APOE4基因驱动了与性激素和饮食相关的AD（阿尔茨海默病）样病理变化、认知功能及线粒体功能的改变

《FASEB BioAdvances》：APOE4 Drives Sex- and Diet-Dependent Effects on AD-Like Pathology, Cognition, and Mitochondrial Function

　　摘要

载脂蛋白E4（APOE4）是阿尔茨海默病（AD）最强的遗传风险因素，但目前尚不清楚这种等位基因是如何促进疾病发展的。尽管饮食和性别等因素可能影响APOE4携带者的AD易感性，但这些因素之间的相互作用仍不甚明了。本研究旨在确定APOE4、性别和饮食是否相互作用，从而影响小鼠的AD相关结果。从4个月大到8个月大，雄性和雌性APOE3和APOE4靶向替代（TR）小鼠分别被喂食低脂饮食或高脂饮食。收集了血清神经退行性疾病的生物标志物、脑淀粉样蛋白β（Aβ）、APOE和tau蛋白的数据，以及学习与记忆能力、海马体线粒体功能和蛋白质组学数据。APOE4对血清GFAP和NfL没有影响，而高脂饮食则与较高的血清NfL和GFAP水平相关。全脑Aβ水平受到性别、饮食和基因型的显著影响，APOE4小鼠的Aβ水平较低。APOE4 TR小鼠在实验前就表现出学习能力受损。蛋白质组学分析显示，APOE4对线粒体通路具有饮食和性别依赖性的影响，包括在高脂饮食条件下的雄性小鼠中下调丙酮酸代谢，在雌性小鼠中下调氧化磷酸化。APOE4 TR雌性的基础呼吸速率低于APOE3 TR雌性。我们提供了新的证据，表明APOE4可能驱动早期由性别和饮食决定的、支持大脑线粒体能量代谢的通路减弱。

1 引言

阿尔茨海默病（AD）影响了约700万65岁以上的美国人，预计到2030年这一数字将几乎翻倍[1]。虽然已有几种药物获得FDA批准用于治疗AD，包括针对疾病潜在生物学机制的淀粉样蛋白β（Aβ）清除疗法，但目前仍没有明确的方法来预防AD的发展或进展。虽然剂量和时间等因素可能解释了现有治疗药物对疾病进程的有限影响，但也有可能是上游作用机制或独立于Aβ的致病机制降低了这些药物的效果。了解可能独立或与Aβ共同驱动疾病病理的替代机制，有助于识别和/或开发能够改变AD风险和预后的治疗方法。为了揭示AD的病因并实施有效的干预措施以减轻疾病风险和进展，我们需要确定已知的风险因素如何影响AD的易感性。载脂蛋白E4（APOE4）是人类APOE基因的三种变异体之一，也是AD最强的遗传风险因素[1, 2]。相反，APOE2可以降低AD风险，而APOE3则没有影响风险[1, 2]。在大脑中，APOE蛋白主要由星形胶质细胞合成，但在其他胶质细胞和神经元中也会产生，尤其是在受到压力条件下[3]。从功能上讲，APOE在神经元和胶质细胞之间的脂质运输中起着关键作用，这有助于维持神经元健康，同时APOE还能保护神经元免受氧化应激，并可能促进Aβ的清除[2, 4]。尽管尚不清楚APOE4是如何增加AD风险的，但与其他APOE异构体相比，APOE4既具有保护性功能丧失效应，也具有毒性功能获得效应[2, 5-8]。APOE4在脂质运输、抗氧化应激保护以及Aβ清除方面效果较差[5-8]，后者可能导致APOE4携带者出现更早且更严重的Aβ病理[9, 10]。值得注意的是，APOE4还与线粒体功能下降有关，这已被提出作为AD的病因因素之一[11, 12]。在没有明显Aβ病理的情况下，APOE4小鼠的海马体和皮质组织的线粒体呼吸速率低于APOE3小鼠[13]。使用神经元细胞模型的研究表明，APOE4的蛋白水解产物会定位于线粒体并直接损害呼吸功能[14-16]。由于APOE4的存在并不一定意味着AD诊断，因此考虑其他因素如何与这种等位基因相互作用以促进疾病发展是很重要的。饮食可能在调节APOE4介导的致病效应中发挥重要作用且是可以改变的。APOE4是人类的原始APOE等位基因，除了AD之外，还与小鼠模型中更容易发展出饮食诱导的动脉粥样硬化有关[17]，这在现代西方饮食环境中尤为重要。高胆固醇被认为是14个潜在可改变的AD风险因素之一，其他因素还包括肥胖和糖尿病[18]。尽管临床前模型的研究表明西方饮食和APOE4共同作用会加剧代谢和认知功能障碍[19-21]，但对于可能反映或影响这些效应的AD生物标志物和蛋白质的变化了解较少。此外，关于性别对APOE4和饮食介导的AD结果的影响也知之甚少。虽然有研究发现雄性APOE4小鼠在高脂饮食（HFD）下可能更容易出现全身性代谢功能障碍，但未研究大脑中的分子变化[22]。有证据表明，女性APOE4携带者的AD风险更高[23]，并且已知性别之间的脂质代谢存在显著差异[23]。因此，我们使用小鼠模型来确定APOE基因型、西方饮食和性别是否相互作用，从而影响AD相关结果。我们使用了APOE3（对照组）和APOE4靶向替代（TR）小鼠，分别喂食低脂饮食（LFD）或高脂饮食（HFD）并添加相应比例的蔗糖，持续4个月，并评估了血液和脑组织中的AD生物标志物以及使用Barnes迷宫协议评估的空间学习和记忆能力。我们还评估了脑组织中的蛋白质组和线粒体呼吸速率。我们的假设是APOE4、HFD和雌性性别将与AD病理、认知功能和代谢结果中最显著的变化相关。研究发现APOE4与海马体富集的冠状组织中的显著饮食和性别依赖性蛋白质组学效应相关，并影响了神经退行性疾病的标志物。在所有组中，线粒体通路都是受APOE4影响的顶级生物过程之一，这与女性中线粒体功能的改变一致，支持了线粒体在APOE4驱动的疾病中起核心作用的现有文献。

2 方法

2.1 动物

本研究使用了C57BL/6NTac背景下的雄性和雌性APOE3和APOE4 TR小鼠（n=61只小鼠，每种基因型/饮食/性别组合7-8只小鼠）。小鼠从Taconic公司购买，并在堪萨斯大学医学中心（KUMC）的动物设施中以每组3-4只的方式饲养。直到4个月大，小鼠被喂食标准饲料（14%卡路里脂肪，Teklad Global Rodent Diets，8604）。之后，小鼠被换成低脂饮食（LFD，D12110704，10%卡路里脂肪，Research Diets，新泽西州新不伦瑞克）或高脂饮食（HFD，D12451，45%卡路里脂肪，Research Diets），直到8个月大时被处死。在开始饮食之前，随机选择了饮食组，确保性别和体重分布均匀。LFD和HFD的蔗糖含量约为17%卡路里。在6个月大时（饮食后2个月），通过尾静脉采集血液，放入Eppendorf管中并离心以收集血清。使用苯巴比妥（0.5毫克苯巴比妥/体重）麻醉小鼠，随后进行组织采集。本研究使用的动物实验程序已获得KUMC机构动物护理和使用委员会的批准。

2.2 组织采集

心脏血液被收集到注射器中并放入Eppendorf管中。血液在4°C下离心10分钟（7000g），然后上层含有血清的部分转移到新管中并储存在-80°C以供血清分析。在处理血液的同时，取出大脑。称量大脑的左半球，并将其放入含有8毫升冰冷分离缓冲液A（320毫摩尔蔗糖、10毫摩尔Tris-Cl、1毫摩尔EDTA、2.5克/升BSA、pH 7.4）的50毫升锥形管中用于呼吸测定。使用脑矩阵解剖每只小鼠的右半球。为了获得包含海马体的切片，在海马体的大致前边界放置一把剃须刀（图S1）。从每个大脑中提取这个单个海马体冠状切片并储存在-80°C中进行蛋白质组学分析。其余整个大脑储存在-80°C以用于后续生化检测。

2.3 血清生物标志物

使用Neurology 2-Plex B Advantage Kit（103,520，Quanterix Simoa HD-X，比尔里卡，马萨诸塞州）根据制造商的说明测量血清中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经丝轻链（NfL）。

2.4 西部印迹分析

使用Western blot分析测定总tau蛋白和磷酸化tau蛋白的水平。右半球大脑样本使用冰冷均质化缓冲液（1% Triton X-100、50毫摩尔HEPES、12毫摩尔Na pyrophosphate、10毫摩尔NaF、10毫摩尔EDTA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂）在4°C下离心25分钟（15,000g）。使用BCA测定法（ThermoFisher）测定上清液中的蛋白质含量。等量的蛋白质被转移到4%-15% Criterion TGX凝胶（Bio-Rad）上。然后将凝胶转移到PVDF膜上（Bio-Rad），并在室温（RT）下用5%牛血清白蛋白（BSA）和1X磷酸盐缓冲液（PBST）封闭1小时。膜在4°C下用一抗（1:1000稀释）孵育过夜，并轻轻搅拌。之后用1X PBST洗涤三次，然后用二抗（1:2000稀释在5%无脂干牛奶中）在RT下孵育1小时。再用1X PBST洗涤三次，然后用SuperSignal West Dura ECL底物（ThermoFisher）在ChemiDoc XRS成像系统（Bio-Rad）上成像，并用Amido Black染色总蛋白质。本研究中使用的一抗包括Total Tau（Abcam，ab76128）、pTau181（Abcam，ab254409）和pTau396（Invitrogen，44-752G）。

2.5 酶联免疫吸附测定

使用市售的ELISA试剂盒测定淀粉样蛋白β（Aβ）和载脂蛋白E（APOE）的水平。简要来说，按照上述方法裂解右半球小鼠大脑。然后使用试剂盒提供的稀释缓冲液按推荐浓度稀释上清液。具体的ELISA试剂盒包括mouse Aβ 1–40（Invitrogen，KMB3481）、mouse Aβ 1–42（Invitrogen，KMB3441）和human APOE（Invitrogen，EHAPOE）。按照制造商的说明书完成检测，并将最终浓度标准化为通过BCA测定法（ThermoFisher）确定的蛋白质含量。

2.6 Barnes迷宫

Barnes迷宫由一个直径1.0米的圆桌上均匀分布的二十个5.0厘米的孔组成。其中一个孔被指定为目标孔，里面是一个黑色盒子。在迷宫周围放置了四个视觉提示。在初次适应期间，每种基因型/性别/饮食组合的3-4只小鼠被放置在一个目标盒子内，放置时间为2分钟。第二天，同样的小鼠被放置在Barnes迷宫桌子中间，上方有一个杯子。大约20秒后，杯子被抬起来释放小鼠。每只小鼠有180秒的时间找到并进入目标盒子。如果小鼠在180秒内未能进入目标盒子，观察者会引导小鼠到达目标。每天重复四次，连续五天。每次训练在之前的试验后5-10分钟内进行。每个五天的训练分别在3个月大、6个月大和8个月大时重复。每次训练使用一个新的Barnes迷宫设置，目标孔和视觉提示的位置不同。在6个月大（3个月大时回忆场地）和8个月大（8个月大时回忆场地）时，对同一组小鼠的Barnes迷宫记忆保留能力进行评估。

2.7 从海马体冠状切片中分离蛋白质

从一部分小鼠的右半球海马体冠状组织（每种基因型/性别/饮食组合4只）中提取组织，用研杵捣碎并放入液氮冷却的管中。立即加入冰冷均质化缓冲液（1% Triton X-100、50毫摩尔HEPES、12毫摩尔Na pyrophosphate、10毫摩尔NaF、10毫摩尔EDTA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂）。然后加入不锈钢珠子，并使用TissueLyser II（Qiagen，杰曼敦，马里兰州）以20赫兹的频率打碎样品2分钟。每组样品之间休息10分钟。然后离心（4°C，25分钟，15,000g），并将含有蛋白质的上清液转移到新管中。蛋白质含量是通过bicinchoninic酸测定法（Thermo Fisher，Waltham，MA）测量的，并且将50 μg的裂解蛋白分配到一个新的试管中，用于阿肯色医科大学（UAMS）的蛋白质组学研究。

2.8 蛋白质组学

从海马冠部切片中分离出的蛋白质在UAMS进行了质谱分析。所有样品都在同一批次中完成处理。蛋白质被还原、烷基化，并用氯仿/甲醇混合物提取。然后使用猪胰蛋白酶（Promega）将蛋白质消化成肽段。使用Ultimate 3000 RSLCnano系统（Thermo）和在线150 × 0.075毫米柱子，以及反相XSelect CSH C18 2.5微米树脂（Waters）来分离胰蛋白酶肽段。随后通过60分钟的梯度洗脱，从98:2的缓冲液A（0.1%甲酸，0.5%乙腈）到缓冲液B（0.1%甲酸，99.9%乙腈）进行肽段洗脱。洗脱出的肽段通过电喷雾（2.2 kV）离子化，并在Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo）上进行分析。在每次数据独立采集（DIA）之后，采集覆盖气相部分m/z范围的前体光谱（即496–602 m/z，分辨率为60,000，归一化AGC目标为100%，最大注入时间为50 ms）。质谱仪设置为先体扫描（385–1015 m/z，分辨率为60,000，归一化AGC目标为100%，最大注入时间为50 ms），然后是50×12 m/z的DIA光谱（12 m/z的前体分离窗口，分辨率为15,000，归一化AGC目标为100%，最大注入时间为33 ms）。

2.9 线粒体分离

收集后立即称量整个大脑的左半球，并将其放入装有8 mL分离缓冲液A（320 mM蔗糖，10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA，2.5 g/L BSA，pH 7.4）的圆锥管中。然后将脑组织转移到预先冷却的玻璃/Teflon容器中，以1000 rpm的速度搅拌4–6次进行匀浆。将匀浆后的脑组织转移回原来的圆锥管中，并进行离心（4°C，10分钟，1000 g）。含有线粒体的上清液转移到新试管中，再次离心（4°C，10分钟，10,000 g）。丢弃上清液，将含有线粒体的沉淀物重新悬浮在6 mL分离缓冲液B（320 mM蔗糖，10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4）中。重新悬浮的线粒体再次离心（4°C，10分钟，10,000 g），然后丢弃上清液。线粒体沉淀物重新悬浮在分离缓冲液B中。用于重新悬浮的缓冲液B的量根据1:8的比例（初始脑重量：缓冲液B体积）进行调整，即每毫克组织加入8 μL缓冲液B。

2.10 线粒体呼吸作用

分离出的脑线粒体用于在Oroboros Oxygraph-2k系统（奥地利因斯布鲁克）上评估线粒体氧流。在2 mM苹果酸、0.01 mM CoA、2.5 mM肉碱和5 mM丙酮酸的存在下测量基础呼吸作用。通过添加2.5 mM ADP来确定状态3呼吸作用。然后在前体底物和2 mM谷氨酸的存在下测量与复合体I相关的呼吸作用（状态3+谷氨酸）。通过添加10 mM琥珀酸（状态3S）来研究与复合体II相关的呼吸作用。最后，逐步添加FCCP（每次0.00015 mM），直到达到最大呼吸作用。计算每种线粒体呼吸状态的平均稳态氧流。

2.11 统计分析

2.11.1 阿尔茨海默病生物标志物/病理学和线粒体呼吸数据

使用GraphPad prism 10.1.2的Grubbs检验来识别并去除异常值。使用三因素方差分析（ANOVA）来评估APOE基因型、性别和饮食对阿尔茨海默病生物标志物和线粒体呼吸作用的交互效应。如果三因素ANOVA显著，则对所有APOE基因型、性别和饮食组合进行Fisher最小显著差异（LSD）多重比较。如果三因素ANOVA不显著，则解释两因素ANOVA的交互作用。如果有任何两因素ANOVA交互作用显著，则使用Fisher的LSD进行相应的多重比较。如果没有显著的两因素ANOVA交互作用，则解释APOE基因型、性别和饮食的主效应。显著性设定为α=0.05。ANOVA分析在SPSS 29.0中完成。

2.11.2 Barnes迷宫数据

使用重复测量分析来比较各组在每个训练期间到达目标的潜伏时间和行进距离。使用三因素ANOVA来确定APOE基因型、性别和饮食对潜伏时间和到达时间点距离的影响。为了考虑在规定的180秒内未能逃离迷宫的小鼠，使用log-rank Mantel-Cox检验比较了逃避百分比的Kaplan–Meier曲线[24]。如果曲线显著不同（p≤0.05），则使用成对log-rank比较来比较各组之间的逃避分布。显著性设定为α=0.05，并通过将0.05除以测试的比较数量来进行调整。分析在SPSS 29.0中完成。

2.11.3 蛋白质组学数据

使用Spectronaut（Biognosys版本18.3）将蛋白质组学数据与UniProt Mus musculus数据库进行交叉匹配。使用DirectDIA，设定识别前体的q值截止为1%，生成诱饵集为true，蛋白质推断工作流程设置为maxLFQ，推断算法设置为IDPicker number，数量级别设置为MS2，交叉运行标准化设置为false，蛋白质分组量化设置为中位数肽和前体数量。使用ProteiNorm [25]来评估蛋白质的MS2强度值，并使用方差稳定标准化（VSN）[26]对数据进行标准化。ProteoDA使用线性模型（limma）和经验贝叶斯（eBayes）平滑方法进行统计分析[27, 28]，以标准化标准误差[27, 28]。对于组间比较，p≤0.05的蛋白质被认为是统计学上不同的；没有应用假发现率。使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA，Qiagen）来确定所有检测到的蛋白质的通路富集情况，以及在APOE4与APOE3 TR小鼠之间显著差异的蛋白质的通路富集p值阈值设为p≤0.05。IPA还使用显著改变蛋白质的倍数变化数据来预测通路活性方向，活化z分数的截止值为±2。MitoCarta3.0用于识别我们数据集中的定位于线粒体的蛋白质[29]。通过将我们数据集中所有线粒体蛋白质的总强度除以所有蛋白质的总强度并乘以100来计算线粒体蛋白质的百分比富集。

3 结果

3.1 阿尔茨海默病生物标志物受载脂蛋白E4（APOE4）的影响，并且会因高脂饮食（HFD）和雄性性别而增加

在本研究中检查的小鼠也在之前发表的研究中进行了研究，该研究展示了饮食、性别和基因型对体重、肌肉和瘦体重以及身体成分的影响[30]。我们在6个月和8个月大时评估了血清NfL和GFAP的水平，这两个标志物分别代表神经退行性和星形胶质细胞的反应性。6个月和8个月大时的血清NfL值以及这些时间点之间的变化不受APOE基因型、性别和饮食的影响（图1A）。相比之下，6个月大时HFD组的血清GFAP显著高于LFD组（主要效应是饮食，p=0.047），而在8个月大时雄性小鼠的GFAP显著高于雌性小鼠（主要效应是性别，p=0.007）（图1B）。然而，GFAP的变化不受APOE基因型、性别或饮食的影响。由于肥胖可能会影响循环中的NfL和GFAP水平（由于血液体积的差异[31-33]），我们还在模型中加入了体重作为协变量（表1）。我们发现体重是6个月时NfL和GFAP随时间变化的显著协变量。在考虑了这一效应后，HFD组在6个月大时的NfL水平更高（主要效应是饮食，p=0.050），而性别和饮食显著影响了GFAP水平的变化。在2个月的时间里，HFD组小鼠的GFAP水平下降，而LFD组小鼠的GFAP水平上升（主要效应是饮食，p=0.008），雌性小鼠的GFAP水平下降，而雄性小鼠的GFAP水平上升（主要效应是性别，p=0.007）。图1 在图查看器中打开

阿尔茨海默病生物标志物受载脂蛋白E4（APOE4）的影响，并且会因高脂饮食（HFD）和雄性性别而增加。在6个月和8个月大的小鼠血清中测量了神经丝轻链（NfL）（A）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（B）。通过从8个月大的血清值中减去6个月大的血清值来计算生物标志物水平的变化。8个月大小鼠脑磷酸化和总tau的代表性Western blot（C）。8个月大小鼠总Tau、pTau181和pTau396的密度计量化（D）。8个月大小鼠的脑淀粉样蛋白水平，包括Aβ40、Aβ42及其比例（E）。8个月大小鼠的APOE蛋白水平量化（F）。8个月大APOE3和APOE4 TR小鼠中Aβ42与APOE的皮尔逊相关性分析（G）。数值以平均值±SEM表示。以下符号代表显著（p≤0.05）的比较：D，主要效应是饮食；S，主要效应是性别；G，基因型与性别的交互作用；D*S，饮食与性别的交互作用；G*D，基因型与饮食的交互作用；G*D*S，基因型与饮食和性别的交互作用；s，基因型/饮食条件内的性别效应；g，饮食/性别条件内的基因型效应；d，性别/饮食条件内的饮食效应。样本大小：n=5–8/组。LFD，低脂饮食；HFD，高脂饮食；E3，载脂蛋白E3；E4，载脂蛋白E4。表1. 血清AD生物标志物分析的ANCOVA结果。ANCOVA p值

协变量的影响

估计的边际均值

G

D

S

G×D

G×S

D×S

G×D×S

身体质量协变量p值

身体质量协变量部分

LFD

HFD

男性

女性

NfL，6个月

0.111

0.050*

0.337

0.119

0.113

0.390

0.828

0.010*

0.141

58.939 [6.180]

80.531 [6.591]

N/A

N/A

NfL，8个月

0.168

0.939

0.582

0.149

0.772

0.936

0.575

0.744

0.002

N/A

N/A

N/A

N/A

NfL的变化

0.878

0.899

0.536

0.820

0.273

0.643

0.501

0.819

0.001

N/A

N/A

N/A

N/A

GFAP，6个月

0.844

0.009*

0.362

0.809

0.775

0.209

0.268

0.082

0.076

15.881 [4.276]

35.347 [4.068]

N/A

N/A

GFAP，8个月

0.137

0.734

0.011*

0.827

0.663

0.630

0.101

0.654

0.005

N/A

N/A

32.948 [2.922]

20.657 [3.196]

GFAP的变化

0.249

0.008*

0.007*

0.384

0.689

0.878

0.789

0.014*

0.146

10.458 [4.622]

?9.170 [4.614]

9.719 [4.230]

注意：显示了血清神经丝轻链（NfL）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的ANCOVA p值，包括基因型（G）、饮食（D）和性别的主要效应，以及基因型/饮食（G×D）、基因型/性别（G×S）、饮食/性别（D×S）和基因型/饮食/性别（G×D×S）之间的交互作用，同时控制了身体质量。仅显示了显著比较的估计边际均值[SEM]。

*p < 0.05。缩写：HFD，高脂饮食；LFD，低脂饮食。我们还在这些小鼠的脑中测量了AD样病理学，以确定性别、饮食和APOE基因型之间的任何潜在交互作用。虽然在总Tau或pTau181中没有观察到差异，但我们发现pTau396存在基因型与性别的效应，APOE4 TR雄性的水平趋势高于APOE3雄性（p=0.058）（图1C,D）。此外，HFD APOE4 TR雌性的pTau396水平显著低于HFD APOE4 TR雄性（p=0.0258）（图1C,D）。接下来，我们检查了Aβ肽1–40和1–42的水平。有趣的是，APOE4 TR小鼠的Aβ40水平高于APOE3 TR小鼠（主要效应是基因型，p≤0.0001）（图1E）。我们还观察到了饮食与性别（p=0.0032）和饮食与基因型的交互作用（图1E）。具体来说，LFD组的雄性APOE4 TR小鼠的Aβ40水平高于它们的雄性APOE3 LFD（p=0.0018）和雌性APOE4 LFD（p=0.0024）对应小鼠（图1E）。在雌性HFD APOE4 TR小鼠中，Aβ40水平相对于它们的雄性APOE4 HFD（p=0.0013）和雌性APOE3 HFD（p<0.0001）对应小鼠有所升高（图1E）。Aβ42的分析显示雄性的水平显著高于女性（主要效应是性别，p=0.0075）（图1E）。还存在基因型与饮食的主要效应（p=0.0205），其中HFD APOE4 TR雄性的Aβ42水平高于LFD组的APOE4雄性（p=0.0214）和HFD组的APOE3雄性（p=0.0408）（图1E）。计算Aβ42/40比率显示APOE4 TR小鼠的水平低于APOE3 TR小鼠（主要效应是基因型，p=0.0032），以及女性相对于男性的水平（主要效应是性别，p=0.0041）（图1E）。我们还观察到HFD增加了APOE4 TR雄性与APOE4 TR LFD雄性（p≤0.0001）、APOE3 TR HFD雄性（p=0.035）和APOE4 TR HFD雌性（p≤0.0001）之间的比率（图1E）。研究还发现了基因型与饮食（p = 0.0251）以及基因型、饮食和性别之间的交互作用（p = 0.0004）（图1E）。鉴于APOE蛋白在清除淀粉样蛋白中的作用，我们测量了这些小鼠大脑中的APOE蛋白水平。结果发现，基因型有显著影响，APOE4(TR)小鼠的大脑APOE蛋白水平低于APOE3(TR)小鼠（p = 0.0255）（图1F）。不出所料，我们也发现饮食有显著影响，高脂饮食（HFD）小鼠的APOE蛋白水平高于低脂饮食（LFD）小鼠（p = 0.0627）（图1F）。在对Aβ42和APOE进行相关性分析时，我们发现APOE3(TR)小鼠之间没有关系，而APOE4(TR)小鼠则表现出正相关，即Aβ42水平升高与APOE蛋白水平升高相关（图1G）。

3.2 三个月大的apoipoprotein E4 (APOE4) TR小鼠的空间学习能力受损
在开始饮食实验前3个月，重复测量分析显示，APOE基因型、性别和训练日对到达目标点的潜伏时间有交互作用（p = 0.061）（图2A）。多重比较分析表明，APOE4会损害Barnes迷宫任务的学习能力，且这种损害在APOE4 TR小鼠中的表现比APOE3 TR小鼠更严重。APOE4 TR小鼠在训练第1-3天完成Barnes迷宫所需的时间明显更长（p1 ≤ 0.001，p2 ≤ 0.001，p3 = 0.030），而在训练第1天这一差异在APOE3 TR小鼠中也存在（p = 0.010）。在APOE4 TR小鼠中，雄性小鼠到达目标点的潜伏时间明显长于雌性小鼠（p1 ≤ 0.001，p2 ≤ 0.001，p3 = 0.006，p4 = 0.027）。在饮食开始后2个月（6个月大时），测试过程中行进的距离与潜伏时间呈现相似的趋势。在饮食开始后的6个月和8个月，无论是学习能力还是对Barnes迷宫环境的记忆回忆，都没有受到APOE基因型、饮食或性别的影响（图2B）。在饮食开始后的8个月，学习能力和记忆回忆同样不受APOE基因型、饮食或性别的影响（图S2）。

3.3 Apolipoprotein E4 (APOE4)介导的海马体蛋白质组学效应取决于性别和饮食
接下来，我们检查了海马体冠状组织（富集而非纯海马体组织）中的蛋白质组，以确定APOE4对蛋白质表达的影响是否依赖于性别和饮食。在所有样本中，我们检测到了5647种蛋白质。这些蛋白质的分析表明，富集的途径包括与代谢、突触通信、轴突生长和蛋白质合成相关的途径（图S4A）。管蛋白α-1B链（TUBA1B）、β-肌动蛋白（ACTB）、髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP1）、髓鞘碱性蛋白（MBP）、动力蛋白GTP酶（DNM1）、果糖-二磷酸醛缩酶A（ALDOA）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II亚单位α（CAMK2A）和突触蛋白-1（SYN1）是样本中最丰富的前1%蛋白质的一部分。这与先前的研究结果一致，即这些蛋白质是小鼠脑组织中表达最多的蛋白质之一[34]。在评估了整体蛋白质丰度和途径富集情况后，我们仅分析了APOE3和APOE4 TR小鼠之间有差异的蛋白质（图3）。我们发现，APOE4导致LFD雄性小鼠中有214种蛋白质表达改变，HFD雄性小鼠中有307种蛋白质表达改变，LFD雌性小鼠中有409种蛋白质表达改变，HFD雌性小鼠中有371种蛋白质表达改变（图3A,B）。大多数蛋白质的表达变化在每个性别和饮食组中都是独特的（图3A）。即使排除了在预饮食学习评估中未能完成迷宫任务的小鼠，我们的结论也没有显著改变。APOE4 TR小鼠在训练第1-2天到达目标点的潜伏时间明显长于APOE3 TR小鼠（p1 ≤ 0.001，p2 = 0.005），在训练第1天这一差异在雌性小鼠中也存在（p = 0.003）。在训练第1和第2天，APOE4 TR雄性小鼠到达目标点的潜伏时间也明显长于APOE4 TR雌性小鼠（p1 = 0.005，p2 ≤ 0.001）。为了将未能完成迷宫任务的小鼠纳入模型，我们还使用成对对数秩比较进行了分析（图S3，表S1）。结果显示，APOE4和APOE3 TR小鼠在训练第1和第2天的逃逸行为存在差异（p1 ≤ 0.001，p2 = 0.003），在训练第1天这种差异在雌性小鼠中也存在（p1 = 0.001）。在这些比较中，APOE4 TR小鼠的逃逸曲线向右偏移，这与APOE4 TR小鼠在Barnes迷宫任务中的表现受损一致。此外，在训练第1-4天，APOE4 TR雄性和雌性小鼠之间的逃逸曲线也存在差异（p1 ≤ 0.001，p2 ≤ 0.001，p3 = 0.012，p4 = 0.005），表现为APOE4 TR雄性的逃逸曲线向右偏移。

3.4 Apolipoprotein E4 (APOE4) 以性别和饮食依赖的方式影响线粒体蛋白质表达
由于APOE4可以诱导线粒体功能障碍[14, 16]，而线粒体功能障碍可能引发下游的阿尔茨海默病病理[11, 12]，我们进一步研究了线粒体蛋白质的变化（图4）。与整个蛋白质组的观察结果类似，我们发现APOE4和APOE3 TR小鼠之间上调或下调的蛋白质几乎没有重叠（图4A）。尽管整体线粒体蛋白质表达没有差异（图4B），但进一步分析表明，所有组中的线粒体途径都受到APOE4的显著影响，尽管这些影响依赖于性别和饮食（图4C）。在MitoCarta3.0数据库中的1140个基因中，有443个基因在基因型比较中上调，其中44个基因在所有组中都显著上调（9.93%），55个基因在所有组中都下调（12.42%），共有22.35%的线粒体蛋白质表达发生差异。

3.4 Apolipoprotein E4 (APOE4) 以性别和饮食依赖的方式影响线粒体蛋白质表达
由于APOE4可以诱导线粒体功能障碍[14, 16]，而线粒体功能障碍可能导致阿尔茨海默病的病理变化[11, 12]，我们进一步研究了线粒体蛋白质的变化（图4）。使用MitoCarta3.0数据库识别了8个月大小鼠数据集中的线粒体蛋白质。文氏图显示了8个月大的APOE4 TR小鼠与APOE3 TR小鼠之间显著上调或下调的蛋白质数量（p ≤ 0.05），以及各组之间APOE4影响的重叠情况（A）。火山图显示了8个月大的APOE4 TR小鼠与APOE3 TR小鼠之间蛋白质表达差异的?log10(p值)与log2(倍数变化)的关系（B）。条形图显示了根据8个月大小鼠中显著改变的蛋白质分析得出的前20个富集途径中的几种蛋白质的?log10(p值)（C）。垂直虚线表示显著性阈值（p = 0.05）。样本量：n = 4/组。LFD表示低脂饮食；HFD表示高脂饮食；E3表示apolipoprotein E3；E4表示apolipoprotein E4。

3.4 Apolipoprotein E4 (APOE4) 以性别和饮食依赖的方式影响线粒体蛋白质表达
由于APOE4可以诱导线粒体功能障碍[14, 16]，而线粒体功能障碍可能与阿尔茨海默病的病理变化有关[11, 12]，我们进一步研究了线粒体蛋白质的变化（图4）。与整个蛋白质组的观察结果类似，我们发现APOE4和APOE3 TR小鼠之间上调或下调的蛋白质几乎没有重叠（图4A）。虽然整体线粒体蛋白质表达没有差异（图4B），但进一步分析表明，所有组中的线粒体途径都受到APOE4的显著影响，尽管这些影响依赖于性别和饮食（图4C）。在MitoCarta3.0数据库中的1140个基因中，有443个基因在基因型比较中上调，其中44个基因在所有组中都显著上调（9.93%），55个基因在所有组中都下调（12.42%），共有22.35%的线粒体蛋白质表达发生差异。

3.4 Apolipoprotein E4 (APOE4) 对线粒体蛋白质表达的影响取决于性别和饮食
由于APOE4可以诱导线粒体功能障碍[14, 16]，而线粒体功能障碍可能与阿尔茨海默病的病理变化有关[11, 12]，我们进一步研究了线粒体蛋白质的变化（图4）。我们使用MitoCarta3.0数据库识别了8个月大小鼠数据集中的线粒体蛋白质。文氏图显示了8个月大的APOE4 TR小鼠与APOE3 TR小鼠之间显著上调或下调的蛋白质数量（p ≤ 0.05），以及各组之间APOE4影响的重叠情况（A）。散点图显示了8个月大小鼠中线粒体蛋白质相对于整个蛋白质组的富集百分比（B）。热图显示了受APOE4显著影响的线粒体途径的激活z分数（p ≤ 0.05）（C）。灰色框表示未能达到富集p值阈值的途径（C）。显著的激活z分数被认为是< -2（下调）或> 2（上调）。散点图显示了8个月大小鼠中参与线粒体翻译的线粒体核糖体蛋白L17（MRPL17）（D）。丙酮酸脱氢酶复合体X成分X（PDHX）和苹果酸酶2（ME2）（E），这两种蛋白质参与了8个月大小鼠的丙酮酸代谢途径（E）。所有与电子传递链（ETC）复合体III、IV、V相关的蛋白质的总表达以及8个月大小鼠的ETC总表达（F）。所有蛋白质的强度均以方差稳定标准化（VSN）log2值表示，并附带平均值±标准误差（SEM）。以下符号表示显著比较（p ≤ 0.05）：G*D*S表示基因型与饮食和性别的交互作用；D表示饮食的主效应；g表示基因型在饮食/性别条件下的效应；d表示饮食在基因型/性别条件下的效应；s表示性别在基因型/饮食条件下的效应。样本量：n = 4/组。LFD表示低脂饮食；HFD表示高脂饮食；E3表示apolipoprotein E3；E4表示apolipoprotein E4。

3.5 Apolipoprotein E4 (APOE4) 与女性较低的基础线粒体呼吸有关
为了确定APOE4介导的线粒体蛋白质水平变化是否对功能产生实际影响，我们评估了分离出的脑线粒体中的丙酮酸支持下的呼吸作用。在基础呼吸条件下，APOE基因型和性别对线粒体氧气消耗有显著交互作用（p = 0.008）（图5A）。事后分析显示，仅APOE4 TR小鼠的女性基础呼吸低于APOE3 TR小鼠（p ≥ 0.001）。此外，APOE3 TR小鼠的男性基础呼吸也低于女性APOE3 TR小鼠（p = 0.005）。在状态3（ADP刺激）条件下，饮食和性别对线粒体呼吸有显著影响（p = 0.022）（图5B）。这主要是由于HFD小鼠的女性在状态3的线粒体呼吸低于LFD小鼠（p = 0.002），以及HFD小鼠的男性与LFD小鼠之间的差异（p = 0.048）。状态3S（琥珀酸）和最大呼吸的分析显示，HFD小鼠的呼吸低于LFD小鼠（主要效应为饮食，pstate3S = 0.012，pmaximal = 0.008）（图5C,D）。在8个月大的小鼠中，从整个左脑半球分离出的线粒体中测量了由丙酮酸支持的氧气消耗量，分别在基础（A）、状态3（ADP）（B）和最大（FCCP）（C）呼吸条件下进行。数值以平均值±标准误差（SEM）表示。以下符号代表显著差异（p≤0.05）：G*S，基因型与性别的交互作用；D*S，饮食与性别的交互作用；（D）饮食的主效应；g，基因型在性别条件内的效应；d，饮食在性别条件内的效应；s，性别在基因型条件内的效应；s*，基因型/饮食条件内的性别效应。样本量：n=5–8/组。LFD，低脂饮食；HFD，高脂饮食；E3，载脂蛋白E3；E4，载脂蛋白E4。

4 讨论

虽然临床前模型表明西方饮食习惯可能会加重与APOE4相关的代谢和认知障碍[19-21]，但对于性别在AD病理变化及可能影响这种关系的蛋白质变化中的调节作用了解较少。在这里，我们发现APOE4以性别和饮食依赖的方式减少了支持小鼠海马区线粒体能量产生的途径。这种变化表现为APOE4阳性TR雌性小鼠的基础线粒体呼吸作用降低。这些变化发生在APOE4和APOE3 TR小鼠之间AD生物标志物没有差异的情况下，暗示性别和饮食依赖的线粒体改变可能在APOE4相关的AD发病机制中起作用。需要注意的是，这里的结果是初步的，需要通过更高功率的研究进一步验证。血清GFAP反映了与炎症相关的星形胶质细胞的激活，而血清NfL反映了神经元损伤[35, 36]。尽管这两种生物标志物会随年龄增长而升高，但在包括AD临床前阶段在内的多种神经退行性疾病中也会升高[37]。在我们的研究中，性别和饮食独立影响血清GFAP水平，而APOE4对生物标志物水平没有影响。虽然在6个月大时不受性别影响，但从6个月到8个月大，男性的GFAP水平升高而女性降低，这解释了8个月大时男性血清GFAP值显著高于女性的原因。饮食则产生了相反的效果，在6个月大时HFD小鼠的血清GFAP升高，而在8个月大时不受饮食影响。这与LFD小鼠的GFAP水平上升以及HFD小鼠从6个月到8个月大的GFAP水平下降有关。NfL也观察到了类似的饮食效应，即体质调整后的血清NfL水平在6个月大时HFD小鼠中更高。这表明HFD可能急性激活星形胶质细胞炎症并诱导神经元损伤，无论基因型如何，这些效应可能随时间减弱。总体而言，我们的发现表明雄性和HFD可能促进神经退行性和炎症，无论APOE基因型如何。饮食、性别和基因型的影响在类似AD的病理结果中都有体现。值得注意的是，APOE4阳性的雄性和女性在比较中的影响最大。这些差异包括pTau396水平的改变，APOE4阳性的雄性显示比APOE3阳性的雄性更高的趋势。在先前的临床前小鼠模型中也报告了类似的结果，APOE4会增加tau的磷酸化[38]。值得注意的是，在基因型内部出现了性别效应，APOE4阳性的雌性在HFD饮食下的pTau396水平低于其雄性对应组。在检查淀粉样蛋白水平时，我们发现APOE4小鼠大脑中的Aβ40积累增加，这种变化进一步受到饮食和性别的影响，而APOE4阳性的雌性在HFD饮食下的增加最为明显。然而，Aβ42的结果有所不同，APOE4 HFD雄性的具体变化更为显著。Aβ42/40比率在APOE4 HFD雄性中也增加，表明Aβ42的积累更多，这种效应在LFD饮食下得到缓解。相比之下，APOE4阳性的雌性表现出不同的模式；虽然它们的Aβ40增加，但Aβ42减少，Aβ42/40比率降低。尽管这些结果并不完全出乎意料，但它们表明淀粉样蛋白不仅受APOE基因型的影响，还受到性别和饮食的相互作用的影响，这与其他研究一致[39, 40]。最后，这些小鼠大脑中的APOE水平因APOE4基因型而降低，而高脂饮食略将其增加。当将Aβ42与APOE水平相关联时，我们仅在APOE4小鼠中观察到正相关。这是一个有趣的发现，表明虽然APOE4小鼠大脑中的APOE水平较低，但随着Aβ42的增加，该蛋白水平升高。尽管APOE4在6个月大时不受性别影响，但从6个月到8个月大，男性的GFAP水平上升而女性下降。饮食产生了相反的效果，即在6个月大时HFD小鼠的血清GFAP升高，而在8个月大时不受饮食影响。这与LFD小鼠的GFAP水平上升以及HFD小鼠从6个月到8个月大的GFAP水平下降有关。对于NfL也观察到了类似的饮食效应，即体质调整后的血清NfL水平仅在6个月大时HFD小鼠中更高。这表明HFD可能急性激活星形胶质细胞炎症并诱导神经元损伤，无论基因型如何，这些效应可能随时间减弱。总体而言，我们的发现表明雄性性别和HFD可能促进神经退行性和炎症，无论APOE基因型如何。饮食、性别和基因型的效应在AD类似的病理结果中都有体现。值得注意的是，APOE4阳性的雄性和女性在比较中的影响最大。这些差异包括pTau396水平的改变，APOE4阳性的雄性显示出比APOE3阳性的雄性更高的趋势。在先前的临床前小鼠模型中也报告了类似的结果，APOE4会增加tau的磷酸化[38]。值得注意的是，在基因型内部出现了性别效应，APOE4阳性的雌性在HFD饮食下的pTau396水平低于其雄性对应组。在检查淀粉样蛋白水平时，我们发现APOE4小鼠大脑中的Aβ40积累增加，这种变化进一步受到饮食和性别的影响，而APOE4阳性的雌性在HFD饮食下的增加最为明显。然而，Aβ42的结果不同，APOE4 HFD雄性的变化更为具体，表现为水平增加。Aβ42/40比率在APOE4 HFD雄性中也增加，表明Aβ42的积累更多，这种效应在LFD饮食下得到缓解。相比之下，APOE4阳性的雌性表现出不同的模式；虽然它们的Aβ40增加，但Aβ42减少，Aβ42/40比率降低。尽管这些结果并不完全出乎意料，但它们表明淀粉样蛋白不仅受APOE基因型的影响，还受到性别和饮食的相互作用的影响，这与其他研究一致[39, 40]。最后，这些小鼠大脑中的APOE水平因APOE4基因型而降低，而高脂饮食略微增加。当将Aβ42与APOE水平相关联时，我们仅在APOE4小鼠中观察到正相关。这是一个有趣的发现，表明尽管APOE4动物大脑中的APOE水平较低，但随着Aβ42的增加，该蛋白水平升高。尽管APOE4没有影响AD生物标志物，但我们发现3个月大时在开始饮食之前，APOE4小鼠的学习能力受损。这与现有证据一致，即APOE4小鼠在这个年龄段表现出认知缺陷[41]。有趣的是，这种效应在雄性中更为明显，这令人惊讶，因为通常认为雄性在APOE4相关的AD风险方面受的影响小于女性[23]。无论如何，这强调了在评估APOE4介导的认知效应时包括两性的重要性。我们观察到APOE4和性别在6个月或8个月大时不影响记忆或学习，这可能有几个原因。在第一个时间点，小鼠首次接触Barnes迷宫。这与后来的时间点形成对比，后者小鼠已经习惯了Barnes迷宫程序，这可能掩盖了组间表现的细微差异。这一解释与APOE4与后期认知功能较差相关的发现一致[20, 22]。未来的研究可以在更大的年龄开始首次Barnes迷宫测试，或在后来的时间点考虑使用其他认知测试。或者，后期Barnes迷宫表现中没有组间差异可能反映了这些年龄下APOE4介导的认知功能补偿能力。需要注意的是，一个主要限制是样本量较小。这些小样本量限制了检测潜在生物学相关记忆和学习变化的能力。海马是AD最早受影响的脑区之一。我们发现，该区域大多数受APOE4影响增加或减少的蛋白质在每个组中都是独特的，这表明性别和饮食是APOE4介导的病理效应的重要决定因素。虽然我们没有通过解剖分离出海马区域，但我们确实富集了海马组织。需要注意的是，蛋白质组学发现还包括海马中的皮质和丘脑区域。APOE4以性别和饮食依赖的方式显著减少了线粒体途径，这支持了APOE4诱导线粒体功能障碍的现有证据[14, 16]，同时还揭示了性别和饮食在这种关系中的潜在中介作用。有趣的是，我们发现PDHX表达（PDH的一个组成部分）在HFD饮食下的APOE4阳性和阴性小鼠中都减少。鉴于PDH在将丙酮酸转化为乙酰辅酶A以供柠檬酸循环下游氧化中的作用，它在线粒体能量产生中起着关键作用。AD患者的脑组织中PDH活性降低[42]，并且在临床前模型中受APOE4影响[43, 44]。我们的数据表明饮食可能是这一关系中的关键因素，但需要更多动物的研究来提高统计功效并确定真实的效应大小。值得注意的是，在蛋白质组学分析中，没有单个蛋白质值在假发现率（FDR）下具有显著性，因此这些发现是基于发现的，需要进一步验证。除了PDH之外，线粒体ETC复合体的活性和表达也受到APOE4携带状态和AD的影响[45-48]，可能有助于解释AD中观察到的能量缺陷。我们对线粒体ETC复合体的评估通过显示APOE4与HFD阴性女性复合体III和IV表达降低有关，这与神经元细胞模型中的研究结果一致，表明APOE4的蛋白水解片段与这些相同ETC组分的活性相互作用并降低其活性[49]。我们的研究表明性别和饮食可能进一步影响这种关联。我们的结果还表明HFD损害了所有小鼠的线粒体ETC表达，这一点得到了HFD与复合体V水平降低的发现的支持，无论APOE基因型和性别如何。在分离的线粒体中进行的呼吸测定分析显示，APOE4仅与HFD阴性小鼠的分子和功能线粒体变化相关。尽管在所有测试条件下APOE4 TR阴性小鼠的平均线粒体呼吸作用最低，但这仅在基础呼吸过程中转化为APOE基因型的显著效应，这种效应不受饮食影响。在较年长的小鼠中进行类似的研究将有助于确定APOE4介导的线粒体蛋白表达的性别和饮食依赖的变化是否会导致随时间积累的线粒体功能缺陷，尤其是在促进ETC活性的条件下（状态3）。在年轻小鼠中重复研究也有助于了解认知和线粒体缺陷之间的时间关系。除了APOE基因型外，我们还发现HFD与女性状态3线粒体呼吸降低以及两性状态3S和最大呼吸相关，这表明饮食是独立于APOE基因型的重要影响因素。这些呼吸功能上的差异可能是由HFD小鼠与LFD小鼠相比ETC表达减少所驱动的。我们的数据表明，饮食可能会影响线粒体ETC的表达。我们的评估还表明HFD影响所有小鼠的线粒体ETC表达，这一点得到了HFD与复合体V水平降低的支持，无论APOE基因型和性别如何。此外，我们的研究还表明HFD损害了所有小鼠的线粒体ETC表达。呼吸测定分析表明，APOE4仅与HFD阴性小鼠的分子和功能线粒体变化相关。虽然平均线粒体呼吸作用在所有测试条件下APOE4 TR阴性小鼠中最低，但这仅转化为APOE基因型在基础呼吸期间的显著效应，这种效应不受饮食影响。在较年长小鼠中进行类似的研究将有助于确定APOE4介导的线粒体蛋白表达的性别和饮食依赖的变化是否会导致随时间积累的线粒体功能缺陷。除了APOE基因型外，我们的发现还表明HFD与女性状态3线粒体呼吸降低以及两性状态3S和最大呼吸增加有关，这表明饮食是独立于APOE基因型的生物能量功能的重要影响因素。这些呼吸功能的差异可能是由HFD小鼠与LFD小鼠相比ETC表达减少所驱动的。我们的数据值得进一步研究饮食习惯在认知障碍发生前的早期作用。我们的研究有几个优势。我们使用了多种稳健的方法来全面评估APOE4的分子和功能效应。为了检测血清生物标志物，我们使用了Simoa平台，这是一种超灵敏的先进免疫测定方法，常用于AD研究。为了测试认知功能，我们使用了Barnes迷宫程序，这是一种广泛用于啮齿动物AD研究以评估海马依赖的记忆和学习能力的工具。虽然缺乏压力刺激可能会影响完成Barnes迷宫的动机，但我们在分析中考虑了这一点。此外，我们选择了这种测试而不是Morris水迷宫，因为后者的压力更大，而且APOE基因型与HFD喂养小鼠的焦虑行为差异有关[21, 50]。我们的研究价值还通过直接评估脑组织中的分子结果得到了增强。我们使用蛋白质组学全面比较了组间的蛋白质表达，并结合高分辨率呼吸测定来解释我们的发现。这使我们能够探究线粒体呼吸功能的多个方面。虽然我们承认在海马冠状切片中的蛋白质组学分析和来自整个左脑半球的线粒体呼吸测定分析有限制，但收集足够的海马组织用于蛋白质组学和呼吸测定是具有挑战性的。尽管我们的研究有优势，但也有不足之处。第一个不足是在比较基因型、性别和饮食的数据时统计功效和样本量有限。尽管如此，我们的目标是在多个互补结果的背景下提供我们的发现，为APOE和AD风险的假设生成和测试提供资源。这里提供的数据对于未来更大规模研究的功效计算和机制设计很有用。因此，需要注意的是，蛋白质组学数据需要在未来更大规模的研究中通过严格的假发现率截止值进行复制。我们专注于APOE3和APOE4，没有考虑APOE2的影响。未来的研究还应该考虑APOE2，特别是在性别和饮食的背景下，鉴于其在心血管健康中的影响。此外，需要注意的是，在小鼠中表达人类APOE可能会影响生物功能和研究结果。这项研究的结果应在基于人类研究的大型队列和人类细胞系的更大背景下进行考虑，以增加严谨性。总之，我们提供了新的证据，表明APOE4介导了小鼠早期性别和/或饮食依赖的认知表现、蛋白质表达和线粒体功能的差异。尽管需要更多的工作来了解这些发现是否在AD中起病因作用，但我们的工作的直接效应强调了在研究APOE4效应时考虑性别和饮食的必要性。值得注意的是，饮食是一个可调节的因素，可能会引发生命早期的线粒体变化，这些变化可能对阿尔茨海默病的发病机制产生影响。作者贡献：

- 形式分析：C.N.J.、C.R.L.、X.C.、V.C.、F.B.、P.J.K. 和 E.F.
- 资金获取：P.C.G.、J.K.M.、J.P.T. 和 H.M.W.
- 文稿撰写（初稿准备）：C.R.L. 和 C.N.J.
- 文稿修订与编辑：所有作者

致谢：
本研究得到了Margaret “Peg” McLaughlin 和 Lydia A. Walker 机会基金的支持。此外，还得到了 KU ADRC Brain Health Training Program (P30 AG072973) 的资助。其他作者的支持还包括：R01 AG062548 (J.K.M.)、R01 AG081304 (J.K.M.) 和 T32 AG078114 (C.N.J. 与 C.R.L.)、R01AG078186 (H.M.W.)、R00AG056600 (H.M.W.)、R01DK121497 补助金 (J.P.T.)、VA Merit Review 授予 (1I01BX002567) (J.P.T.)、阿尔茨海默病协会资助 (23AARG-1023294) (H.M.W.)、T32HD057850 (V.C.) 和 T32DK128770 (E.F.)。UAMS 的蛋白质组学研究得到了 IDeA 国家定量蛋白质组学资源及 NIH/NIGMS 资助 (R24GM137786) 的支持。本文中使用的 Ingenuity Pathways Analysis (IPA) 软件得到了生物统计学和信息学共享资源的支持，该资源由国家癌症研究所癌症中心支持资助 (P30 CA168524)；同时得到了堪萨斯 IDeA 生物医学研究卓越网络数据科学核心的支持 (NATIONAL INSTITUTE OF GENERAL MEDICAL SCIENCE 奖项 P20 GM103418) 以及堪萨斯精准医学研究所 COBRE 的支持 (NATIONAL INSTITUTE OF GENERAL MEDICAL SCIENCE 奖项 P20 GM130423)。行为学研究由 KUMC啮齿动物行为设施完成，得到了堪萨斯智力和发育障碍研究中心 (NIH U54 HD 090216) 以及堪萨斯 IDeA 生物医学研究卓越网络 (P20 RR016475) 的支持。线粒体呼吸研究得到了堪萨斯代谢与肥胖研究中心内的代谢核心实验室的支持 (NATIONAL INSTITUTE OF GENERAL MEDICAL SCIENCE COBRE 奖项 P20GM144269)；代谢核心实验室的设备购置费用由 NIH S10OD028598 提供。本文内容仅代表作者个人观点，不一定代表美国国立卫生研究院的官方立场。

利益冲突：
作者声明不存在任何利益冲突。

数据获取：
如需研究数据，可向通讯作者索取。