基于生物正交点击化学技术的细胞外囊泡富集方法，用于集成式分子与功能液体活检

《Accounts of Chemical Research》：Bioorthogonal Click Chemistry-Enabled Enrichment of Extracellular Vesicles for Integrated Molecular and Functional Liquid Biopsy§

　　

概述

细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞释放的脂质双层包裹的纳米颗粒，其中含有受保护的脂质、核酸、蛋白质和活性酶，能够准确反映其来源细胞的生理和病理状态。肿瘤和神经元来源的EVs在外周血液中大量存在，即使在疾病早期阶段也是如此，因此成为液体活检的极具吸引力的研究对象。然而，基于EVs的诊断技术在临床应用中面临一个核心挑战：无法从大量的正常EVs中以足够的特异性、效率以及与下游分子和功能分析的兼容性来选择性富集与疾病相关的EVs。传统的物理分离方法会产生异质性的EV混合物，从而稀释了疾病特异性信号；而传统的免疫亲和捕获方法则由于EV膜上抗原密度稀疏且不均匀而常常出现非特异性结合和低回收率的问题。

为了解决这些限制，我们的实验室开发了一种化学生物学方法，利用了反式-环辛烯（TCO）和四嗪（Tz）之间的生物正交逆电子需求Diels–Alder反应。通过用TCO标记的抗体标记肿瘤或神经元来源的EVs，并将其共价固定在Tz功能化的基底上，我们开发了三种EV富集平台：EV Click Chips、EV Click Beads和EV Click MagBeads，这些平台能够快速、不可逆且高度特异性地捕获特定的EV亚群。这种基于点击化学的富集策略减少了非特异性结合，显著提高了捕获效率，并保持了EV的完整性，为后续的基因组学、蛋白质组学和功能分析提供了可靠的基础。基于这一化学生物学方法，我们建立了三种互补的EV检测方法。第一种平台是EV数字评分检测（EV Digital Scoring Assay），它将点击化学富集与RT-digital PCR结合，用于定量肿瘤特异性mRNAs或致癌突变。这种“先富集再计数”的方法在肝细胞癌（HCC）的早期检测、前列腺癌的分子分期以及胰腺癌和Ewing肉瘤的可操作基因改变检测中显示出强大的临床应用价值。其改进版本能够实现实时监测HCC的治疗反应，其效果优于血清AFP和放射学评估方法。第二种平台是EV表面蛋白检测（EV Surface Protein Assay），它利用抗体引导的点击富集后进行免疫PCR或RT-qPCR来定量肿瘤特异性EV亚群。该方法类似于组织免疫组化，但采用液体活检的形式进行，已在HCC、胰腺导管腺癌和上皮性卵巢癌的早期检测中显示出准确性，并支持前列腺癌和甲状腺癌的长期监测。第三种平台是EV蛋白酶活性检测（EV Protease Activity Assay），它通过测量富集EVs中的酶活性将EV分析扩展到功能生物学领域。在骨肉瘤研究中，基质金属蛋白酶活性谱有助于区分局部病变和转移性病变，并追踪治疗反应。在神经学研究中，通过量化神经元EVs中的β-分泌酶活性，实现了阿尔茨海默病的早期精准检测，并与认知功能相关联。

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