《Metabolomics》：Measurement of immune cell-derived volatile organic compounds from ex vivo and in vitro cultures: a scoping review
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背景：挥发性有机化合物(VOCs)来源于细胞代谢活动和疾病相关生化过程，并正逐渐成为非侵入性生物标志物。尽管免疫细胞在活化和分化过程中经历了显著的代谢和功能重编程，但它们对细胞挥发性代谢组的贡献仍未被充分表征。
综述目的：本范围综述旨在系统地梳理报告哺乳动物免
背景：挥发性有机化合物(VOCs)来源于细胞代谢活动和疾病相关生化过程，并正逐渐成为非侵入性生物标志物。尽管免疫细胞在活化和分化过程中经历了显著的代谢和功能重编程，但它们对细胞挥发性代谢组的贡献仍未被充分表征。
综述目的：本范围综述旨在系统地梳理报告哺乳动物免疫细胞培养物释放的非靶向VOCs的实验性研究，特别关注挥发性组学(VOCs)工作流程和代谢物鉴定的置信度。
综述关键科学概念：通过系统性文献检索，识别了分析原代和永生化免疫细胞顶空VOCs的实验性研究。数据提取内容包括细胞模型、刺激条件、顶空采样策略、分析平台和数据处理工作流程。分析质量和化合物归属的置信度使用化学分析工作组-代谢组学标准倡议(CAWG-MSI)标准进行评估。有十一项研究符合纳入标准，采用了多种不同的采样和分析方法，包括固相微萃取(SPME)、基于吸附剂的热脱吸以及结合高分辨率质谱(HRMS)的二次电喷雾电离(SESI)等技术。综合各项研究，所报告的VOCs谱能够区分免疫细胞类型、活化状态和外部刺激，这支持了免疫源性挥发性组学特征的生物学合理性。然而，显著的方法学异质性显而易见。仅有一项研究达到了CAWG-MSI级别1的鉴定标准，大多数研究缺乏关键元数据、内标或验证程序。总的来说，免疫细胞似乎释放出与免疫代谢状态相关的独特VOCs特征，但当前的研究实践限制了可重复性、跨研究可比性以及可靠的生物学解释。本综述确定了表征免疫源性VOCs所需的代谢组学特异性方法学优先事项。
论文主体部分内容总结
1 引言
挥发性有机化合物(VOCs)是低分子量、在室温（293.15 K）下易挥发的碳基化学物质，可在呼出气及其他生物基质中检测到。这些化合物日益被认为是生理和病理过程（如感染、炎症和恶性肿瘤）的非侵入性生物标志物。VOCs来源广泛，包括宿主细胞、微生物组、饮食和环境。挥发性组学是代谢组学的一个分支，专注于分析VOCs。来自生物样本（无论是细胞、组织还是整个生物体）的所有VOCs总集合称为挥发物组。
尽管已有大量研究关注肿瘤细胞或微生物组来源的VOCs，但有越来越多的证据表明免疫细胞本身对VOCs谱有重要贡献。免疫细胞构成所有组织（包括肿瘤微环境）不可或缺的一部分，理解其VOCs贡献是关键的知识缺口。然而，研究免疫挥发性组学在很大程度上被忽视，因为免疫细胞具有异质性，可被微弱刺激激活，且其代谢状态变化迅速，这使得VOCs分析的一致性变得复杂。免疫细胞是活性氧(ROS)的有效来源，当其被激活时，会释放大量ROS作为炎症反应的一部分。这种氧化应激反应可诱发脂质过氧化，该过程已被证实是VOCs的来源，许多VOCs产生于膜磷脂的氧化降解。多不饱和脂肪酸(PUFAs)由于存在多个双键，极易被氧化。在活性氧(ROS)存在下，脂质自由基形成并引发链式反应，最终导致脂质氢过氧化物积累并分解为挥发性醛类、烷烃、羧酸及其他小分子。
由此可见，免疫细胞可能是VOCs在生物学上合理的来源或贡献者，特定的VOCs谱可能与特定的免疫活动相关。研究免疫源性VOCs在诊断或预后生物标志物发现方面具有潜力，尤其是在免疫活动变化是核心的疾病中，例如早期癌症、免疫调节药物（如自身免疫性疾病或器官移植中的免疫抑制，或癌症免疫疗法）的疗效监测。然而，迄今为止，还没有对研究免疫细胞释放VOCs的文献进行集中的综述。为了从其他生物来源的信号中分离出免疫特异性信号，并明确免疫代谢在调节整体组织挥发物组中的作用，对免疫源性VOCs谱进行全面描绘至关重要。本范围综述旨在系统地梳理用于非靶向表征免疫源性VOCs的实验方法，总结所研究的细胞类型、技术及关键发现，以指导未来的生物标志物发现。
2 方法
本综述遵循范围综述的系统评价和荟萃分析首选报告项目扩展版(PRISMA-ScR)原则。研究方案采用系统综述和荟萃分析方案首选报告项目(PRISMA-P)拟定，并于2025年5月8日在开放科学框架(OSF)前瞻性注册。综述基于PICO框架提出问题：哪些实验室和分析方法已被用于识别细胞培养物（免疫细胞）的免疫源性VOCs，以及报告了哪些VOCs，无论是否进行了免疫细胞类型、活化状态或条件之间的比较。文献检索截止至2025年11月27日，无语言或发表日期限制。制定了详细的检索策略，应用于MEDLINE (PubMed)、EMBASE、Web of Science和Scopus数据库。使用EndNote和Covidence软件管理文献、去重。
研究筛选由三位独立审稿人分两阶段进行：第一阶段筛选标题和摘要；第二阶段进行全文审查。任何分歧通过讨论达成共识或咨询第四位审稿人解决。此外，还进行了前向和后向引文追踪（滚雪球法）以补充检索。
数据提取使用预制的模板，提取信息包括：免疫细胞类型、数量、培养条件、VOCs顶空采样方法、分析平台（如气相色谱-质谱联用(GC-MS)）、已识别的VOCs、跨细胞类型/活化状态的比较、以及研究中报告的挑战或局限性。
对提取的数据采用叙述性综合进行分析，不进行统计荟萃分析。综述详细描述了每项研究的细胞类型/数量、培养条件、比较组、顶空采样方法、分析平台（如GC-MS、SESI）、质量控制措施和已识别的VOCs。比较了研究方法学特征，如细胞来源（原代 vs. 永生化细胞系）、活化方案、VOCs捕获技术、分析灵敏度和对照/重复情况。
研究质量评估采用化学分析工作组-代谢组学标准倡议(CAWG-MSI)标准，以评估化合物鉴定的置信度。等级范围从级别1（最可信，至少有两种正交分析数据）到级别2（一种数据类型，与商业谱库有光谱相似性）和级别3（最不明确，一种数据类型与光谱或化学性质相关）。
3 结果
3.1 研究筛选与纳入研究概述
共有11项研究被纳入本综述。搜索和筛选过程的流程图（未示出）。大多数纳入研究使用了永生化细胞系，少数使用了原代小鼠或人细胞，或痰液样本。研究目标各异，但均报告了免疫细胞挥发性组学。研究重点包括未刺激免疫细胞的VOCs谱，或对不同刺激（如病毒、细菌感染、通用化学激活剂或转染不同HLA I类等位基因）的反应。模拟细菌感染使用了脂多糖(LPS)或酵母聚糖。各研究使用的细胞数量差异较大，从低至400个细胞到高达4×107个细胞不等。细胞在标准条件下培养，有或没有添加抗生素或胎牛血清(FBS)/人血清白蛋白(HSA)。
3.2 顶空采样方法
使用了多种不同的顶空VOCs采样方法。固相微萃取(SPME)是常用方法，有的使用顶空瓶，有的未使用。其他方法包括：将顶空气体直接注入二次电喷雾电离(SESI)采样线、收集到不锈钢罐中进行低温预浓缩、或收集到吸附管或顶空搅拌吸附(HSSE)搅拌棒上再进行热脱附。顶空采样的时间点在不同研究中差异很大，从细胞分离后立即采样、几分钟的短期培养，到8天内多个时间点采样。
3.3 分析技术与数据处理
气相色谱-质谱联用(GC-MS)是各研究中使用的主要分析技术，配置了不同的色谱柱、GC炉程序和质谱分析器，如离子阱质谱(MS)、轨道阱质谱(Orbitrap MS)和飞行时间质谱(TOF MS)。数据处理因研究而异，但通常包括基线校正、峰检测、保留时间对齐和谱图匹配以识别VOCs。化合物鉴定质量参差不齐，通常通过谱库匹配（如美国国家标准与技术研究院(NIST)和Wiley谱库）实现，可接受的匹配质量阈值（通常≥80%）不同，可能影响VOCs鉴定的准确性和置信度。
3.4 质量评估与控制措施
大多数研究纳入了仅培养基样本、空培养瓶或室内空气作为对照。在通过不同方式激活细胞的研究中，将样本作为自身对照（激活前后）。多数研究报告使用了生物学重复以提高结果可靠性。几项研究报告了实验过程中的细胞活力，以确保VOCs变化可归因于细胞活动而非细胞应激或死亡。更全面的评估使用了CAWG-MSI标准。在纳入的研究中，仅有两项报告了超过50%的CAWG-MSI标准，仅有一项通过使用相同的热脱附-气相色谱-质谱联用(TD-GC-MS)方法将内标注入样本，并与真实标准品的保留时间、指数和质谱进行比较，达到了级别1鉴定。其余研究中，一项由于缺乏内标、质量控制措施或仪器校准的报告，且化合物鉴定细节有限，仅达到级别3。所有其他研究通过使用商用谱库进行化合物匹配达到级别2。所有纳入研究均提供了化合物的相对定量，其中仅三项使用内标或将结果归一化以考虑仪器变异进行了分析。仅有三项研究通过内标或标准化对仪器变异进行了分析。
3.5 报告的顶空VOCs与讨论
研究报告了免疫细胞顶空存在多种不同的VOCs，其组成因细胞类型、刺激和分析方法而异。几项研究报告仅培养基样本的VOCs可忽略不计，支持VOCs来自免疫细胞本身而非外源。在未刺激条件下，免疫细胞释放出一系列醇、酯、酮和醛，这与脂质和氨基酸代谢一致。基线化合物的结构多样性支持了初级和次级代谢过程的贡献。例如，Aksenov等人（2012年）对B淋巴细胞母细胞进行基因修饰以表达特定的HLA I类等位基因，结果产生了与脂质过氧化相关的独特VOCs，表明差异性的主要组织相容性复合体(MHC)表达可能影响与细胞氧化还原状态相关的下游代谢途径。
脂多糖(LPS)、酵母聚糖、佛波酯(PMA)或细菌上清液等刺激在不同免疫细胞模型中诱导了VOCs变化。例如，Arnold等人（2023年）证明，用大肠杆菌(E. coli)来源的上清液或LPS刺激树突状细胞会导致含硫化合物、芳香胺和类脂分子的释放，这与免疫激活的代谢转变一致。2-(甲硫基)苯并噻唑的增加表明其作为抗菌反应一部分的从头合成。此外，13C-葡萄糖示踪实验将某些VOCs与糖酵解和支链氨基酸途径联系起来，支持VOCs释放反映了免疫细胞代谢途径变化的解释。同样，感染不同流感病毒株会导致与脂质过氧化、氧化应激以及病毒复制过程中改变的蛋白质或辅因子使用相关的化合物随时间增加。
在使用原代免疫细胞（包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和PBMCs）的研究中，VOCs模式不仅具有刺激依赖性，而且在免疫细胞亚型之间存在差异。Schleich等人（2016年）发现，PMA激活的嗜酸性粒细胞释放更高水平的已知与脂质过氧化相关的醛类（如己醛和庚醛），而中性粒细胞产生更多已知与氧化应激相关的戊烷。在同一研究中，T细胞的特征是醇和酮（如2-丙醇和丙酮）产量增加，显示出谱系特异性的挥发性组学特征。Forleo等人（2018年）报告，LPS刺激导致THP-1单核细胞释放更大量的壬醛和2-丁酮，而PBMCs则以升高的异戊二烯（胆固醇生物合成的副产物）为特征。这种细胞类型特异性对顶空VOCs组成的贡献支持了VOCs作为非侵入性免疫分型工具的潜力。
尽管这些研究报告了上述发现，但仍存在一些方法学局限性，降低了所识别VOCs的可比性和可解释性。全面的代谢组学鉴定质量评估显示，所有研究都缺乏绝对定量，这使得跨实验的可比性面临挑战。同样，元数据报告不一致，以及报告培养条件、细胞类型、采样时间和仪器设置的变异性，使得研究的可重复性和跨研究比较更加困难。缺乏标准化的分析方案限制了关于免疫细胞VOCs的研究结论的普适性。值得注意的是，探索免疫细胞挥发物的出版物数量较少，与关于多种疾病呼出气VOCs的广泛文献形成对比，而在后者中免疫贡献可能很重要。这突显了在将细胞代谢与呼出气VOCs谱联系起来的机制、通路水平工作方面存在关键缺口。
3.5.1 未来方向与建议
为了提高免疫细胞挥发性组学的质量和可转化性，本综述提出了与代谢组学质量保证和质量控制联盟(mQACC)原则一致的实用建议。包括：1) 元数据报告应包含顶空采样时的细胞计数、细胞活力、培养基组成、顶空体积、采样时间和温度、氧合条件、抗生素/血清使用情况，以及分析平台详细信息。2) 应详细描述质量控制(QC)采样策略，包括空白、仅培养基/无细胞对照、加标内标。建议至少进行3次生物学重复，并分析分析标准混合物以监测仪器漂移。3) 应进行每日系统适用性测试(SST)混合物分析，以跟踪保留稳定性、质量准确度和灵敏度，并报告SST指标。4) 如果做出定量评估声明，则研究应包括通过分析标准品和校准曲线（包括检测限）进行VOCs身份验证，并报告是绝对定量还是相对定量。5) 数据处理报告应包括基线校正、峰提取阈值、去卷积设置和谱库匹配阈值等参数，以及如何验证谱库匹配的策略描述。建议尽可能提供原始数据和脚本。
除了分析技术的标准化，还有增强免疫挥发性组学转化的新兴机遇。机器学习方法正越来越多地应用于高维VOCs数据集，以改进特征选择和分类，以及通过系统生物学方法进行代谢通路注释，但需要标准化工作流程和验证以避免过拟合。同位素标记应用于加强VOCs与特定代谢途径联系的解释。同时，便携式传感器技术为即时检测提供了潜力，但需要在传感器开发前验证候选VOCs。然而，由于基质稀释、微生物组或环境的贡献、人体内的区室化或循环中VOCs的代谢，从体外实验到体内转化仍然具有挑战性。体外发现将需要在实验模型中进行体内临床验证。
3.5.2 液相色谱-质谱联用(LC-MS)与多组学的互补作用
使用配对的非挥发性代谢组学（如液相色谱-质谱联用(LC-MS)）可以支持VOCs的生物学解释，以理解其机制来源。LC-MS可以定量VOCs上游或下游的代谢物、脂质过氧化中间体或非挥发性碳基代谢物。整合包括顶空VOCs分析与配对LC-MS及其他组学的工作流程，可以通过系统生物学通路图谱方法揭示候选VOCs的生物学起源。鼓励进行能够解决这一问题的多组学先导研究，理想情况下使用匹配样本或时间匹配的平行培养。
4 结论
本范围综述强调了根据特定研究假设和目标定制实验设置的重要性。免疫细胞的顶空VOCs分析已被证明是研究免疫细胞活动和代谢的可行方法。呼出气中VOCs的检测作为监测健康和疾病的非侵入性方法显示出前景。为了将免疫细胞活动与呼出气VOCs联系起来，必须将体外免疫细胞挥发性组学与对其在呼出气中释放的代谢和生化途径的理解相结合。本综述所讨论的实验方案和分析平台的多样性突显了该研究领域的复杂性。在将其与呼出气中检测到的VOCs相关联以增强临床转化之前，需要进一步研究来将免疫细胞源性VOCs与免疫细胞活性相关联，以理解其生物学起源。
