《The FASEB Journal》：Development of Immunoelectron Microscopy for VASN Detection Using Multiple Models and Identification of VASN as a Key Regulator of Mitochondrial Homeostasis in Hepatocellular Carcinoma Cells
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血管抑素（Vasorin, VASN）是一种跨膜糖蛋白，在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）的进展中通过调控细胞增殖和迁移发挥关键作用。然而，由于其超微结构分辨率和定量分析技术的限制，VASN的亚细胞定位和细胞器特异性功能机
血管抑素（Vasorin, VASN）是一种跨膜糖蛋白，在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）的进展中通过调控细胞增殖和迁移发挥关键作用。然而，由于其超微结构分辨率和定量分析技术的限制，VASN的亚细胞定位和细胞器特异性功能机制仍未明确界定。本研究开发了一种优化的免疫电镜（Immunoelectron Microscopy, IEM）方案（IEM-VASN），该方法结合了4%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定和1:200的抗VASN抗体稀释，在结构保存和抗原性之间达到了最佳平衡。该方法实现了在Huh7-KD细胞（p<0.0001）和Vasn?/?小鼠（p<0.0001）中精确检测VASN的缺失。IEM-VASN揭示了VASN的细胞器特异性分布，在HCC细胞和肝组织中均显示其在线粒体中显著富集（p<0.001 和 p<0.0001）。此外，小鼠HCC组织表现出VASN水平升高（p<0.001）伴随线粒体数量减少（p<0.01）。在一个慢性黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）暴露模型中，VASN的上调与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）积累、线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）耗散以及线粒体自噬（Mitophagy）诱导相关。IEM-VASN方法在细胞、动物和病理模型中均表现出高精度和适用性，为阐明VASN在HCC中的功能作用提供了有力工具。这些发现建立了一种高灵敏度、高特异性的IEM技术，用于表征VASN的超微结构分布，突出了其主要在线粒体中的定位以及在HCC进展和化学诱导的线粒体自噬中的功能参与，从而将VASN定位为肝癌和线粒体稳态中的关键分子介导因子。
一、研究背景、问题与目的
血管抑素（Vasorin, VASN）是一种I型跨膜糖蛋白，其模块化结构使其具有多样的生物学功能。已有研究表明VASN在多种疾病中扮演重要角色，例如在心血管系统中调节血管平滑肌细胞表型转换，在肿瘤发生发展中则表现出“双重作用”，即在乳腺癌、甲状腺癌中通过表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）通路促进转移，而在前列腺癌中通过阻断上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）过程抑制肿瘤进展。在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）中，VASN通过激活Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）/带PDZ结合基序的转录共激活因子（Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ）通路、通过外泌体递送至内皮细胞促进血管生成和转移、以及调节肝糖原代谢等多种机制促进肿瘤进展。然而，当前研究主要关注VASN的宏观表达水平，其亚细胞定位和超微结构分布仍不清晰，这阻碍了对其功能机制的精确阐明。免疫电镜（Immunoelectron Microscopy, IEM）因其纳米级分辨率，被认为是确定蛋白质超微结构定位的金标准，但传统的IEM面临固定条件不理想、抗体敏感性有限等挑战。因此，研究人员旨在建立一种稳健的IEM方法（IEM-VASN），用于在超微结构水平追踪VASN，并将其应用于多种细胞和动物模型，以期阐明VASN在HCC细胞中的功能和定位。本论文发表于《The FASEB Journal》。
二、主要技术方法
研究人员开发并优化了用于检测VASN的免疫电镜（IEM-VASN）方案。关键技术点包括：1. 样本处理与固定：系统评估了不同浓度的多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）和戊二醛（Glutaraldehyde, GA）混合固定液对细胞（Huh7细胞）和小鼠肝组织超微结构的保存效果，最终确定4% PFA + 0.5% GA为最佳固定条件。2. 抗体标记优化：使用了实验室自主研发的针对VASN的EGF样结构域（EGF-like domain, EGFFN3片段）的单克隆抗体，并通过系统测试不同抗体稀释度（1:100, 1:200, 1:300等），确定1:200为最佳稀释比例，以实现特异性的免疫金标记，同时平衡信噪比。3. IEM流程与定量分析：采用LR Gold树脂包埋，通过透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察，并对代表视野中的胶体金颗粒进行半定量计数，以分析VASN的表达水平和亚细胞分布。该方法在多种模型中得到应用和验证。研究所用细胞包括人肝癌细胞系（Huh7, HepG2）和正常肝细胞系（HL7702, L02, WRL68）。动物模型包括利用CRISPR-Cas9技术构建的Vasn?/?基因敲除小鼠，以及通过高压尾静脉注射（Hydrodynamic Tail Vein Injection, HTVi）致癌质粒混合物诱导的HCC小鼠模型。此外，还建立了人肝细胞（L02和WRL68）慢性暴露于低剂量黄曲霉毒素B1（AFB1）的体外模型，以模拟长期毒性效应。
三、研究结果
3.1 在HCC细胞中建立检测VASN蛋白的免疫电镜方法
研究人员通过比较不同固定液配方和抗体稀释条件，建立了优化的IEM-VASN方案。结果表明，使用4% PFA + 0.5% GA固定Huh7细胞能最佳地保存细胞器超微结构。使用1:200稀释度的实验室自主研发抗VASN抗体进行免疫金标记，可获得最佳的标记效果和信噪比，为后续定量和定位分析奠定了基础。
3.2 在小鼠肝组织中建立检测VASN蛋白的IEM方法（IEM-VASN）
类似地，在小鼠肝组织中也评估了不同固定条件和抗体稀释度。最终确定4% PFA + 0.5% GA固定结合1:200抗VASN抗体稀释是最佳组合，能够在良好保存组织超微结构的同时，实现VASN的特异性、可重复性检测。
3.3 IEM-VASN分析证实VASN在肝癌细胞中高表达，在Huh-7-KD细胞中表达显著降低
应用建立的IEM-VASN方法比较肝癌细胞Huh7和正常肝细胞HL7702，发现Huh7细胞中VASN标记的金颗粒数量显著高于HL7702细胞。此外，通过慢病毒感染建立了稳定的VASN敲低（Knockdown, KD）细胞系Huh7-KD，并通过qRT-PCR和Western blot验证了敲低效率。IEM-VASN分析显示，Huh7-KD细胞中VASN标记的金颗粒数量较野生型Huh7细胞显著减少，证实了该方法的相对定量分析能力。
3.4 半定量IEM分析揭示VASN在Vasn?/?小鼠肝组织中的表达水平
将IEM-VASN应用于CRISPR-Cas9技术构建的Vasn?/?小鼠肝组织。免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）和IEM结果均显示，与野生型（Wild-type, WT）小鼠相比，Vasn?/?小鼠肝组织中VASN蛋白表达和标记的金颗粒数量均显著降低，进一步验证了该方法检测VASN缺失的敏感性和特异性。
3.5 IEM-VASN提示VASN在HCC细胞和小鼠肝组织中主要定位于线粒体
通过免疫荧光和IEM-VASN对VASN进行亚细胞定位分析。免疫荧光显示VASN广泛分布于Huh7细胞的细胞质和细胞器中。IEM-VASN的层析统计分析则提供了更精确的定位信息：在Huh7细胞中，VASN在细胞突起和线粒体中表达较高；在小鼠肝组织中，VASN在线粒体和脂滴中表达显著高于其他细胞器。功能实验表明，用抗VASN抗体处理HCC细胞（Huh7和HepG2）会导致ROS水平显著升高，同时线粒体膜电位和ATP含量显著下降，提示VASN影响线粒体功能。
3.6 IEM分析显示VASN在高压尾静脉注射肝癌组织中高表达并伴随线粒体数量减少
在HTVi诱导的HCC小鼠模型中，IHC检测证实了肿瘤标志物CK7、CK19、GPC3阳性。TEM显示肝癌肝细胞出现细胞骨架松散、内质网破裂、线粒体结构模糊等损伤。IEM-VASN分析表明，与对照组相比，肝癌组织中VASN标记的金颗粒数量显著增加，而肝细胞中的线粒体数量显著减少，提示VASN高表达与线粒体损耗相关。
3.7 慢性暴露于AFB1导致肝细胞VASNmRNA水平的动态变化和线粒体损伤
研究人员建立了L02和WRL68细胞长期慢性暴露于低剂量AFB1的模型。qRT-PCR分析显示，在特定传代阶段（如L02细胞的P24-P36，WRL68细胞的P3-P15），AFB1暴露组细胞的VASNmRNA水平显著高于对照组。在VASNmRNA显著升高的传代（L02-P36, WRL68-P15），线粒体功能检测显示ROS积累、线粒体膜电位下降、脂质过氧化水平升高。TEM观察进一步证实了这些细胞中线粒体出现肿胀、空泡化等结构损伤。
3.8 AFB1通过VASN介导的线粒体损伤调控线粒体自噬
动态监测显示，在慢性AFB1暴露过程中，L02和WRL68细胞的ROS和线粒体膜电位呈现复杂的阶段性变化。TEM在AFB1暴露的特定传代细胞中观察到了线粒体自噬体。对自噬标志蛋白的Western blot分析表明，在AFB1暴露的早期/中期阶段，LC3-II/I比值升高，p62水平降低，提示自噬被激活。然而，在暴露后期（如L02-P40/P45, WRL68-P30/P36），LC3-II/I比值下降，p62水平升高或不稳定，表明自噬流受到抑制，自噬调控网络失调。
四、讨论与结论总结
讨论部分首先比较了IEM与蛋白质印迹、免疫荧光等技术在分辨率、定量能力和抗原保存方面的优劣势，强调了本研究建立的IEM-VASN方法在纳米级精确定位方面的价值。接着，详细阐述了IEM技术应用中关于样本固定和抗体优化的关键挑战，以及本研究如何通过系统优化找到平衡点。
随后，讨论聚焦于VASN在线粒体定位的功能意义。本研究首次通过IEM证实VASN在HCC细胞和小鼠肝组织线粒体中显著富集。结合文献，研究人员提出VASN可能作为线粒体相关的抗凋亡蛋白，并通过调节线粒体抗氧化蛋白硫氧还蛋白-2、或间接通过信号转导和转录激活因子3等通路，在细胞能量代谢和应激适应中扮演角色。在HTVi肝癌模型中观察到的VASN上调和线粒体数量减少，进一步支持了VASN在HCC线粒体稳态失衡中的作用。
关于AFB1模型，讨论指出不同起源的肝细胞系在基线VASN表达和AFB1代谢能力上的差异，可能导致了VASN上调动力学的不同，但最终都导向VASN上调和线粒体功能损伤的共同病理结局。慢性AFB1暴露引起的VASN上调、线粒体膜电位下降、ROS积累和线粒体结构损伤，共同诱发了线粒体自噬。自噬标志物的动态变化表明，暴露初期自噬被激活以清除损伤线粒体，但长期暴露导致自噬流被抑制，自噬调控网络崩溃，这可能参与了肝细胞的恶性转化。
研究人员也指出了本研究的局限性，包括未进行更全面的线粒体功能呼吸测定分析，以及缺乏VASN过表达或回补等挽救实验来进一步证实其因果作用，这些将是未来研究的方向。
研究结论：本研究利用具有自主知识产权的抗VASN单克隆抗体，建立了一种新型高灵敏度免疫电镜技术。该技术首次实现了对VASN的准确超微结构可视化和定量，其结果与非电镜方法获得的结果一致。该技术揭示VASN显著富集于线粒体，并将此定位与VASN在HCC进展和AFB1诱导的线粒体自噬中的关键作用在功能上联系起来。这些发现表明，VASN可能作为HCC中线粒体稳态的关键调节因子，对于理解肿瘤代谢、识别新的生物标志物和探索新的治疗靶点具有潜在意义。
