利用AOP网络方法对斑马鱼胚胎不同发育阶段的137Cs进行毒基因组学评估

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Toxicogenomic assessment of 137Cs in zebrafish embryos across developmental stages using an AOP network approach

　　方文迪|姚嘉|万启林|冯庆良|王宇通|曹少飞|夏普中国吉利梁大学能源环境与安全工程学院，学院路258号，杭州，浙江310018，中国

摘要：随着核能的进步和广泛应用，以及福岛核废水排放事件的发生，人们对放射性元素在水生环境中造成的环境风险的担忧日益增加。铯-137（137Cs）是一种重要的人为放射性核素，它在多种生物体中表现出发育毒性；然而，这种环境风险的确切程度和特定阶段的分子机制仍未能得到充分定义。本研究使用斑马鱼胚胎来研究137Cs在各个发育阶段（包括原肠期、分节期、孵化期和完整周期阶段）的影响及其相关机制。受精后48小时的形态观察显示，在194和970 Bq/L的暴露浓度下，斑马鱼在孵化期（S3）和完整周期阶段（S4）出现了显著的胚胎畸形（p < 0.05）。浓度依赖性的转录组分析表明，137Cs干扰的生物途径主要与基因损伤修复有关。这些途径包括mRNA 5′-UTR结合、通过断裂诱导复制的双链断裂修复以及单链DNA解旋酶活性，效应开始的浓度点（POD）≤ 100 Bq/L。最后，将137Cs富集的生物途径整合到一个不良后果通路（AOP）网络中，以定量比较和机制阐明特定阶段的毒性，揭示了四种典型的AOP：DHB4/HSD17B4比值的降低导致肝脂肪变性、近端管上皮（肾小管）中腺瘤/癌的诱导、NADH-泛醌氧化还原酶的抑制导致神经退化，以及微管结合导致后代非整倍体。本研究介绍了一种新的方法，用于评估与放射性物质相关的环境风险，并建立特定阶段的AOP信息机制，这对于完善安全基准至关重要。

1. 引言
核能的进步和核技术的广泛应用导致了放射性同位素铯-137（137Cs）的人为释放，使其在水生系统中的浓度升高并在水生生物体内积累。据报道，福岛县大川附近阔叶林的降雨水中137Cs的活度浓度为1.70 Bq/L，而针叶林的降雨水中为0.86 Bq/L（Tsuji等人，2016年）。此外，张等人（2019年）报告称中国东部水域的137Cs放射性水平在0.03至1.92 mBq/L之间，而王等人（2022年）在中国南海和东海检测到137Cs同位素水平达到3.34 mBq/L。长期暴露导致鱼类中普遍检测到放射性137Cs。例如，王等人（2018a年）测量了2011年至2016年间福岛附近中层水鱼组织中的137Cs活性，其值在5至1200 Bq/kg之间。另外，Madigan等人（2012年）报告称美国西海岸15条蓝鳍金枪鱼中的137Cs活性为6.3 ± 1.5 Bq/kg。目前，中国核电站放射性废水的国家标准规定，不包括3H和14C在内的放射性核素的活度浓度不应超过1000 Bq/L（GB6249–2011）。然而，这种基线暴露浓度下放射性核素对水生生物的潜在不良影响，特别是在敏感的发育阶段，以及其背后的机制，尚未得到充分阐明。研究表明，137Cs在10^-4 Gy/L的浓度下会损害贻贝和海胆的胚胎发育（Li等人，1985年），而2 Gy的137Cs辐照会导致斑马鱼胚胎出现染色体异常和细胞死亡（Asana Marican和Shen，2024年）。关于137Cs诱导的发育毒性的研究主要集中在吸收的辐射剂量（Gy）上，并主要探讨了分子和细胞水平的氧化应激和DNA损伤，以及其对生存、生长和繁殖的影响（Asana Marican和Shen，2024年；Lerebours等人，2018年）。然而，在环境相关活度浓度（Bq/L）下，特别是在关键发育阶段，分子水平的变化与137Cs所产生的毒性结果之间的因果关系尚未得到充分描述（Sookjuntra等人，2024年）。因此，研究放射性核素137Cs在水生生物中诱导发育毒性的特定阶段机制联系对于改进当前的137Cs阈值和保护水生生态系统健康至关重要。最近，浓度依赖性转录组学与不良后果通路（AOP）框架的结合有助于理解分子反应与毒性结果之间的联系（Brockmeier等人，2017年）。AOP框架描述了化学物质进入生物体后与特定目标分子的相互作用，这被称为分子初始事件（MIE）。这种相互作用随后通过关键事件（KEs）引发生理变化，最终导致与风险评估相关的不良后果（AO）（Ankley等人，2010年）。通过专家注释，可以将组学数据标注到AOP数据库中的KEs上，从而将其纳入AOP框架（Martens等人，2018年；Nymark等人，2018年）。浓度依赖性转录组学可用于计算特定基因、途径或AOP的转录组起始点（tPODs），以量化其生物学效应（Peng等人，2019年；Xia等人，2021年；Xia等人，2017年）。例如，Xia等人（2021年）引入了浓度依赖性组学方法，不仅构建了短链氯化烃（SCCPs）的AOP网络图，还确定了每个事件的效应起始浓度。这促进了人类HepG2细胞和斑马鱼胚胎之间的跨模型比较。基于组学的AOP分析的应用主要集中在评估化学毒性上，而其在放射性毒性方面的适用性，尤其是对特定阶段毒性的描绘，尚未得到充分探索。本研究评估了放射性元素137Cs对斑马鱼胚胎发育的不良影响，确定了其发育毒性机制，并描述了AOP及其初始浓度的影响，以指导后续的137Cs放射性核素风险评估。为了实现这一目标（图1），进行了以下研究：（1）通过测量死亡率、畸形率和身体轴等指标来评估137Cs对斑马鱼发育的不良影响；（2）使用浓度依赖性组学确定137Cs诱导的发育毒性的关键靶点和生物途径；（3）使用特定阶段的AOP来比较所有发育阶段的137Cs毒理学效应，并量化风险评估的关键机制。本研究极大地推进了人们对放射性核素毒理学中发育毒性机制的理解，并通过关注特定阶段的机制差异，优化了类似放射性元素的环境风险评估方法。

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图1. 本研究的工作流程。

1. 材料与方法
2.1. 化学信息
137Cs溶液（1.2313 × 10^6 Bq/mL）由中国辐射防护研究院提供。根据《核电站环境辐射防护规定》（GB6249–2011）第6章第8条，“核电站海侧站出口处的放射性废水中除3H和14C以外的放射性核素的活度浓度不得超过1000 Bq/L”。因此，本研究中137Cs的活度浓度范围设计为包括1000 Bq/L。
2.2. 鱼类饲养
从中国科学院水生生物学研究所（武汉，中国）获得了性成熟的斑马鱼（AB品系，4个月大）。这些鱼被饲养在玻璃水族箱中，水温为28 ± 0.5°C，pH值为7.4–8.1，光照/黑暗周期为14:10。每天两次喂食活盐水虾。为了收集胚胎，将雄鱼和雌鱼（比例为2:1）转移到繁殖池中。光照开启后一小时收集受精胚胎，然后清洗并在0.25‰盐水中孵化。受精后2小时（hpf），在立体显微镜下选择健康的胚胎；排除任何未受精或发育异常的胚胎，以确保实验的一致性。
2.3. 化学暴露
暴露方案按照OECD测试指南236建立。为了确保辐射安全，在制备137Cs标准储备溶液（1.2 × 10^5 Bq/L）时使用了铅服和防尘帽。随后将该储备溶液稀释到七个目标活度浓度（0（对照）、38.4、192、960、4.8 × 10^3、2.4 × 10^4和1.2 × 10^5 Bq/L），这些浓度分别对应于1.57、7.87、39.36、196.8、984.0和4920 μGy/h的剂量率，以涵盖从环境基准到潜在意外释放情景的范围。胚胎毒性评估每个浓度组使用三个生物学重复样本，暴露溶液的装载密度为10个胚胎/mL。暴露在6厘米的培养皿中进行，培养皿之间至少相隔15厘米以减少潜在的辐射干扰。培养皿被盖住，环境保持在28°C，光照/黑暗周期为14:10。暴露窗口根据关键发育阶段定义：S1组（2–10 hpf，原肠期），S2组（10–24 hpf，分节期），S3组（24–48 hpf，孵化期），S4组（2–48 hpf，完整胚胎期）。不同阶段的暴露溶液不同：短持续时间阶段（S1、S2和S3）在其相应时期内保持不变，而连续的完整周期暴露（S4）溶液每24小时更新一次，以在整个48小时期间保持浓度稳定。在特定暴露期结束后，S1组和S2组的胚胎被冲洗并转移到新鲜的无137Cs的海盐水中。所有实验组（S1–S4）的表型观察和采样都在受精后48小时统一进行，以捕捉即时和潜在的辐射效应。暴露后，收集水样，并使用高纯度锗伽马光谱仪（CANBERRA，BE3830）量化实际放射性水平。
2.4. 胚胎毒性评估
在受精后48小时，使用立体显微镜（Leica，Solms，德国）记录胚胎死亡情况并评估胚胎发育情况。根据既定的标准化标准对畸形的存在和严重程度进行评分。观察的主要指标包括受精后48小时的畸形、在三个生物学重复样本中随机选择的10个胚胎在30秒间隔内测量的心率、受精后48小时的体长（每个平行组随机选择10个受精卵），以及受精后48小时的孵化率。此外，还拍摄和记录了发育不良和畸形的胚胎，并测量了幼鱼的体长，从吻部到尾部沿身体轴的长度。
2.5. 浓度依赖性转录组学分析
转录组学分析使用了与第2.3节所述的胚胎毒性评估相同的特定阶段暴露方案，利用五种浓度进行了五倍系列稀释：0（对照）、38.4、192、960、4.8 × 10^3、2.4 × 10^4和1.2 × 10^5 Bq/L。选择最大暴露水平（1.2 × 10^5 Bq/L），因为在初步急性毒性筛选中未观察到该浓度下的统计学显著死亡；因此，这个浓度组被用作转录组分析的最高浓度组。在暴露期结束时分离出胚胎样本，并使用Trizol试剂盒（Thermo Fisher，15596018）纯化总RNA。关于转录组测试的详细信息见文本S1。
根据已建立的方案（Wang等人，2018b），进行浓度-反应建模以识别敏感基因并定量确定转录组起始点（PODgene）值。简而言之，对于137Cs，将六个系列稀释中每个基因的转录组计数转换为相对于三个对照的平均值的log2倍数变化值。使用R包drc（Ritz和Streibig，2005）和DoseFinding（Pinheiro等人，2014）对九个浓度（包括六个系列稀释和一个零值对照）的log2倍数变化进行了建模。拟合了三种不同曲线类型的九个剂量-反应模型——S形、线性和U形，并根据最小Akaike信息准则（AIC）选择了每个基因的最佳模型（表S1）。仅保留了具有显著曲线拟合性能的基因（p < 0.05）。PODgene定义为S形模型达到最大效应的50%的浓度，或线性模型相对于对照组达到绝对1.5倍变化的浓度。对于U形模型，PODgene确定为第一个单调段内绝对1.5倍变化的浓度。这种方法采用多种模型（S形、线性和U形）来稳健地捕捉基因响应模式的多样性，包括潜在的非单调效应，选择标准（最小AIC）确保了模型选择的科学合理性。所选的POD阈值（最大效应的50%或绝对1.5倍变化）是科学界定义的标准，用于确定转录水平上生物显著变化的浓度。这种系统的生物统计学方法使我们能够全面理解不同表达谱中的基因水平效力。具有最小PODgene值的基因被指定为高度敏感的分子标记。为了评估各种生物过程的相对效力，仅保留了至少有三个匹配基因且P值小于0.05的超几何分布的生物途径（如GO术语或KEGG途径）以进行进一步分析。随后使用与生物途径匹配的基因的几何平均值作为这些途径的起点（PODGO、PODKEGG）。最后，使用GraphPad（GraphPad Prism 10.0软件；美国加利福尼亚州圣地亚哥）对排序后的散点数据进行了四参数剂量-反应曲线拟合，以表征每个样本的总体生物学效力。该曲线被称为生物效力分布曲线（BDC）。选择GO术语来构建BDC是因为它们在整个数据集中提供了最全面的基因和多样化生物途径的覆盖。

2.6. AOP网络分析
所有AOPs、MIEs、KEs、不良后果（AOs）和关键事件关系（KERs）均从AOPWiki网站（https://aopwiki.org/relationships，访问日期为2025年5月25日）获取。使用Cytoscape 3.10.3将KERs列表转换为网络格式的“cyjs”文件（Shannon等，2003年）。随后使用R包igraph 2.1.4构建“cyjs”文件（Csárdi和Nepusz，2006年），网络中的每个节点代表一个KE，每个有向边表示从上游到下游的KER（图S1）。此外，通过手动映射和与已建立的AOP-Wiki注释进行交叉参考，将GO、KEGG、PID、Reactome和Biocarta数据库中的注释途径信息转换为KEs（Ives等，2017年）。随后对浓度依赖性的转录组数据进行处理，以确定每个样本的KE反应。这些反应使用PODpathway值（例如PODGO、PODKEGG等）分配给相应的KEs，这些值被称为PODKE值（Pollesch等，2019年）。使用VEN图来辨别每个样本中KE的相似性和差异性。通过Sankey图阐明了每个样本中KE在生物组织、事件作用、POD水平和终点方面的分布。基于从样本中获得的全面KE信息，与AOPWiki网站上的已建立AOP列进行了匹配分析。这项分析旨在识别可能由KE富集引起的AOs，并对终点类型进行分类。AOP的分类基于表S2。每个富集的AOP都被分配一个PODAOP，计算方法为PODKE的几何平均值，每个样本的BDC基于PODAOP绘制。为了识别新的不良后果途径，使用R包aop 1.0.0将所有AOPs组合成一个AOP网络图（Burgoon，2015年），突出显示网络图中的相应KE，并筛查了途径网络中每个发育阶段的关键毒性分子机制。进一步分析了137Cs在不同发育阶段的有毒效应特征，比较了每个胚胎发育阶段和全暴露阶段的KE差异。此外，本研究的结果与浓度依赖性（cd途径）筛选标准进行了基准测试，在该标准下，至少有三个KE通过组学数据在途径上被识别，并且PODKE值从MIE到AO的顺序增加，表明途径被扰动（Pollesch等，2019年）。最后，使用AOP-helpFinder 3.0网络服务器（https://aop-helpfinder.u-paris-sciences.fr/，一个整合了人工智能和文本挖掘技术的平台）来评估不良后果途径网络（AOPN）内KER的强度（Jaylet等，2023年；Jensen等，2020年）。作为一种半自动的文献检索工具，它系统地分析科学文献，评估压力事件和相关证据，实施自动化的证据权重评估，并优先考虑AOP发展中的关键事件。为了确保全面筛选，我们将选定的关键AOPN相关术语和替代项（子类别）提交给AOP-helpFinder。该平台使用单侧Fisher精确概率测试计算置信分数，以识别统计上显著的压力事件-AOP事件和事件组合（Jaylet等，2023年）。

2.7. 数据分析
所有数据均以平均值±标准差的形式呈现。使用GraphPad Prism 10（GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州拉霍亚）进行单因素方差分析（ANOVA），以确定每个暴露组与对照组之间的差异。统计显著性设定为*p<0.05和**p<0.01。使用OriginPro 2025（OriginLab，美国马萨诸塞州北安普顿）创建Sankey图。使用“msigdbr”、“aop”和“igraph”R包（https://www.r-project.org/）分别对AOP网络图数据进行了整合和可视化。

2. 结果与讨论
3.1. 阶段特异性毒性和初始转录组筛查
对斑马鱼胚胎的急性毒性评估显示，即使在120,000 Bq/L的活性浓度下，S1、S2和S3组之间也没有统计学上的显著差异（图2A）。然而，在S4组中，活性浓度增加到4800 Bq/L时，斑马鱼胚胎的死亡率显著增加（p<0.05）（图2A）。随后在最大浓度120,000 Bq/L下进行了浓度依赖性的转录组分析，该浓度在六个浓度组中稀释了五倍。高纯度锗伽马光谱仪的实际放射性测量结果见支持信息（文本S2）。

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图2. 在48小时后观察到137Cs对斑马鱼胚胎的毒性。计算了生存百分比（A）和异常百分比（B），每种颜色代表不同的暴露时间：S1从2 hpf到10 hpf，S2从10 hpf到24 hpf，S3从24 hpf到48 hpf，S4从2 hpf到48 hpf。图像（C）至（H）是在24000 Bq/L的浓度下拍摄的。图像（C）和（F）代表对照组，而（D）、（E）、（G）和（H）分别对应S1、S2、S3和S4组。红色箭头表示卵黄畸形。
对斑马鱼的形态观察显示，S1和S2组中的胚胎畸形很少，各浓度组之间没有统计学上的显著差异（图2B）。然而，在S3和S4组中，随着活性浓度的增加，胚胎畸形的发病率也随之增加。具体来说，在S3组中，970 Bq/L时观察到显著的胚胎畸形（p<0.05），而在S4组中，194 Bq/L时观察到显著畸形（p<0.05）（图2B）。S3组的无效应浓度（NOEC）为200 Bq/L，S4组为40 Bq/L。在S3和S4组的较低活性浓度（<1000 Bq/L）下，主要的畸形是卵黄囊异常（图S2），其特征是卵黄囊吸收异常导致尾部凹陷。进一步比较分析斑马鱼卵黄异常（图2C至H）显示S3组和早期发育阶段之间存在明显的形态差异。Gagnaire等人报告称，伽马射线增加了斑马鱼胚胎的整体代谢，导致卵黄囊蛋白直径减小（Gagnaire等，2015年）。除了卵黄囊异常外，在高浓度组S3和S4中还观察到未孵化胚胎的脊柱弯曲和严重畸形（图S3），在伽马射线照射的斑马鱼胚胎中也发现了类似的结果（Gagnaire等，2015年）。此外，137Cs对斑马鱼胚胎的心率影响很小（图S4），这与先前的研究结果一致，即低剂量伽马辐射不会显著改变心率（Zhao等，2019年）。
为了进一步阐明137Cs暴露影响斑马鱼胚胎发育的阶段特异性机制，对样本的转录组进行了测序。从测序数据得出的主成分分析（PCA）图显示了满意的样本分类，从而可以进行后续的差异基因分析（图3A）。差异基因表达分析的结果（图3B，表S3至S6）显示，在S1、S2、S3和S4组中，S4组的DEGs数量最多（11,114个），其次是S3组（9,984个DEGs），S2和S1组的数量最少，分别为7,053个和7,097个。关于浓度依赖性转录组筛查识别的敏感基因的详细信息见支持信息（文本S3）。

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图3. 137Cs暴露对斑马鱼胚胎生物途径影响的浓度依赖性组学分析。(A) 显示了来自转录组测序的PCA结果，不同颜色表示不同的样本。(B) 显示了每个样本中差异表达基因的数量，不同的绿色阴影代表不同的浓度依赖性拟合曲线：S代表S型拟合，L代表线性拟合，U代表U型拟合。(C) 和 (D) 显示了四个样本的PODGO生物效力分布曲线，其中(C) 按PODGO顺序百分比排列，(D) 按PODGO顺序排列。(E) 列出了每个样本中 Posteriority-ranking最高的五个GO术语，以及效应水平和DEGs的数量。
途径分析显示，S1、S2、S3和S4组的敏感基因中分别富集了303、303、437和478个基因本体（GO）术语。使用PODGO计算了每个样本的总体生物效力分布曲线。首先，在Y轴上绘制了传统的PODGO排名百分比（图3C），并评估了第20百分位的POD（称为PODGO20）（Fang等，2020年；Peng等，2019年）。结果表明，S1的总体生物效应最大（PODGO20=674.5 Bq/L），其次是S3和S4，其PODGO20值分别为1006.9 Bq/L和1135.0 Bq/L，而S2的总体生物效力最低（PODGO20=1737.8 Bq/L）。鉴于GO样本数量的显著差异，使用传统的评估方法（将PODGO排名百分比作为Y轴）可能会低估具有更多GO术语的样本。因此，本研究改进了评估方法，使用POD的排名作为Y轴，以第20名的POD作为基准（图3D）。改进后的分析表明，S1、S3和S4的总体生物效力较高，其第20名的PODGO值分别为403.2 Bq/L、449.2 Bq/L和370.1 Bq/L。S2的总体生物效力最低，其第20名的PODGO值为854.5 Bq/L。
基于每个样本的PODGO分析前五个GO术语（图3E）显示，四个样本组的启动反应途径与基因损伤有关。在S1样本中，前五个富集的GO术语中有三个与DNA损伤修复相关：“双链断裂修复通过断裂诱导的复制”（GO:0000727）、“单链DNA解旋酶活性”（GO:0017116）和“含有核碱基的复合激酶活性”（GO:0019205）。此外，与DNA损伤修复相关的生物途径，如“RNA 7-甲基鸟苷帽结合”（GO:0000340）、“cAMP依赖性蛋白激酶活性”（GO:0004691）和“mRNA 5′-UTR结合”（GO:0048027）也在S2、S3和S4样本中富集。这些发现表明，虽然基因损伤是所有阶段的共同分子启动事件（MIE），但观察到的形态毒性（图2B）和定量生物效力（图3D）的变化需要更深入的AOP水平分析来机制上阐明阶段特定的不良后果。

3.2. 定量AOP水平比较和阶段依赖性效力
3.2.1. 阶段依赖的关键事件分布
为了将大量浓度依赖性数据整合为可访问的结果，我们的分析采用了基于起点（POD）的层次化定量方法，分为四个层次：基因、途径（GO & KEGG）、关键事件（KE）和不良后果途径（AOP）（表1）。具体来说，我们将这些指标整合为三个关键的可视化结果进行阶段依赖性比较：(1) 图3D中的系统范围效力（PODGO），用于表征总体生物影响；(2) Sankey图（图4C）中的机制分布（PODKE），用于说明不同浓度水平下的敏感事件分布；以及(3) 图5C中的AOP终点（PODAOP），用于提供最高层次的、特定机制的定量比较。

表1. 起点（POD）推导的层次结构框架：定义、计算和不同生物尺度上的毒理学目标。
生物学水平
POD类型
含义
计算方法
毒理学目标
GenePODgene
触发单个基因显著变化的最小阈值浓度。S形模型：达到最大效应50%的浓度；2. 线性模型：达到绝对变化1.5倍的浓度；3. U形模型：对应于第一个单调段内绝对变化1.5倍的浓度。鉴定高敏感性的分子标记物。
途径POD（PODGO/PODKEGG）：特定生物途径或分子功能受到干扰的效力。该途径内差异表达基因（DEGs）的POD基因值的几何平均值（GO或KEGG途径必须包含超过3个匹配基因）。评估各种生物过程的相对效力；用于构建生物效力分布曲线（BDC）以表征整体生物效力。
关键事件（KE）：通过POD途径值分配给相应关键事件（KE）的响应浓度（例如，PODGO、PODKEGG等）。量化机制分布，显示敏感事件的浓度水平分布。
不良后果途径（AOP）：测量富集AOP效力的定量指标。AOP内所有关键事件点（PODKE）的几何平均值。提供最高级别的、特定于机制的定量比较（AOP终点）；用于风险评估和阐明特定阶段的毒性机制。

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图4. 随着137Cs暴露，斑马鱼胚胎中富集的分子启动事件（MIEs）、关键事件（KEs）和不良后果（AOs）的数量及其相关不良后果途径（AOPs）如下详述。(A) 显示了每个样本中富集的MIEs、KEs和AOs的数量，其中PODKE值超过1000 Bq/L的以绿色突出显示，低于或等于1000 Bq/L的以黄色突出显示。(B) 文氏图说明了样本S1至S4中富集的事件。(C) 表示每个样本中AOPs的数量可能受到干扰，不同颜色代表在AOPs中富集的事件数量。(D) S4中富集的MIEs、KEs和AOs的桑基图，描绘了它们之间的生物学水平（分子、细胞、组织、器官和个体）关系、事件的作用以及潜在的相关终点。

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图5. 研究了137Cs诱导的斑马鱼胚胎中的潜在AOP相关终点。此处使用的AOPs至少包含三个激活事件。(A) 每个样本中AOP相关终点的类型和数量。黄色表示在相关有害终点中富集的AOPs数量较多，而深蓝色表示在这些终点中富集的AOPs较少；灰色表示没有AOP在相关有害终点中富集。(B) 每个样本中AOP相关终点类型的比例，不同颜色代表各种类型的有害终点。(C) 和 (D) 四个样本的PODAOP生物效力分布曲线。(D) 前十个AOP及其相关有害终点类型。
为了确定每个样本中的MIE、KE和AO富集情况，根据AOP-Wiki（https://aopwiki.org/info_pages/5）中列出的关键事件成分，识别了每个事件的相应生物途径（表S7至S10）。研究结果显示，样本S1、S2、S3和S4分别富集了64、72、72和95个事件，其中20、3、5和22个事件的POD低于规定的1000 Bq/L阈值（图4A）。此外，KEs分别占S1、S2、S3和S4中总富集事件的68.78%、69.44%、65.28%和73.68%。其次是MIEs和AOs，分别占所有事件的11.58%-25.00%和7.81%-9.73%。样本中还包含少量未定义的事件，占总事件的7.81%-10.53%。为了进一步分析每个样本中富集事件之间的相互关系，进行了文氏图分析，发现了四个样本之间有15个重叠事件（图4B），其中五个与甲状腺激素干扰有关。这些包括“活性碘化物掺入碘代酪氨酸”、“脱碘酶2的抑制”、“脱碘酶1的抑制”和“脱碘酶3的抑制”。Bebeshko和Bobyliova（2002）对切尔诺贝利灾难影响的各种群体的健康状况进行了15年的监测，并报告称撤离人员的甲状腺癌发病率是乌克兰全国平均水平的五到六倍，这表明137Cs可能干扰甲状腺激素水平。

为了全面了解样本内的事件分布，通过检查其组织结构、作用、效应浓度水平和相关终点（表S11-14）对具有两个以上激活生物途径的AOPs中的事件进行了整理，以构建桑基图。桑基图（图4C和S6）表明，浓度依赖性转录组中的主要富集事件主要集中在分子和细胞水平（S1至S4的事件比例从60.0%到67.4%）。这归因于浓度依赖性转录组捕捉早期分子反应的能力。此外，这项研究根据响应事件引起的有害终点信息对事件进行了分类。桑基图（图4C和S6）的结果表明，肿瘤相关事件在样本S2、S3和S4中最普遍，分别占事件的38.3%、57.8%和18.4%。肾损伤、肝损伤和神经损伤在S1样本中更为常见，分别占21.2%、21.1%和13.6%。桑基图的多层次链接分析表明，尽管MIE在S1、S2、S3和S4中分别仅占总事件的18.7%、5.6%、20.8%和5.9%，但MIE终点的类型有些聚集。例如，S1样本中40%的MIE与肾损伤疾病相关，21.8%与癌症肿瘤相关。在S3样本中，与DNA损伤和肿瘤相关的MIE占总MIE的76.7%。同时，效应浓度和终点的进一步链接分析显示，低浓度响应的关键事件与MIE高度相似。在S1样本中，响应浓度低于1000 Bq/L的事件中有36.3%与肾损伤疾病相关，22.3%与肿瘤相关。值得注意的是，S1中90%的与肾损伤疾病相关的事件对应于浓度低于1000 Bq/L。此外，在S1中，1000 Bq/L以下的响应中，100%和70%的事件分别与癌症和神经损伤相关。同样，在S3样本中，DNA损伤和肿瘤相关事件占响应浓度低于1000 Bq/L的事件的100%。在S4样本中，与神经毒性相关的事件在响应浓度低于1000 Bq/L的事件中占比最高（38.7%）。

3.2.2 AOP终点和定量效力
鉴于上述富集事件，本研究最初对AOPwiki网站上的可用AOP信息进行了对齐，以量化样本S1、S2、S3和S4中可能富集的已知AOP的数量以及在这些AOP中发生反应的事件数量（图4D）。结果显示，S1、S2、S3和S4中分别富集了125、87、84和132个AOP。其中，34、27、24和47个AOP表现出两个或更多事件的响应，分别占总AOP的27.2%、31.0%、28.6%和35.6%。这些定量发现表明，早期原肠期和完全暴露阶段是慢性不良后果的最高风险窗口，强调了需要针对特定阶段进行调控的必要性。
为了进一步阐明137Cs暴露对现有AOP的影响，本研究分析了所有样本中具有两个或更多响应事件的AOP。首先，将每个样本匹配的AOP类型（表S15至S18）分为十个不同的组：肾损伤、生殖损伤、肝损伤、神经毒性、肿瘤、死亡、DNA损伤和异常、免疫干扰、心血管疾病等。根据这种分类方法（图5A），全阶段暴露样本S4包含了所有类型的AOP，其中与神经毒性、生殖损伤、肝损伤和肿瘤相关的AOP数量最多，每种超过九个。除了S4之外，没有其他样本包含所有类型的AOP，且根据斑马鱼暴露于137Cs的发育阶段不同，AOP的类型和数量也有差异。样本S1在胚胎发育初期（前肠阶段）暴露，包含了八种类型的AOP，仅次于样本S4（图5A）。S1中最常见的AOP是生殖损伤、肾损伤和急性死亡（图5B）。S2组处于胚胎发育的第二阶段（分割阶段），显示出七种类型的AOP（图5A），肿瘤发生率和急性死亡率较高（图5B）。S3组在胚胎发育的最后阶段（孵化期）观察到的AOP类型最少，只有六种（图5A）。S3中最常见的AOP是肿瘤和生殖损伤（图5B）。这些发现表明137Cs对胚胎在不同发育阶段的有害效应和途径存在差异，尽管其诱导斑马鱼肿瘤发生的生物学过程在整个胚胎发育过程中持续存在。多项研究表明，137Cs伽马射线以剂量依赖的方式在小鼠中诱导肿瘤发生，包括低剂量暴露下多个原发性肿瘤数量增加的报告（Sasaki和Fukuda，1999；Tanaka等人，2007）。
此外，使用PODAOP效应曲线对每个样本中的敏感AOP和特定途径进行了定量评估。PODAOP效应曲线（图5C）表明，样本S1和S4的AOP总体生物效力高于样本S3和S2。进一步分析前十个AOP发现，所有样本均与肿瘤和生殖损伤相关的AOP相关（图5D）。值得注意的是，S1和S4在暴露于500 Bq/L 137Cs后可能有更高的癌症风险，相关的AOP分别是“HPPD抑制导致角膜乳头瘤和癌（AOP id: 114）”和“琥珀酸脱氢酶失活通过缺氧类似机制导致癌症（AOP id: 546）”。此外，S3和S2分别在1200 Bq/L和2650 Bq/L时与癌症相关的AOP相关，即“PPARalpha激活导致胰腺腺泡肿瘤（AOP id: 166）”和“AhR激活导致转移性乳腺癌（AOP id: 439）”。尽管文献中没有直接证据表明137Cs通过上述AOP导致癌症（AOP id: 166和AOP id: 439），但文献确实表明137Cs有可能激活这些途径。例如，AOP id: 546的MIE是“琥珀酸脱氢酶抑制”，文献表明137Cs在6 cGy/h的剂量率下会抑制Tetrahymena pyriformis中的琥珀酸脱氢酶活性（Ziyadi等人，2022）。此外，Aykin-Burns等人（2011）报告称，琥珀酸脱氢酶的缺失可能通过突变编码琥珀酸脱氢酶亚基C的基因导致仓鼠成纤维细胞中的离子辐射诱导的线粒体O2代谢紊乱。此外，对于AOP id 166，有证据表明伽马射线可以增加细胞中的PPARα水平（Lee等人，2017），实验数据表明胰腺可能是对辐射高度敏感的器官之一（Gemici等人，2018）。关于AOP id: 439，AhR途径的抑制可以减少小鼠中的辐射诱导的造血系统损伤（Zhou等人，2021）。
在生殖功能障碍的背景下，S1和S2与“芳香化酶抑制导致生殖功能障碍（AOP id: 25）”和“环氧化酶抑制通过干扰减数分裂前期/中期过渡导致生殖功能障碍（AOP id: 102）”在活性浓度低于1000 Bq/L时对齐。S3对应于“雄激素受体激动导致生殖功能障碍（在斑马鱼中）（AOP id: 496）”在1280 Bq/L时，而S4与“AhR激活导致先兆子痫（AOP id: 151）”在3325 Bq/L时相关。最近的研究表明，水生环境中的放射性物质会对鱼类繁殖产生不利影响。例如，在切尔诺贝利核电站（CNPP）附近受放射性核素污染的水域中，鱼类生殖腺异常的程度与水质污染程度呈正相关（Belova等人，2007）。此外，神经毒性相关的AOP仅在S1和S4阶段观察到，这两个阶段都位列PODAOP的前十名。这些发现表明，即使在活性水平低于700 Bq/L的情况下，137Cs也会影响与斑马鱼胚胎神经元功能相关的通路，尽管其對神经元的影响随着胚胎的发育而减弱。先前的研究已经表明，伽马射线暴露会损害幼年斑马鱼的神经传输，从而影响它们的运动能力（Gagnaire等人，2015年）。此外，Sakaguchi等人（2018年）在小鼠中的实验发现表明，137Cs对不同生长阶段的神经元细胞有不同的影响。对不同年龄（辐射后6-7周）的小鼠神经前体细胞（NSPCs）中DNA双链断裂（DSBs）发生率的评估显示，新生小鼠在出生后三天内的DSBs出现率最高，是成年小鼠的2.5倍。S1和S4阶段的选择性敏感性表明，胚泡期（S1）的高细胞增殖和快速神经发生使得发育中的神经系统即使在低浓度下也特别容易受到Complex I抑制的影响。

3.3. 智利特定不良结果通路（AOPs）的阐明
为了研究阶段特定的毒性并识别关键的AOP信息机制，将S1至S3组的AOP网络图与全阶段暴露（S4）进行了定量比较。这种比较方法通过明确哪些发育阶段导致在S4样本中观察到的效应，从而提高了准确性。如图6A所示，S1中的10个AOP与S4中的至少两个事件重叠，包括神经毒性、生殖损伤、肾脏损伤、肝脏损伤、免疫毒性、心血管疾病、死亡和发育畸形等毒性终点。在S2中，12个AOP与S4中的事件重叠（图6B），包括生殖损伤、肝脏损伤、免疫毒性、遗传毒性、心血管疾病、死亡和发育畸形等毒性终点。在S3中，有9个AOP与S4中的事件重叠，涉及毒性终点（图6C），如肝脏损伤、免疫毒性、心血管疾病、死亡和发育畸形以及肿瘤。为了更深入地了解机制，我们重点关注了所有阶段都共有的AOP——肝脏损伤和肾癌——以阐明这些通路中的关键阶段特定事件（KE）激活模式。

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图6. 比较斑马鱼胚胎（S1至S3）在三个典型发育阶段暴露于137Cs后的不良结果通路（AOP）网络与全阶段暴露（S4）网络，并识别关键AOP框架。（A）以S1样本为例，描述了137Cs干扰的关键AOP框架的提取过程。首先绘制了S1和S4 AOP网络的复合图，然后提取了S1和S4重叠事件的网络图，最后确定了关键AOP框架。（B）和（C）分别是由S2和S3与S4重叠事件提取的网络图。在AOP网络图中，绿色圆圈代表分子起始事件（MIEs），橙色圆圈代表不良结果事件（AOs），白色圆圈代表关键事件（KEs），浅紫色圆圈分别代表S1、S2和S3中的富集事件，浅黄色圆圈代表两个样本中都有的富集事件。此外，每个样本中潜在的AOP相关终点用不同的颜色标出，每个终点至少有两个相关事件被激活。

肝脏损伤AOP的具体通路（图7A）如下：DHB4/HSD17B4比率的降低（事件ID：482）导致线粒体脂肪酸β-氧化的抑制（事件ID：451），进而导致脂肪酸的积累（事件ID：327）。这种积累随后增加了甘油三酯的形成（事件ID：454），最终导致脂肪肝（事件ID：459）。分子起始事件“DHB4/HSD17B4降低”和关键事件“甘油三酯形成增加”在所有四个样本组中都得到了富集。相比之下，关键事件“线粒体脂肪酸β-氧化的抑制”和“脂肪酸的积累”仅分别在S4和S1中富集。此外，所有样本中都一致的致癌AOP的具体细节如下：α2u微球蛋白的积累（近端肾小管上皮）（事件ID：708）导致肾小管细胞的细胞毒性增加（事件ID：709）。这种细胞毒性的增加又导致肾小管上皮细胞的再生细胞增殖增加（事件ID：710），进而导致肾小管细胞增生增加（事件ID：767），最终导致腺瘤/癌的发展（肾小管）（事件ID：713）。在癌症相关的AOP中，S4在所有相关事件中都得到富集；S1在“肾小管细胞细胞毒性增加”、“肾小管细胞增生增加”和“肾小管腺瘤/癌增加”事件中得到富集；S2仅在“肾小管上皮细胞再生细胞增殖增加”事件中得到富集；S3在“α2u微球蛋白积累增加”和“肾小管上皮细胞再生细胞增殖增加”事件中得到富集。

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图7. 展示了与肝脏损伤相关的不良结果通路（AOPs）中每个关键事件的起点（POD）值，以及压力源与每个关键事件之间的置信度水平。（A）图表展示了肝脏损伤相关AOP中事件之间的相互关系，以及从浓度依赖性组学计算得出的关键事件POD（PODKE）。（B）堆叠条形图显示了从AOP-helpFinder获得的关键词关系（KER）的引用数量和置信度分数（通过条形颜色表示）。图表区分了用作查询词的子类别，累积分数表示每个子类别中的唯一科学论文数量。图表的上部分描绘了压力源与关键事件之间的关系，下部分展示了关键事件之间的关系。在上部分，斜杠表示压力源关键词“辐射”，颜色块表示压力源关键词“伽马辐射”。每个子类别提供了“低”、“相对低”、“中等”、“高”和“非常高”的置信度水平。未被AOP-helpFinder识别的KER从图表中排除。（C）提供了用于构建图（B）的关键词列表。

为了确定这些事件与137Cs之间的关系，使用了AOP-helpFinder和Web of Science，输入了关键词“137Cs”和“辐射”，并使用了事件的核心术语。肝脏损伤相关的AOP显示在图7B和C中，AOP-helpfinder将辐射与事件ID 482关联起来，共有1799条参考文献支持这一假设，表明其置信度非常高。此外，事件ID 451与事件ID 327之间的关键事件关系（KER2）得到了10条参考文献的强烈支持。在癌症相关AOP的背景下，压力源与事件之间的关系分别在图S7B和C中展示。分析显示，辐射与事件ID 710和713的置信度非常高；KER3（事件ID 710到事件ID 767）和KER4（事件ID 767到事件ID 713）分别得到了26条和345条参考文献的强烈支持。此外，Web of Science的搜索结果显示，肝脏损伤AOP中的60%（3/5）事件有文献记录，上述癌症相关AOP事件中有80%（4/5）得到了文献的支持（表S19）。例如，在肝脏损伤AOP中，137Cs导致小鼠血清中脂肪酸β-氧化下调和甘油三酯水平升高（Goudarzi等人，2015年）。在切尔诺贝利事故期间遭受电离辐射并出现急性辐射病的男性中也观察到了甘油三酯水平升高（Chaialo等人，1991年），事故受害者的肝脏组织伴有显著的代谢紊乱和脂肪变性（Nosach等人，2021年）。此外，鲫鱼暴露于137Cs会导致肝脏局部脂肪变性（Vosniakos等人，1991年）。

在肾癌相关的AOP中，137Cs的伽马射线照射后，大鼠肾脏中的尿β2-微球蛋白增加了29.6%，肾小管上皮细胞的细胞间隙增大，一些上皮细胞肿胀并发生坏死（Gao等人，2003年），同时还伴随着显著的增生甚至肾肿瘤或肾细胞癌的转变（Kokubo等人，2010年）。

神经毒性AOP被确定为另一个关键通路，仅出现在S1和S4组中，涵盖了早期的胚泡发育期。具体的神经毒性相关AOP如下所述（图6A，图S8A）：抑制剂NADH-泛醌氧化还原酶（复合体I）的结合（事件ID：888）→ NADH-泛醌氧化还原酶（复合体I）的抑制（事件ID：887）→ 线粒体功能障碍（事件ID：177）→ 细胞损伤/死亡（事件ID：55）→ 神经退化（事件ID：352）。关键事件“NADH-泛醌氧化还原酶（复合体I）的抑制”和“细胞损伤/死亡的增加”在S1和S4中都得到富集。然而，分子起始事件“抑制剂NADH-泛醌氧化还原酶（复合体I）的结合”和不良结果“神经退化”仅在S1样本中得到富集。AOP-helpfinder表明，辐射的置信度非常高，事件ID 177和事件ID 352分别有724条和400条相关参考文献支持。此外，KER1（事件ID 888到事件ID 887）和KER5（事件ID 177到事件ID 352）分别得到了20条和413条相关参考文献的支持，显示出高置信度（图S8B&C）。进一步的文献回顾显示，神经毒性AOP中的80%（4/5）事件得到了文献的支持（表S19）。文献报告指出，暴露于辐射的细胞表现出NADH氧化酶（复合体I）活性降低，随后是线粒体功能障碍（Yoshida等人，2012年），并且未成熟神经元的神经突起发育受到显著损害（Bajinskis等人，2011年）。

值得注意的是，从样本S3中提取了一个遗传毒性AOP（图S9A），其通路如下：结合蛋白微管（事件ID：718）→ 微管解聚（事件ID：720）→ 星形体紊乱（事件ID：721）→ 减数染色体动力学改变（事件ID：752）→ 染色体数目改变（事件ID：723）→ 畸胎后代增加（事件ID：728）。通过浓度依赖性方式研究不同样本，得到了这一AOP信息机制（表S20至S23）。该遗传毒性AOP中有四个事件得到富集，包括MIE“结合蛋白微管”和KEs“微管解聚”、“减数染色体动力学改变”和“染色体数目改变”。数据显示，在斑马鱼暴露于1650.5 Bq/L的137Cs的孵化期间，激活了“结合蛋白微管”事件；在5021.1 Bq/L的活性浓度下，引发了染色体数目变化（图S9A）。图S9B&C中的数据表明，伽马辐射和事件ID 752在与畸胎后代增加相关的AOP中显示出高置信度。文献回顾显示，该AOP中的66.7%（4/6）事件已被报道（表S19）。一项研究表明，在10 Gy的伽马射线照射48小时后，60%的有丝分裂细胞显示出由多个极组成的异常纺锤体（Sato等人，2000年）。此外，在暴露于2 Gy的137Cs后，斑马鱼胚胎中的染色体动力学迅速下降，伴随染色体核型不完整和染色质内容物不规则（Asana Marican和Shen，2024年）。在孵化阶段（S3）中，遗传毒性AOP的独特富集可以归因于这一时期加速的器官发生和生长，此时微管功能和细胞分裂的准确性非常重要，使得S3阶段特别容易发生非整倍体诱导。

总之，本研究通过将浓度依赖性转录组学与AOP框架相结合，成功量化和机制化了137Cs在斑马鱼胚胎中的阶段特异性毒性。我们的发现表明，毒性和生物效应显著依赖于阶段，孵化（S3）和全周期（S4）阶段的胚胎在低于先前1000 Bq/L基线的活性浓度下对畸形的敏感性最大。此外，AOP网络分析使得能够独特识别出阶段特异性机制，例如仅在胚泡期和全周期（S1/S4）出现的神经毒性AOP，以及以微管结合和非整倍体为特征的遗传毒性AOP，这些在孵化阶段（S3）特别富集。这些关于阶段特异性机制差异的见解对于评估新规定的GB 6249–2025中30 Bq/L安全基准的适当性至关重要，表明环境风险评估必须考虑这些敏感的发育窗口。最终，该方法的高预测可靠性——其中60%的预测事件得到了文献的证实——凸显了基于组学信息的AOP（因果关系预测）方法在评估复杂放射性污染物方面的稳健性。尽管取得了这些进展，但这项研究仍存在某些局限性，特别是它依赖于浓度依赖性的转录组学来预测肝脏脂肪变性、肾癌、神经退行性和非整倍体的不良后果，而没有在生命后期进行暴露后的功能性或组织病理学验证。未来的研究有必要对这些研究中确定的特定AOP（例如神经系统、肝脏和泌尿生殖系统疾病）的长期、器官水平效应进行实证验证。

**作者贡献声明：**
- 方文迪：撰写、审阅与编辑；原始稿件的撰写；监督；方法论；资金筹集；正式分析；数据管理；概念思考。
- 姚佳：正式分析；数据管理。
- 万启林：方法论；数据管理。
- 冯清亮：方法论；数据管理。
- 王宇彤：方法论；数据管理。
- 曹少飞：撰写、审阅与编辑；监督；项目管理；方法论；概念思考。
- 夏普：撰写、审阅与编辑；方法论。