《Environmental Microbiology Reports》：A Comparison of the Gut Microbiome of Two Sympatric Macropods Along an Urbanisation Gradient in Tasmania
编辑推荐：
本研究调查了澳大利亚塔斯马尼亚州小城市霍巴特的红颈沙袋鼠（Notamacropus rufogriseus rufogriseus）和塔斯马尼亚丛尾袋狸（Thylogale billardierii）的肠道菌群。研究人员从大霍巴特地区不同人口密度的绿地上收集了
本研究调查了澳大利亚塔斯马尼亚州小城市霍巴特的红颈沙袋鼠（Notamacropus rufogriseus rufogriseus）和塔斯马尼亚丛尾袋狸（Thylogale billardierii）的肠道菌群。研究人员从大霍巴特地区不同人口密度的绿地上收集了粪便样本。从这些样本中提取DNA，并对细菌16S核糖体RNA（rRNA）基因进行靶向测序，以了解细菌群落。研究结果显示，尽管两个物种之间有许多共享的生态特征，但它们的肠道微生物组对城市生活表现出不同的反应。红颈沙袋鼠的α和β多样性在城市化梯度上存在显著差异，而塔斯马尼亚丛尾袋狸则没有。两个物种的相对组成在城市梯度上都存在差异。一些与营养处理相关的细菌类群表现出最明显的变化。本研究的结论是，城市生活会影响这两种有袋类食草动物的肠道微生物组。需要更多的研究来确定这是否对这些物种的健康有影响。
研究背景、问题与目的
随着高通量测序技术的发展，对生物特定生态位微生物群落的研究，尤其是对在宿主稳态中发挥重要作用、参与调节多种内部系统和功能的肠道菌群的研究，已成为重要领域。城市地区作为一种快速扩张的栖息地类型，正成为许多野生物种的重要新家园。然而，城市将野生动物暴露于其进化史上前所未有的挑战，如资源改变、新的生物和非生物栖息地条件、高水平的水和空气污染以及高强度的人为干扰，这些都可能导致其肠道微生物组发生重大变化。因此，了解野生动物适应和应对城市生活的各种方式，包括其肠道菌群的变化，对于有效保护城市物种至关重要。
然而，城市化对微生物多样性的影响是一个复杂且仍在进行的研究领域。城市是复杂的环境镶嵌体，变量众多，且相关研究结果不一，缺乏可比性。在澳大利亚，袋鼠（Macropods）在城市和城镇中很常见，但在城市研究中常被忽视。关于袋鼠物种微生物组的研究很少，且尚无研究探讨其微生物组如何受城市生活影响。此外，人口少于约30万的小城市在城市化生物多样性研究中代表性不足。霍巴特作为一个较小的城市，为研究这种代表性不足但普遍存在的城市化形式对野生动物肠道菌群的影响提供了机会。
本研究旨在填补上述知识空白。具体研究目标是了解城市生活对澳大利亚塔斯马尼亚州霍巴特小城市的塔斯马尼亚丛尾袋狸（Thylogale billardierii）和红颈沙袋鼠（Notamacropus rufogriseus rufogriseus）肠道微生物组的组成和多样性的影响。这两个物种同属Macropodidae科，均为前肠发酵动物，常占据相同栖息地且饮食有重叠，这使得研究人员能够在控制城市环境为不同物种提供的部分变异性的情况下，比较城市化对其肠道微生物组的影响。
关键研究方法
本研究的关键方法包括：
- 1.
样本采集与处理：研究人员依据澳大利亚统计局定义的统计区域二级（SA2）人类人口密度数据，在霍巴特地区的8个绿地（分为高、中、低三个城市化等级）采集了红颈沙袋鼠（n=40）和塔斯马尼亚丛尾袋狸（n=24）的新鲜粪便样本。样本采集时使用灭菌工具以防止污染，并利用鉴别指南（PooFlip）区分物种。粪便样本保存在乙醇中并于-20°C冷冻直至DNA提取。
- 2.
微生物组分析：研究人员采用16S rRNA基因扩增子测序技术来表征微生物群落。具体步骤包括：从粪便样本中部提取DNA；使用针对细菌16S rRNA基因V3-V4区域的引物对（Bakt_341F/805R）进行两轮PCR扩增，并添加Illumina测序接头；扩增产物在MiSeq平台（Illumina）上进行双端测序。
- 3.
生物信息学与统计分析：对得到的序列进行生物信息学处理，包括通过UNOISE3流程去噪为零半径操作分类单元（zOTU），并使用Ribosomal Database Project分类器进行物种分类。在R语言环境中进行后续分析，包括：通过α多样性指数（如物种丰富度和香农指数）和ANOVA分析比较多样性；采用基于中心对数比（clr）转换的组成数据分析（CoDa）方法，利用Aitchison距离、PERMANOVA和主坐标分析（PCoA）评估β多样性；通过相对丰度图和ALDEx2差异丰度检验分析群落组成在门和属水平上的变化。
研究结果
3.1 α多样性
研究结果表明，红颈沙袋鼠的肠道微生物组物种丰富度在不同城市化水平之间存在显著差异（p=0.023），而塔斯马尼亚丛尾袋狸则无显著差异（p=0.73）。Tukey HSD检验显示，来自最城市化地区的红颈沙袋鼠的物种丰富度低于城市化最低的地区。两种物种的香农指数均无显著差异。
3.2 β多样性
以Aitchison距离衡量的β多样性，在红颈沙袋鼠的粪便样本中，城市化水平之间存在显著差异（PERMANOVA p=0.006），而在塔斯马尼亚丛尾袋狸样本中则不显著（p=0.09）。成对PERMANOVA分析显示，生活在最高和最低城市化水平的红颈沙袋鼠的肠道β多样性存在显著差异（p=0.012）。
3.3 微生物组组成
3.3.1 红颈沙袋鼠
厚壁菌门是红颈沙袋鼠肠道微生物组中相对丰度最高的门。放线菌门仅在城市化最低的地区显著富集。中度城市化地区的疣微菌门比例最高，而变形菌门比例最低。在属水平上，Ruminococcaceae UCG-005和 Akkermansia是最占优势的两个属。ALDEx2结果显示，Lachnospiraceae_unclassified的丰度在最低城市化地区（D3）低于最高城市化地区（D1）。
3.3.2 塔斯马尼亚丛尾袋狸
厚壁菌门同样是塔斯马尼亚丛尾袋狸肠道微生物组中最丰富的门。拟杆菌门是第二大丰富门，疣微菌门紧随其后。在最低城市化水平，放线菌门更为丰富。在属水平上，Ruminococcaceae UCG-005和 Akkermansia也是最主要的两个属。ALDEx2结果显示，Ruminococcaceae UCG-005、Lachnospiraceae_UCG.010和 Oscillospiraceae_unclassified的丰度随城市化水平升高而增加，而 Oscillospirales_ge在城市化最低地区的动物中更丰富。
讨论与结论
本研究是首次尝试根据人口密度定义的城市化水平了解袋鼠肠道菌群模式的研究之一，也是首批评估小城市不同城市化类别下野生动物肠道菌群差异的研究之一。结果显示，红颈沙袋鼠的肠道微生物组α和β多样性在城市梯度上存在显著差异，而丛尾袋狸的微生物组多样性则未显示显著差异。物种间的这种差异可能与它们在城市环境中的不同觅食习性有关。尽管丛尾袋狸的PERMANOVA结果不显著，但其边缘P值和PCoA趋势暗示，样本量增大时可能检测到显著差异。较低肠道β多样性可能对城市袋鼠种群健康和体况产生负面影响，但这需要进一步研究。
在组成上，两个物种的肠道菌群均以厚壁菌门为主，这与其它有袋类食草动物的研究一致。与营养处理相关的细菌类群（如Ruminococcaceae UCG-005、Lachnospiraceae相关属、Oscillospirales_ge）的丰度变化表明，城市生活可能影响了宿主的纤维摄入。放线菌门在最低城市化地区的丛尾袋狸中更丰富，而疣微菌门在中度城市化地区的沙袋鼠中略有增加，这可能与饮食中蛋白质、脂肪和糖分的可获得性变化有关。研究人员推测，城市化程度较高的地区可能为袋鼠提供了更多高能量的人类食物，从而改变了其肠道菌群组成。
本研究存在一定局限性，如缺乏阴性对照、样本量较小且不均匀、存在样本误分类的可能性等，这些因素都可能影响结果。
研究结论
本研究是首次对城市袋鼠（塔斯马尼亚丛尾袋狸和红颈沙袋鼠）肠道菌群进行的研究之一。有证据表明城市化对袋鼠微生物组存在影响，但不同物种间存在差异，且沿人口密度梯度存在一些非线性关系。理解城市和城市生活对城市野生动物居民健康的影响是一个日益重要的课题。动物微生物组与宿主的整体健康相关并对其有贡献，是连接城市化与生物多样性的关键知识缺口。由于城市环境是一个由多种不同环境组成的复杂镶嵌体，而微生物组是一个由许多物种组成的复杂系统，每个物种对外部压力的反应各不相同，因此需要大量的研究工作来解析可能决定城市化、微生物群和动物健康之间相互作用的各种因素。特别是，需要在不同城市化水平和不同城市规模上，对多个宿主分类群进行系统研究，以阐明这些复杂的相互作用。
