大学化学系，美国伊利诺伊州芝加哥市，60637RNA几乎可以优先定位到细胞内的每一个亚细胞区室中，从膜结合的细胞器、无膜的凝聚物到细胞表面，在那里它们与R
Rachel Shu Ting Chan | Kanokpol Aphicho | Bryan C. Dickinson
芝加哥大学化学系，美国伊利诺伊州芝加哥市，60637
RNA几乎可以优先定位到细胞内的每一个亚细胞区室中，从膜结合的细胞器、无膜的凝聚物到细胞表面，在那里它们与RNA结合蛋白（RBP）和其他RNA紧密协作，执行特定于位置的功能。在细胞内部，邻近标记策略能够选择性地进行化学标记和空间信息的共价编码，将分子间的邻近关系转化为可用于下游多组学分析的化学可处理的数据。针对RNA的一系列邻近化学方法已经开发出工具，可以高时空分辨率地解析RNA在天然细胞环境中的局部组织和相互作用。在这里，我们回顾了最近在邻近化学领域的发展和新兴主题，这些方法使得能够在亚细胞水平上对转录组中的RNA生物学进行空间分辨的研究。
引言
RNA的生命周期、调控和功能与其在细胞内的定位密切相关。转录、RNA成熟、核输出、表观转录组修饰、翻译和降解都发生在特定的亚细胞区室内（图1）。这些功能的区室化有助于塑造细胞内的组织结构，以支持极化的细胞行为、发育模式以及快速响应刺激的重塑[1]。作为主要例子，非编码RNA（ncRNA；例如rRNA、tRNA、snoRNA和lncRNA）作为转录组中功能多样化的组成部分，在免疫调节[2]、肽运输[3]以及信号传导和调控网络的构建中发挥作用[4]。
RNA和核糖核蛋白（RNP）复合物的错误定位往往是疾病的机制驱动因素和生物标志物，例如白血病中的NPM1错误定位[5]以及神经退行性疾病中SMN、TDP-43和FMRP的区室化改变[6]。理解这些联系为基于空间的诊断和干预提供了机会。不断扩大的RNA结合蛋白（RBP）库揭示了RNA作为蛋白质功能主动调控支架的作用，将RNA介导的调控视为一个新兴概念[7]，进一步强调了亚细胞RNA生物学的重要性。能够时空映射定位转录组、RBPome和RNA相关蛋白质组的工具可以生成丰富的数据集，用于假设生成和机制研究，以更好地理解RNA在整个细胞中的全局作用。
空间转录组学和蛋白质组学最近都被评为“年度方法”[8]，它们已经改变了组织和细胞尺度的生物学研究，然而目前的方法仍然难以获得全面的亚细胞分辨率图谱。基于成像的方法[9]提供了高空间分辨率，但目标有限、通量低，并且需要分割才能分配亚细胞区域。空间条形码测序可以实现无目标的全转录组映射，但分辨率较低（最高约0.5微米[10]），并且需要成像整合来进行亚细胞解释。物理分离（例如分级、激光显微切割、微流控）可以富集本来就可以分离的区室，但需要复杂的仪器、依赖成像，并且经常由于高丰度生物分子的共洗脱而受到污染。使用FAPS进行基因标记可以纯化特定的组装体（例如P小体[11]、突触小体[12]和内质网相关颗粒[13]），但生化提取可能会干扰其天然状态。最后，基于RIP/CLIP的方法可以实现全基因组的RNA-蛋白质相互作用映射[14]，但需要大量的输入材料，依赖抗体，并可能引入交联伪影。有关这些和其他RNA空间分析技术的全面概述，请参见参考文献[15]。
邻近标记（PL）利用化学方法在定义的半径内标记RNA，从而能够以亚微米分辨率和灵敏度无偏地、高通量地研究亚细胞内的蛋白质和RNA池（图2a–b）。通常，程序化的酶或催化剂被定位到细胞内的目标区室（或目标蛋白质或RNA），随后的原位“局部催化”以无偏见的方式标记附近的生物分子。通过富集标记的生物分子并进行高通量组学分析（例如质谱（MS）或下一代测序（NGS）可以定量分析标记的亚蛋白质组或亚转录组，从而“绘制”局部生物分子邻域的图谱。这种系统性的局部RNA-蛋白质/RNA-RNA网络和区室驻留转录组的映射可以用来解码细胞内RNA的空间调控（图2c）。近年来，靶向催化剂的目录已经扩展，包括基因编码和固定模式（图2d），以及分子多样性（图2e）。直接和间接（即交联）RNA标记策略都可以用来分析局部转录组（图2b）。
由于RNA相对于蛋白质对自由基和弱亲电试剂的反应性较低，一些PL技术依赖于标记附近的蛋白质，利用它们作为抓手来拉下并测序结合的转录本。这种方法利用了蛋白质上更多的反应性功能基团，从而克服了直接RNA标记固有的低标记效率。虽然间接RNA拉下技术在许多情况下可以提高产量，但它可能会对未结合蛋白质的RNA产生偏见，依赖于蛋白质标记（通常扩散性更强），并且依赖于交联效率，这可能会人为延长相互作用并导致RNA降解。间接拉下方法还表现出较低的灵敏度和较差的时间分辨率，例如：1）在非膜结合区室中的特异性较差（例如，无法选择性地富集内质网相关标记[16,17]；2）使用紫外线时交联效率低，导致富集的转录本数量较少[18]（相比之下，直接RNA生物素化方法可以富集超过1000个转录本[17]）；3）由于交联动力学缓慢（基于甲醛的方法长达15分钟[16]），时间分辨率较低。
直接RNA标记（通过生物素化或安装炔基或叠氮基把手，随后通过点击化学进行生物素化）在膜结合和非膜结合区室中都表现出更好的性能，具有更高的特异性、灵敏度和时间分辨率[17,19,20]。尽管如此，这些工具已经将PL扩展到了天然或非基因工程改造的细胞和组织中，包括活体和固定样本。本综述重点介绍了RNA映射的最新进展，特别是旨在解决诸如保护天然细胞信息、调整标记半径和提高特异性等持续挑战的PL工具（每种PL技术的详细描述列在表1中）。
部分片段
以反应性物种为导向的平台
传统的PL主要由以反应性中间体为导向的系统主导，在这些系统中，会产生一种短寿命的反应性物种并在原位标记附近的生物分子。有效的标记半径由中间体的寿命、扩散动力学和局部淬灭环境决定，从而产生概率性的空间足迹。在这里，我们描述了主要的PL系统，它们的特性由不同的标记化学方法决定。我们将PL系统分为两大类
依赖接触的技术
以接触为导向的平台通过催化剂（或探针）与其底物之间的直接分子相互作用实现共价标记，而不是通过可扩散的中间体。利用工程化的结合（碱基编辑）、交联（邻近连接）或模板反应（原位逆转录），这种依赖相互作用的化学方法能够实现更高的特异性，在某些情况下还能实现相互作用分辨的映射（图3b）。
未来展望
在这篇综述中，我们介绍了用于分析RNA亚细胞邻域及其动态组成的PL技术。通过原位化学捕获局部分子事件，PL能够在纳米到微米分辨率下编码天然亚细胞环境中的瞬态空间信息。我们强调了RNA、其结合蛋白及其在整个RNA生命周期中的定位之间的密切联系，这对RNA的调控和功能有直接影响。
作者贡献声明
R.S.T.C. 和 K.A.：概念化、撰写——初稿、审阅和编辑。
B.C.D.：概念化、撰写——初稿、审阅、编辑和资金获取。
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来帮助语言润色、结构组织和提高科学写作的清晰度。AI生成的输出经过了作者的严格审阅、编辑和验证。作者对发表文章的内容负全责。
资助
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）R35-GM119840（B.C.D）的资助。B.C.D是Biohub的研究员。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Shubhashree Pani对手稿的宝贵反馈，特别感谢Somayeh Ahmadiantehrani在准备手稿方面的帮助。我们还要感谢Jelena Momirov和Riley Sinnott的有益讨论。
