利用SWATH–DIA技术对唾液进行全面的代谢组学分析，揭示了运动对全身代谢的适应性变化

《ACS Omega》：Comprehensive Metabolomic Analysis of Saliva Using SWATH–DIA Reveals Systemic Metabolic Adaptations to Exercise

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

唾液是一种易于获取、无创的生物流体，可用于实时监测生理和代谢变化。然而，由于传统代谢组学工具在代谢物鉴定深度和重复性方面的限制，其捕捉物理刺激引起的生化反应的能力一直受到限制。在这项研究中，我们建立了一种基于顺序窗口采集所有理论碎片离子光谱（SWATH–DIA）的靶向代谢组学工作流程，用于全面分析和相对定量运动前后唾液中的代谢组。从27名休闲跑者那里收集了唾液样本，在他们完成标准5公里跑步前后立即进行采样，以研究参与者的急性代谢波动。Zeno SWATH–DIA方法能够在正负电喷雾离子化（ESI）模式下同时采集整个m/z范围（50–800 Da）内的前体离子和碎片离子光谱，从而检测并验证了包括脂质、氨基酸、有机酸、碳水化合物和短链肉碱在内的代谢物。与传统的数据依赖性采集（DDA）方法相比，Zeno SWATH–DIA提供了更广泛的代谢物覆盖范围、更好的重复性，并减少了前体选择偏差。多变量分析（PCA、OPLS-DA）显示运动前后样本之间存在明显差异，突出了涉及碳水化合物代谢（乳酸、丙酮酸）、脂肪酸氧化（酰基肉碱、甘油）、氨基酸周转（BCAA、精氨酸、鸟氨酸）和氮代谢（尿素、亚精胺）的代谢变化。总体而言，这些发现确立了Zeno SWATH–DIA唾液代谢组学作为一种强大的、高覆盖范围的分析方法，可用于无创评估运动引起的生理变化的急性代谢反应。该工作流程为未来将基于唾液的代谢组学与运动表现、疲劳和代谢健康监测相结合的研究提供了方法论基础。

**引言**
唾液是一种无创、易于获取且可重复的生物流体，反映了宿主来源和外源性代谢物。(1,2) 其代谢组谱型越来越多地被用于诊断和预后应用，包括识别与口腔疾病、糖尿病、心血管功能障碍和神经退行性疾病相关的生物标志物。(3?5) 尽管取得了这些进展，但唾液捕捉运动中动态生理反应的潜力仍尚未得到充分探索。先前使用核磁共振（NMR）光谱学对足球运动员的研究显示，唾液代谢物与疲劳、表现和恢复有关。(6) 随后使用液相色谱-质谱（LC–MS）和准靶向代谢组学方法对竞技运动员的研究报告了唾液代谢物（如乳酸、肌酐、酰基肉碱和氨基酸）与代谢应激的血浆生物标志物之间的相关性。(7,8) 全面的系统代谢组学研究经常报告有氧和高强度运动会导致乳酸、丙酮酸、三羧酸循环中间体、脂肪酸、酮体和酰基肉碱显著增加。(9,10) 最近的一项系统综述检查了27项人类代谢组学研究，确定了运动后24小时内显著变化的196种代谢物，强调了生理适应过程中的代谢重编程程度。(9) 尽管有这些系统发现，但使用非靶向、高覆盖范围的代谢组学工作流程捕捉生理相关代谢变化的潜力仍有待彻底评估。

**先前的唾液代谢组学研究**
通过结合多种分析平台，先前的唾液代谢组学研究实现了广泛的代谢物覆盖，但LC–MS/MS工作流程的覆盖范围仍仅限于少数几类代谢物。(4) 这突显了评估高覆盖范围、非靶向LC–MS/MS策略以进行全面唾液代谢组谱分析的必要性。顺序窗口采集所有理论碎片离子光谱（SWATH–DIA）是靶向代谢组学的一项重大进展，因为它能够实现无偏且可重复的数据采集。与优先破碎最丰富离子的数据依赖性方法不同，SWATH–DIA在色谱运行期间在预定义的m/z窗口内破碎所有可检测的前体离子，从而最小化前体选择偏差并提高样本间的分析重复性。(11) 与基于DDA的工作流程相比，这种数据独立策略不仅将代谢物覆盖范围提高了30–55%，还允许进行回顾性数据查询，从而增加了对代谢物注释和量化的信心。(11,12) 此外，经过验证的SWATH–DIA工作流程在包含超过1200种化合物的大型光谱库中表现出高特异性（>96%）和极低的假发现率（<4%），证明了其适用于全面的小分子分析。(12) 在这项研究中，我们应用基于SWATH–DIA的LC–MS工作流程对休闲跑者在5公里跑步前后收集的唾液样本进行了非靶向代谢组谱分析。我们的主要目标是：(i) 开发一种LC–MS方法，以实现多个类别唾液代谢物的广泛和可重复覆盖；(ii) 定量和统计识别与运动引起的生理适应相关的急性代谢变化；(iii) 评估唾液作为无创基质来评估生理适应的可行性。通过这种方法，我们证明了非靶向SWATH–DIA LC–MS/MS工作流程相比先前报道的唾液代谢组学方法具有更高的分析覆盖范围，并对唾液中的274种代谢物进行了MS/MS验证和量化（而先前报道的是73种）。通过这种方法，我们证明了SWATH–DIA能够详细表征与运动相关的代谢变化，这些变化可能反映了与全身能量代谢和恢复相关的生理变化，因此在这里被研究作为全身代谢反应的潜在替代指标，而不是既定的替代指标。

**材料与方法**
27名健康的业余跑者（年龄20–45岁，性别分布均衡）参加了一次计时5公里跑步活动，同时还有4名年龄和性别匹配的非跑者对照组提供了静息唾液样本。唾液样本是在上午7点IST时通过无刺激的被动流口水方式收集在无菌15毫升微量离心管中。跑步活动共有31名参与者，包括27名跑者和4名非跑者作为对照组。参与者跑步时间和相应配速的信息见表S3。跑步配速计算为完成跑步所需的总时间除以跑步距离（5公里），并以每公里分钟数（min·km–1）表示。在参与之前获得了伦理批准和知情同意。参与者在样本收集前至少1小时内避免进食、饮水（水除外）和口腔卫生操作。在收集基线样本之前，要求受试者用温水漱口以清除残留的食物颗粒或药物。样本在-80°C下储存，直到进行代谢物提取。

**代谢物提取方案**
对于代谢组学分析，45微升唾液样本用提取溶剂（450微升1:2:2水:甲醇:ACN混合物，含有1%甲酸和2微升QRESS代谢物混合物作为标记内标）中和。样本短暂涡旋后，在4°C下以16,000g离心20分钟。上清液转移到新的1.5毫升管中，干燥后储存在-80°C，直到进行代谢组数据采集。样本重新悬浮在90微升50%甲醇水中，然后转移到自动采样器小瓶中。

**SWATH-MS数据的非靶向代谢组学分析**
LC方法修改自Vorkas等人（2015年）的先前发表的研究。(13) UPLC分离使用Shimadzu UPLC System进行。使用Waters Corp, USA的Acquity UPLC BEH HILIC 2.1 × 100 mm, 1.8 μm柱。柱温设定为35°C。流动相A由乙腈（ACN）/水（95:5）组成，流动相B由ACN/水（50:50）组成。两种溶剂都含有10 mM的醋酸铵和0.1%的甲酸。洗脱梯度设置如下：99% A（0.0–2.0分钟；0.4 mL/分钟），99–45% A（2.0–8.0分钟；0.4 mL/分钟），45–1% A（8.0–9.0分钟；0.4 mL/分钟），1% A（9.0–9.1分钟；0.4–0.8 mL/分钟），1% A（9.1–10.0分钟；0.8 mL/分钟），1–99% A（10.0–10.1分钟；0.8 mL/分钟），99% A（10.1–11.0分钟；0.8 mL/分钟），99% A（11.0–14.1分钟；0.8–0.4 mL/分钟），99% A（14.1–15.0分钟；0.4 mL/分钟）。正离子化（ESI+）和负离子化（ESI?）极性模式下的注射体积均为2微升。自动采样器架温设定为5°C。

质谱分析使用Sciex 7600 Zeno-TOF仪器，配备电喷雾离子化（ESI）源和碰撞诱导解离（CID）。IDA-MS采集的参数如下：源温度550°C，帘气30，CAD气7，源气1:50 psi，源气2:60 psi，喷雾电压：正离子化为5500 V，负离子化为-4500 V，去簇电位（V）：MS1为±80，碰撞能量（V）：MS1为±10，MSMS为±35（范围±15）。IDA-MS方法的积累时间为0.25秒，MS/MS为0.04秒；SWATH-DIA方法的积累时间为MS1为0.1秒，MS/MS为0.02秒；SWATH采集时Zeno脉冲开启25毫秒。

对于SWATH-DIA方法，变量窗口计算使用SWATH Variable Window Calculator_V1.1（可在供应商网站上获得）。使用IDA-MS方法从混合样本生成的峰值强度和质量表来计算覆盖50至800 m/z范围内、重叠1 Da的40个变量窗口。从混合样本生成的“wiff”格式数据文件在SciexOS软件中使用NIST代谢物库进行库搜索。NIST库包含13571种独特的代谢物光谱数据库，用于MS/MS验证。MS/MS和仅MS识别的标志规则包括质量误差（ppm）< 10，同位素比差异<20，RT宽度<0.4秒，以及库匹配得分高于70。在SciexOS软件中使用代谢物的ID、名称、m/z和RT（分钟）进行质量检查和峰值积分检查。在以下“代谢物手动验证”部分提到了另一种手动代谢物验证方法。数据在≥70%的样本中出现的代谢物被考虑用于分析。

**代谢物手动验证**
使用SWATH-DIA MSMS光谱的峰值和强度表进行手动验证。在MetaboAnalyst中使用精确质量（前体质量容忍度：10 ppm）和MSMS光谱（碎片质量容忍度：20 ppm）进行峰值注释。所有用于注释的库包括HMDB、MS-Dial、MassBank、MoNA、GNPS和LipidBlast，并被指定为Metabolomics Standards Initiative（MSI）2级（假定的注释化合物）。使用的相似性方法是点积。

**统计分析**
使用“MetaboAnalyst”对代谢组数据进行了统计分析。对样本进行了非参数t检验，假设方差不等并应用了Benjamini–Hochberg校正。对于所有分析，p < 0.05被视为统计显著（表S4–S7）。对于多变量PCA和OPLS-DA分析，数据预处理（在MetaboAnalyst中）包括通过中位数进行标准化；数据使用对数转换（以10为底）进行转换；数据使用均值中心化进行缩放。路径分析方法使用超几何检验（富集分析），以人类参考代谢组为基础。路径影响基于富集分析程序，通过路径影响和调整后的p值来确定最相关的代谢途径。路径影响代表了中心性和路径富集结果的结合；较高的影响值表示路径的相对重要性；圆圈的大小表示路径的影响，颜色表示显著性（红色越深，p值越低）。分析方法使用超几何检验（富集分析）和人类参考代谢组。

**结果与讨论**
我们使用SWATH-DIA对唾液样本进行了非靶向代谢组学分析，以开发一种快速采样和全面的分析方法，用于观察运动期间的代谢变化。本研究收集了参与5公里跑步的受试者的唾液样本。我们的队列包括27名跑者（以及4名对照非跑者），采样在跑步开始前作为基线样本（BS），并在跑步完成后作为随访样本（FUP）收集。

从唾液代谢组分析中，我们发现使用SWATH-DIA方法（在ESI+和ESI?模式下）检测到的MS1和MSMS特征数量比IDA MS方法更多（图1和2C,D）。在ESI+模式下，MS1水平上，SWATH–DIA检测到1774个特征，而DDA检测到1256个特征，特征覆盖范围增加了约41%；在MS/MS水平上，SWATH–DIA检测到860个特征，而DDA检测到600个特征，增加了约43%。在ESI–模式下，MS1水平上，SWATH–DIA检测到814个特征，而DDA检测到656个特征（增加了约24%）；在MS/MS水平上，SWATH–DIA检测到526个特征，而DDA检测到423个特征（增加了约24%）。ESI+和ESI–模式下的样本批次变异在可接受范围内，即m/z和RT的%CV < 25（图S1和S2）。这使得能够从唾液MSMS数据中验证和报告更多的代谢物。通过对唾液样本进行代谢组学分析，我们检测并量化了274种经过验证的代谢物。之前的全面唾液代谢组学研究在多个分析平台（包括DFI/LC–MS/MS、NMR和GC–MS）上识别出了246种独特的或非重叠的代谢物或代谢物种类，而DFI/LC–MS/MS方法仅检测到了73种化合物或化合物种类。相比之下，我们基于SWATH–DIA的工作流程能够从唾液中检测并验证274种代谢物。通过这项分析，我们量化了之前报道的111种疾病相关唾液生物标志物中的61种（图1B）。与现有的代谢组学方法相比，我们的SWATH-DIA方法在不同类别化合物的全面分析中提供了更好的覆盖度。（图1）图1. SWATH和IDA代谢组学的分析。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片图2. 基线和随访样本组中唾液代谢物的统计分析。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片我们从唾液代谢组学数据中检测到了不同类别的代谢物。这些代谢物大致分为几类：脂质（n = 65，28.5%）；暴露组、饮食和药物代谢物（n = 52，22.8%）；氨基酸、肽和氨基酸衍生物（n = 40，17.5%）；碳水化合物（n = 27，11.8%）；有机酸（n = 22，9.56%）；类固醇及其衍生物（n = 10，4.4%）；核苷酸及其衍生物（n = 6，2.6%）；以及短链肉碱（n = 6，2.6%）（图1A）。从途径分析来看，这些代谢物属于不同的代谢途径，如碳水化合物代谢途径（如半乳糖、蔗糖和淀粉代谢）和氨基酸代谢途径（牛磺酸、支链氨基酸（BCAAs）如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，以及芳香族氨基酸如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸代谢）（图1E）。在这些唾液研究中，我们实现了广泛的覆盖范围和灵敏度，从而更深入地了解了运动的代谢动态。（3?8）使用SWATH-DIA的唾液代谢组学展示了广泛的代谢覆盖范围和途径水平的相关性，突显了其相比IDA采集在特征检测和生物学解释方面的改进。（A）唾液SWATH代谢组学中检测到的代谢物类别的饼图。（B）之前报道的唾液生物标志物数量的饼图。（C,D）条形图显示了在ESI+和ESI–模式下使用IDA和SWATH检测到的特征数量比较。（E）唾液样本中检测到的唾液代谢物的途径分析。圆圈的大小表示途径的影响，颜色代表显著性（红色越深，p值越低）。分析方法使用了超几何检验（富集分析）和人类（参考代谢组）。运动适应过程中的代谢变化运动引起的代谢反应已在血浆中得到了广泛研究。血浆的代谢谱分析表明，脂质代谢、TCA循环、糖酵解、氨基酸代谢、肉碱代谢和嘌呤代谢等途径受到了影响。（15,16）为了分析这些变化，我们对基线和随访代谢物进行了成对分析，揭示了急性运动引起的代谢变化（支持信息）。在成对分析中显著不同的代谢物包括糖酵解和糖异生、丙酮酸、氨基酸代谢、淀粉和蔗糖、半乳糖代谢以及丁酸代谢途径（图3A，表S2）。与身体适应能量需求相关的代谢物，如乳酸、酮体（BHB）、肌酐、有机酸（乙酸和丙酸）、短链肉碱如乙酰肉碱和谷氨酰肉碱，以及氮废物如尿酸和尿素的水平增加（图2C）。（17,18）随着短链和中链酰基肉碱水平的增加，我们还观察到三甲赖氨酸水平的显著增加，进一步表明肉碱生物合成上调，这是将脂肪酸转运到线粒体的关键途径（表S1）。总体而言，这些观察结果表明唾液代谢物的变化与已建立的运动生理变化一致，而不是表明底物利用的直接因果变化。（16,19,20）图3. 基线和随访样本组中唾液代谢物的比较。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片通过多变量分析显示了基线和随访唾液样本之间的分离和类别水平的代谢变化，表明干预后唾液代谢组发生了全局变化。（A）基线和随访样本中代谢物的PCA得分图。（B）ESI+和ESI–模式下代谢组数据的OPLS-DA。样本预处理包括通过中位数归一化、对数转换（以10为底）和均值中心化缩放以进行多变量分析。（C）（A）ESI+和（B）ESI–模式下唾液代谢物的热图分析。数据在分析前进行了log10转换和自动缩放。应用了欧几里得距离的层次聚类，样本按收集时间点分组：基线（紫色）和随访（绿色）。列代表单个样本，行代表代谢物。颜色刻度表示相对代谢物丰度（z分数），红色表示相对于样本平均值的较高丰度，蓝色表示较低丰度。代谢物按生化类别分组（例如，肉碱、胆汁酸、糖类和有机酸），如右侧所示。基线与随访样本的多变量分析从基线和随访样本中量化的唾液代谢物使用无监督的主成分分析（PCA）（图2A）和有监督的正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）（图2B）在MetaboAnalyst 6.0中进行分析。PCA被用作探索性工具，以可视化数据集中的整体方差。第一个主成分分别解释了正离子化和负离子化模式下31.3%和34.7%的方差，并表明基线和随访样本之间存在分离趋势。PERMANOVA显示组间存在显著的多变量差异（ESI+（F = 4.72，R2 = 0.073，p = 0.016）；ESI–（F = 7.01，R2 = 0.115，p = 0.001），表明组状态解释了总体方差的一部分。置换检验表明OPLS-DA模型在两种离子化模式下都捕捉到了非随机结构。在ESI–模式下，模型的表现始终优于所有置换模型（经验p < 0.01，对于R2Y和Q2），尽管稳健性相对较低。综合来看，这些发现表明存在结构化的组间差异，同时与研究的探索性范围一致。观察到的多变量模式表明运动可能与多个代谢物类别的协调变化有关，包括肉碱、有机酸、氨基酸、糖类和氮废物代谢物，其中一些在随访样本中显示出较高的相对丰度（图2C）。像PCA和OPLS-DA这样的多变量方法有助于可视化在单个代谢物水平上可能不明显的复杂代谢模式，特别是在高维数据集中。在本研究中，这些分析被用来支持识别对运动有反应的候选代谢途径，并指导后续的单变量和特征选择分析。重要的是，我们不将这些结果解释为确定的代谢区分或广泛的普遍性证据。相反，它们提供了一个初步框架，用于理解需要在大规模独立队列中验证的运动相关唾液代谢组学趋势。使用这种多变量分析方法，我们可以可视化运动中的复杂代谢变化。（21）这将导致在不同研究中的普遍解释，因为从单个代谢物水平的解释可能受到各种因素的影响，特别是在考虑唾液采样时。它还有助于建模生理变化，以提高唾液作为监测健康和运动表现的生物流体的可靠性。与系统性运动代谢组学的比较我们的发现与之前在血浆和尿液代谢组学研究中报道的系统性代谢变化非常一致，这些研究调查了运动引起的生理适应。几项基于血浆的分析表明，在运动期间乳酸、β-羟基丁酸（BHB）、酰基肉碱、酮体和支链氨基酸（BCAAs）的浓度增加（图3B）。（9,22）运动初期的能量需求主要由碳水化合物代谢支持，这与唾液中观察到的乳酸和丙酮酸浓度的显著增加一致。随着运动强度和持续时间的增加，脂质代谢逐渐有助于满足增加的能量需求。（23,24）我们研究中观察到的酰基肉碱的积累表明向增强脂肪酸氧化的转变，反映了线粒体底物转换，这是耐力适应的一个众所周知的标志（表S1）。（17,18,20,25）同时，我们检测到甘油水平的增加，这是脂肪组织脂解的已知标志物，进一步支持运动后期脂质分解的作用。（20）基线和随访样本之间显著改变的代谢途径和特定代谢类别表明唾液捕获了生物学上相关的代谢适应。（A）基线和随访样本中显著不同的代谢物的途径分析。圆圈的大小表示途径的影响，颜色代表显著性（红色越深，p值越低）。分析方法使用了超几何检验（富集分析）和人类（参考代谢组）。（B）随访样本中显著增加的代谢物的箱形图。这些代谢物被分为不同的类别，如有机酸、肌酸、氮和肉碱代谢。我们还观察到BCAAs如缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的浓度增加。这些氨基酸与酰基肉碱一起被提出作为代谢健康和线粒体效率的生物标志物。（26）在长时间或高强度运动期间，骨骼肌由于氨基酸分解的增加而积累氨。实验证据表明，精氨酸和鸟氨酸的补充可以通过尿素循环增强氨的清除来延缓疲劳。（27）相应地，我们的数据显示运动后唾液样本中精氨酸、鸟氨酸和尿素的浓度增加，可能反映了运动后期氮解毒途径的激活。这一观察支持了精氨酸–鸟氨酸–尿素轴有助于缓解运动引起的疲劳的假设，并可能作为代谢恢复力的机制标志。此外，我们观察到精氨酸的下游代谢物亚精胺水平的增加，这与运动和细胞应激反应有关。（28）从机制上讲，氨基酸代谢和神经递质生物合成之间的相互作用也值得注意。苯丙氨酸和酪氨酸水平的增加可能增强儿茶酚胺的合成，影响运动期间的心血管调节和能量动员。（29）总体而言，这些发现强调了唾液代谢组学在捕捉综合神经-代谢和生理反应方面的潜力，突显了其作为非侵入性工具监测系统适应和疲劳动态的价值。未来的研究应旨在将唾液代谢组学与互补的生理和分子标志物相结合，以更全面地了解运动适应。将代谢组学分析与激素测定（包括皮质醇、睾酮和其他与压力和恢复相关的激素）相结合，有助于阐明代谢、内分泌和炎症反应之间的相互作用。（29）同时监测炎症和氧化应激标志物将进一步增强代谢组数据的解释能力，提供关于运动员准备状态、恢复状态和压力恢复力的多维见解。此外，将基于机器学习的多变量模型应用于整合的代谢组和性能数据集，对于识别疲劳、适应和过度训练的预测性生物标志物具有很大潜力。这样的模型可以辨别出通过单变量分析可能被忽略的微妙多变量模式，从而提高生理解释的稳健性。结合时间分辨或纵向采样设计还可以对运动、恢复和适应阶段的代谢波动进行建模，提供个体代谢灵活性的动态视角。总体而言，目前的发现为使用SWATH-DIA进行基于唾液的代谢组学监测建立了方法论和分析基础，突显了其在非侵入性、高通量评估急性运动引起的代谢变化方面的潜力。未来的研究将这种方法与整合组学和计算建模框架相结合，可以推进运动生理学的精确监测和个性化健康评估。结论本研究展示了基于SWATH–DIA的无目标代谢组学的实用性，实现了对运动期间唾液代谢组的全面和可重复的覆盖。该方法能够检测到多种代谢物类别，并揭示了与急性运动相关的碳水化合物、肉碱、脂质和氨基酸代谢的变化。这些模式与文献中先前报道的与运动相关的代谢变化在质量上是一致的。虽然本研究对比了血浆和唾液代谢物的系统测量数据，但基于文献的定性分析表明，唾液可能能够捕捉到运动诱导的代谢适应过程中具有生理学意义的方面，这支持将其作为监测动态代谢反应的潜在非侵入性指标进行研究。通过在更大规模样本群体中进一步验证，并结合不同研究中关于运动表现的数据，唾液代谢组学有望成为运动科学、康复医学和一般健康监测中的标准工具，有助于制定个性化的运动方案并早期发现代谢失衡。这些发现共同构建了一个强大的分析框架，用于高通量评估运动引起的代谢变化，并为未来将唾液代谢组学与运动表现、恢复过程及个性化健康监测相结合的综合研究奠定了基础。