基于结构引导的亲和力成熟技术：用于金表面生物传感N端前B型利钠肽的抗体重片段

《ACS Omega》：Structure-Guided Affinity Maturation of an Antibody Fragment for Gold-Surface Biosensing of N-Terminal Pro-B-Type Natriuretic Peptide

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快速且特异性地检测 N-末端前 B 型利钠肽（NT-proBNP）对于改善心力衰竭的诊断至关重要。在这项研究中，设计了一种能够识别 NT-proBNP 的单链可变片段（scFv），并加入了一种金组装连接子（C12AP），通过亲和成熟处理来增强其在金表面生物传感应用中的结合性能。基于结构的 C12AP–NT-proBNP 复合物对接指导了针对 VH-CDR3 中的 D110 和 VL-CDR1 中的 Y174 残基的半理性突变。二十二种 scFv 变体在大肠杆菌中表达，并使用 NT-proBNP 作为分析物、人血清白蛋白作为特异性对照以及亲本 C12AP 作为标准化参考，通过 ELISA 进行功能筛选。其中八种变体被纯化用于定量生物物理评估。微尺度热泳实验表明，D110–57 变体相对于 C12AP 具有显著提高的亲和力（p = 0.0174）。与此结果一致的是，分子对接预测 D110–57 的结合自由能更优（-254 kcal·mol–1），而 C12AP 为 -209.6 kcal·mol–1，同时 VH-CDR2 和 VL-CDR3 之间还存在额外的稳定相互作用。分子动力学模拟证实了蛋白质-配体复合物的结构稳定性，C12AP 和 D110–57 系统在约 40 ns 后达到平衡。动态分析显示，关键残基（特别是 Asp110）发生了适应性氢键和盐桥重排，有助于稳定的配体结合。为了评估在生物传感器相关条件下的性能，使用富含组氨酸/丝氨酸的金组装连接子和 C-末端 His 标签进行了表面等离子体共振成像。D110–57 在金表面固定后表现出对 NT-proBNP 的浓度依赖性结合。动力学分析显示其 KD 值与亲本 C12AP 相当。此外，该变体保持了特异性，对其他利钠肽的交叉反应可忽略不计。这些结果表明，D110–57 结合了增强的亲和力、保留的特异性以及与金表面固定的兼容性，支持其作为 NT-proBNP 生物传感器的识别元件的应用。

**引言**
心力衰竭是一种复杂的心血管综合征，给全球医疗保健带来了巨大负担，并可能从慢性疾病发展为危及生命的急性失代偿。(1) 循环生物标志物在诊断中起着核心作用，大规模研究表明血浆中的 N-末端前 B 型利钠肽（NT-proBNP）对心力衰竭的检测具有高灵敏度和特异性。(2) 因此，当前的临床指南（包括欧洲心脏病学会 (ESC, 2021) 和美国心脏病学会/美国心脏协会 (ACC/AHA 2022) 的指南)(4) 建议将 NT-proBNP 检测作为出现呼吸困难患者的标准诊断工具。这些建议强调了将 NT-proBNP 检测整合到即时诊断平台中的必要性，以支持及时的临床决策。

NT-proBNP 生物传感器的性能在很大程度上取决于所使用的分子识别元件。已经研究了多种识别分子来检测 NT-proBNP，包括适配体、(5) 全长抗体和单链可变片段 (scFvs)。(6,7) 在这些中，scFvs 具有分子尺寸小、可重组生产以及易于蛋白质工程改造等优点。然而，从初始选择获得的抗体片段通常需要进一步的体外亲和成熟，以获得适合敏感和可靠生物传感应用的结合特性。

抗体亲和成熟可以通过几种模拟体细胞高突变的体外策略来实现，包括饱和突变、定点突变、互补决定区 (CDR) 步行、DNA 混合和抗体链混合。(8) 例如，Lee 等人(6) 在 NT-proBNP 特异性 scFv 的 CDR 内使用随机突变生成了一个次级文库，然后通过迭代生物淘选分离出具有改进结合亲和力的变体。

在我们之前的工作中，我们鉴定了一种 NT-proBNP 特异性的 scFv，并证明了其在与碱性磷酸酶 (AP) 在 C-末端融合后的电化学生物传感中的适用性。(7,9) 然而，AP 的存在为通过生物淘选进行进一步成熟过程带来了挑战。由于生物传感器的性能在很大程度上取决于识别元件的结合特性，亲和成熟仍然是提高抗体片段效能的关键步骤。

在本研究中，我们试图增强 NT-proBNP 特异性 scFv 的结合亲和力，同时使其能够整合到基于金的生物传感平台中。该 scFv 被设计了一种金组装连接子，以便在金表面上定向自组装。基于结构的分子对接被用来识别可能有助于抗原识别的残基，随后通过使用 NNK 密码子的半理性、结构引导的饱和突变进行多样化，然后进行功能筛选。使用酶联免疫吸附测定 (ELISA)、微尺度热泳 (MST) 和表面等离子体共振成像 (SPRi) 评估了所得变体的结合特性与亲本 C12AP scFv 的相对性能。总体而言，这项工作展示了一种针对临床心力衰竭诊断生物传感器的结构引导策略。

**结果与讨论**
**蛋白质结构预测和模型验证**
从先前工作中获得的 NT-proBNP 特异性 scFv 被设计了一种改良的连接子，以实现其在金表面上的自组装(10)，并作为亲和成熟 (C12AP) 的模板。为了支持对该工程结构的结构引导分析，使用 AlphaFold 3 预测了 scFv C12AP 和 NT-proBNP 的三维结构，并使用预测对齐误差 (PAE) 指标评估了模型的可靠性。scFv C12AP 的预测模型（图 1A，左侧）显示出高度稳定性，pTM 得分为 0.89。深蓝色突出显示的区域表明 X 轴和 Y 轴上的氨基酸位置之间存在强相关性。相反，绿色标记的区域表明相应的氨基酸位置可能存在预测错误或信心较低。值得注意的是，C12AP 模型在重链 (VH) 和轻链 (VL) 的可变域（分别位于残基位置 0–100 和 150–246）显示出高信心。这些域构成了 scFv 的核心结构，因为抗原结合位点是由 VH 和 VL 链的 CDRs 共同形成的，而不是单独由任一链形成的。(11)

**图 1**
(A) C12AP scFv（左侧）和 NT-proBNP（右侧）的预测对齐误差 (PAE) 图。深蓝色和绿色突出显示的区域分别表示大约 0–5 和 15–30 ? 的误差范围。(B) 目标蛋白 NT-proBNP 和 C12AP scFv 的分子对接模型。模型展示了 NT-proBNP（青色）与 C12AP 的关键残基之间的预测相互作用。盐桥和氢键分别用橙色和绿色虚线表示。数字表示相互作用的距离（以 ? 为单位）。

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预测的 NT-proBNP 结构（图 1A，右侧）在 N-末端（残基 0–15）和 C-末端（残基 60–75）区域显示出高信心区域，其中邻近残基的接触可能稳定了结构。相比之下，NT-proBNP 的中心区域的预测信心较低，导致整体结构可靠性中等，pTM 得分为 0.32。

NT-proBNP 与 C12AP scFv 的对接模拟（图 1B）在十个预测的构象中识别出能量最有利的复合物，计算出的结合能为 -209.6 kcal·mol–1（表 1）。预测 scFv 主要结合到 NT-proBNP 的 C-末端区域，对应于肽序列 EGIRGHRKMVLYTLRAPR（残基 59–76）。这一结合区域与我们之前的工作一致，在那项工作中，相同的肽被用作选择 NT-proBNP 特异性 scFv 的生物淘选目标。(7)

**表 1. 目标蛋白 NT-proBNP 与 C12AP scFv 之间的相互作用**
| 互补决定区 | 相互作用类型 | 氨基酸残基 (C12AP scFv) | 距离 [?] | 氨基酸残基 (NT-proBNP) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| VH-CDR3 | 盐桥 | ASP 110 [OD1] | 2.77 | ARG 62 [NH1] |
| VH-CDR3 | 盐桥 | ASP 110 [OD1] | 2.78 | ARG 62 [NH2] |
| VH-CDR3 | 盐桥 | ASP 110 [OD2] | 3.54 | ARG 62 [NE] |
| VH-CDR3 | 盐桥 | ASP 110 [OD2] | 2.90 | ARG 62 [NH1] |
| VH-CDR3 | 盐桥 | ASP 110 [OD2] | 2.91 | ARG 62 [NH2] |
| VH-CDR3 | 氢键 | ASN 106 [O] | 1.95 | ARG 65 [HH11] |
| VH-CDR3 | 氢键 | ASN 106 [O] | 2.01 | ARG 65 [HH21] |
| VH-CDR3 | 氢键 | ASP 110 [OD1] | 1.93 | ARG 62 [HH11] |
| VH-CDR3 | 氢键 | ASP 110 [OD1] | 1.93 | ARG 62 [HH21] |
| VL-CDR3 | 氢键 | TYR 174 [OH] | 1.68 | LYS 66 [HZ2] |

**a** 氨基酸侧链上功能基团的缩写定义如下：OD1 和 OD2：羧酸基团，NH1、NH2 和 NE：胍基团，OG：酚环上的羟基，NZ 和 HZ2：伯胺基团，HH11、HH12 和 HH21：侧链上的氢原子，O：酰胺基团上的氧原子。

结合界面的分析显示，scFv 受体位点内的关键残基参与其中，包括位于 VH-CDR3 环中的 ASN106 (N106) 和 ASP110 (D110)，以及位于 VL-CDR1 环中的 TYR174 (Y174)。这种相互作用通过盐桥和氢键得到稳定。基于这些结构洞察，随后针对 D110 和 Y174 进行了半理性突变，以增强 C12AP scFv 的结合亲和力。

**C12AP 的半理性突变**
已经开发了几种用于抗原结合分子亲和成熟的策略。然而，高度激进的随机化方法（如抗体链混合）可能会引入重大风险。这些方法可能导致表位漂移，从而改变结合特异性，导致生物活性降低或消失，而不是亲和力提高。(12) 此外，对整个 VH 或 VL 结构域的无差别突变可能会干扰与抗原识别无关的结构区域，产生结合性能差且不适合下游应用的不稳定变体。(13) 在计算机对接预测的指导下，设计了针对 C12AP scFv CDR 内的 D110 和 Y174 残基的简并引物。这些引物与低保真度 Taq DNA 聚合酶一起使用，生成了大小为 7541 bp 的质粒变体。然后将这些半理性突变的质粒转化到大肠杆菌 DH5α 中，分别获得了 76 个 D110 突变克隆和 36 个 Y174 突变克隆。

DNA 测序确认了相对于亲本 C12AP 序列的突变存在。应用生物信息学过滤排除了有缺陷的构建体，只保留了包含完整 VH 和 VL 编码区域的克隆以进行进一步分析。结果，从 D110 和 Y174 文库中分别获得了 18 个和 8 个有效的突变克隆。序列分析显示，尽管突变是定向的，但偶尔会在目标残基之外检测到额外的突变，包括在其他 CDR、框架区域 (FW) 甚至碱性磷酸酶 (AP) 融合域内。二次突变的发生与 PCR 相关的序列变异性和抗体亲和成熟过程中的上位效应一致。值得注意的是，之前已有报道指出 AP 的融合可以增强 scFv 的表达产量和亲和力，(7) 因此保留了 AP 区域内的突变进行评估。在大肠杆菌 BL21 中诱导蛋白质表达后，D110 文库中的 15 个克隆和 Y174 文库中的 7 个克隆成功产生了可检测的 scFv 蛋白。其余克隆未表达可能是由于影响调控元件或 scFv–AP 编码序列测序未捕获的不可翻译区域的突变所致。

根据表达结果，共选择了 22 个 scFv 变体进行主要的 ELISA 功能筛选。这些变体中的具体氨基酸替换和突变位点总结在表 2 中。

**表 2. 半理性突变 scFv 克隆的氨基酸序列和突变位点**
| VH | VL | 克隆 |
| --- | --- | --- |
| FW1 | CDR1 | D110–1 |
| FW2 | CDR1 | D110–2 |
| FW2 | CDR1 | D110–6 | A72 |
| TD110 | WG154 | R |
| FW1 | CDR1 | D110–12 | L22 |
| P | D110 | R |
| FW2 | CDR1 | D110–17 | D110 V |
| FW2 | CDR1 | D110–24 | D110 |
| E | S403 | F, G572 |
| TD110 | D110–39 | D |
| D110 | S | D110–40 | V82 |
| AD110 | A | I534 |
| TD110 | D110–47 | Q43 |
| R | D110–55 | M36 |
| V | D110 | R |
| FW1 | CDR1 | D110–57 | P65 |
| S | D110–63 | D110 |
| S | D110 | P188 |
| L | P434 |
| LD110 | CDR1 | D110–66 | D110 |
| A | V522 |
| AD110 | D110–72 | V38 |
| A | D110 K | L716 |
| QD110 | D110–74 | D110 |
| G | Y174–8 | S142 |
| G | G322 |
| R, A323 | CY174–10 | Y174L |
| D689 |
| GY174–18 | A277 |
| C, R278 | S, R279 |
| P, L280 | V |
| Y174–23 | K248 |
| ED270 | E, L280 |
| F, Q284 |
| E, T285 |
| E, L288 |
| RY174–24 | R103 |
| H | Y174E | S293 |
| T, D294 |
| EY174–26 | R103 |
| H | Y174E | Y174–31 |
| Y174W | L292 |
| F, N299 | K, I300 |

**初步基于 ELISA 的结合筛选**
最初使用 ELISA 筛选了 22 个 scFv 变体的粗溶提取物，以评估其与 NT-proBNP 相对于人血清白蛋白 (HSA) 的结合情况。对于每个变体，计算了结合比率 A450(NT-proBNP)/A450(HSA)，然后将其标准化到亲本 C12AP scFv，其值被设定为 1.0。如图 2A 所示，四个变体——D110–55、D110–57、Y174–18 和 Y174–26——显示出比 C12AP 更高的标准化结合比率，表明其对 NT-proBNP 的特异性增强。

**图 2**
ELISA 结果显示，scFv 变体与 NT-proBNP 的结合情况（A）IPTG 诱导的克隆和（B）非诱导的克隆。对于每个变体，计算了结合比率 A450 (NT-proBNP)/A450 (HSA)，并相对于 C12AP 控制进行了标准化。适用的情况下，使用单因素方差分析 (ANOVA) 和 Dunnett 的事后检验评估了与 C12AP 的显著性，p 值分别为 < 0.5 (*), 0.01 (**) 和 0.0001 (****)。

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由于在 ELISA 板上固定抗原可能会掩盖构象表位并引入筛选偏差，因此根据它们的替换性质和位置选择了额外的变体进行进一步考虑。这些变体包括携带电荷改变 (D110–1)、极性 (D110–39)、非极性 (D110–40) 和框架区域 (D110–47) 突变的变体，以捕获更广泛的机制信息序列变化。为了排除来自宿主蛋白的潜在检测伪影，还使用非诱导的大肠杆菌裂解物评估了选定的变体和亲本 C12AP。如图2B所示，所有非诱导样本的结合信号均未超过C12AP参考值，这证实了在诱导样本中观察到的增强反应是由于表达的scFv蛋白而非背景成分所致。基于ELISA筛选结果，共选择了八种scFv变体——D110–1、D110–39、D110–40、D110–47、D110–55、D110–57、Y174–18和Y174–26进行表达和纯化。随后对这些变体进行了详细的生物物理特性分析，以评估它们与NT-proBNP在溶液中的结合相互作用。

使用微尺度热泳（MST）进行结合亲和力分析
为了精确比较结合亲和力，采用MST方法确定了这八种纯化的scFv变体及其亲本C12AP与NT-proBNP的平衡解离常数（KD）。所得亲和力值总结在表3中。在评估的变体中，只有D110–57的结合亲和力与C12AP相比显示出统计学上的显著提高（p = 0.0174），表明这种替换在溶液相条件下增强了NT-proBNP的识别能力。相比之下，表达产率分析显示只有D110–39的产率与C12AP相比有统计学上的显著降低（p = 0.0301），而其他变体没有显著差异。

表3. 通过MST测定的scFv与NT-proBNP的结合亲和力
a, b
scFv KD (nM) 信心区间
C12AP 31.7 15.9–63.4
D110–1 36.3 15.0–87.6
D110–39 18.7 7.7–45.5
D110–40 22.6 10.3–49.6
D110–47 26.8 16.6–43.4
D110–55 21.8 11.0–43.0
D110–57* 12.0* 5.0–27.0
Y174–18 20.7 9.5–44.9
Y174–26 26.2 12.1–56.9
a 表中总结了重复实验的平均解离常数（KD）值及其相应的信心区间。
b 与C12AP的统计学显著差异（p = 0.0174）用星号（*）表示。

图3显示了C12AP和D110–57变体的代表性MST剂量-反应曲线。D110–57的曲线相对于C12AP向左移动，表明达到半最大结合所需的浓度降低，因此KD值也较低。为了进一步阐明亲和力提高的分子基础，随后使用基于结构的分子对接技术研究了D110–57的结合模式。

图3. NT-proBNP与scFv之间的剂量-反应曲线。C12AP（A）和D110–57（B）的标准化荧光（Fnorm）与NT-proBNP的浓度作图。每个数据点代表三次独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。

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D110–57变体的蛋白质结构预测和模型验证
通过结构预测和分子对接研究了携带VH框架3区域突变的D110–57变体结合亲和力提高的结构基础。D110–57 scFv的预测三维结构显示出较高的整体信心，其pTM得分为0.88（图4A）。信心分布与亲本C12AP scFv非常相似，重链（VH；残基0–100）和轻链（VL；残基150–246）的可变域具有高度可靠性。

图4.
(A) D110–57 scFv的预测对齐误差（PAE）图。深蓝色和绿色突出显示的区域分别表示大约0–5 ?和15–30 ?的误差范围。
(B) 目标蛋白NT-proBNP与D110–57 scFv的分子对接模型。模型展示了NT-proBNP（青色）与D110–57的关键残基之间的预测相互作用。盐桥和氢键分别用橙色和绿色虚线表示。数字表示相互作用的距离（以?为单位）。

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NT-proBNP与D110–57变体的对接模拟显示了一个由电荷-电荷盐桥和氢键组合稳定的明确结合界面（图4B）。在十个预测的对接构象中，最有利构象的结合能为?254 kcal·mol–1（表4），低于C12AP–NT-proBNP复合体的计算值，表明预测的相互作用更强。

表4. 目标蛋白NT-proBNP与D110-57 scFv之间的相互作用
互补性决定区域
相互作用类型 氨基酸残基（scFv）距离 [?]
VH-CDR2 盐桥 电荷-电荷 ASP60 [OD1] 3.88
ARG62 [NE] ASP60 [OD1] 2.73
ARG62 [NH1] ASP58 [OD2] 2.69
ARG65 [NH1] H-键 ASP60 [OD1] 1.83
ARG62 [HH12] ASP58 [OD2] 1.78
ARG65 [HH12] VH-CDR3 盐桥 电荷-电荷 ASP110 [OD1] 2.56
LYS66 [NZ] ASP110 [OD2] 2.79
LYS66 [NZ] ASP111 [OD1] 2.78
ARG73 [NH1] ASP111 [OD2] 2.73
ARG73 [NH1] ASP111 [OD2] 2.81
ARG73 [NH2] H-键 ASP110 [OD2] 1.91
TYR70 [HH] VL-CDR3 H-键 SER239 [OG] 1.79

与亲本scFv一致，D110–57变体主要结合到NT-proBNP的C末端区域（残基59–76）。虽然VH-CDR3环中的关键残基ASP110和ASP111保持在结合界面，但D110–57模型还表明VH-CDR2环中的ASP58和ASP60以及VL-CDR3环中的SER239也参与了抗原结合（图4C）。这些额外的接触表明，D110–57中的框架突变诱导了微妙的构象重排，扩大了结合位点并增强了抗原识别能力。

框架突变在抗体可变域中的报道表明，它们通过间接调节CDR的结构和动态来增强抗原结合亲和力。(14?16) 在D110–57变体中，VH框架3区域第65位的非极性脯氨酸被极性丝氨酸取代，并未直接参与NT-proBNP的结合。相反，这种突变似乎促进了VH-CDR2和VL-CDR3环与NT-proBNP C末端区域的额外相互作用，导致预测的分子间接触数量增加（图4C）。这一观察结果与框架区域的主要作用一致，即它们主要作为结构支架，控制CDR环的方向、定位和构象灵活性，而不是直接与抗原结合。(11) 总体而言，这些发现支持框架突变可以通过重塑结合位点结构并增强结合亲和力来发挥上位效应，而不改变直接接触的残基。

为了进一步阐明MST中结合亲和力提高的分子基础，进行了分子动力学（MD）模拟。这种方法能够评估scFv–NT-proBNP复合体的结构稳定性和时间依赖的相互作用动态，超越了静态对接预测。使用均方根偏差（RMSD）分析在100 ns分子动力学模拟过程中评估了野生型C12AP scFv和突变体D110–57 scFv复合体与NT-proBNP的结构稳定性。如图5A和B所示，两个复合体在模拟的早期阶段都表现出RMSD的初始增加，这对应于从ClusPro 2.0获得的对接构象的结构松弛。

图5. 野生型C12AP scFv（A）和突变体D110–57 scFv（B）与NT-proBNP复合体的骨架RMSD曲线比较，平均值基于三次独立的100 ns分子动力学模拟。

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在这一平衡阶段之后，两个系统的RMSD值在大约40 ns后稳定下来，表明蛋白质-蛋白质复合体达到了构象平衡。此后的相对恒定RMSD曲线表明没有发生显著的结构偏差，证实了野生型和突变体复合体在模拟条件下的整体稳定性。进行了氢键和盐桥分析，以进一步研究scFv变体与NT-proBNP在稳定阶段（>40 ns）的分子间相互作用。在野生型C12AP scFv复合体中，观察到Asp110与Arg62形成了氢键，表明结合界面处有一个关键的稳定相互作用。相比之下，在突变体D110–57 scFv复合体中，Asp110与Tyr70形成了氢键，占据率为33.79%，表明由于突变导致相互作用模式发生了变化（如图6A和B所示）。除了氢键外，还检测到了盐桥相互作用（如图7A和B所示）。在野生型复合体中，Asp110与Arg62之间的盐桥距离为3.97 ± 0.98 ?。对于突变体系统，检测到Asp110与Lys66之间的盐桥距离为4.49 ± 1.27 ?，以及Asp111与Arg73之间的盐桥距离为7.18 ± 1.33 ?，这突出了结合界面内的电静力相互作用的重排。这些相互作用模式与ClusPro 2.0获得的初始分子对接预测一致，从而支持了对接结果的可靠性，并确认了分子动力学模拟期间关键结合相互作用的稳定性。

图6. 野生型C12AP和D110–57 scFv复合体与NT-proBNP之间的氢键相互作用比较。野生型显示Asp110–Arg62相互作用（A），而突变体显示Asp110–Tyr70氢键（B）。

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图7. 野生型C12AP和突变体D110–57 scFv复合体与NT-proBNP之间的盐桥相互作用比较。野生型显示Asp110–Arg62相互作用（A），而突变体显示了其他盐桥，包括Asp110–Lys66（B）和Asp111–Arg73（C）。

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表面等离子体共振成像（SPRi）
虽然MST在接近天然状态的自由溶液中提供了结合亲和力测量，但对于实际生物传感器应用来说，将识别元件固定化是必不可少的。众所周知，表面固定化会引入空间限制并改变结合动力学和亲和力。(17) 因此，在与生物传感器操作相关的条件下，使用SPRi评估了固定化的C12AP和优化后的D110–57变体的结合特性。scFv配体通过富含组氨酸和丝氨酸残基的工程连接子（18）以及AP结构域后的C末端His标签在SPRi传感器表面上自组装固定。随后的SPRi测量显示NT-proBNP对固定化的C12AP和D110–57的结合反应依赖于浓度，传感器图中观察到了明确的结合和解离阶段（图8）。从传感器图的全局拟合中得出的动力学参数总结在表5中。

表5. scFv变体与NT-proBNP结合的动力学参数
scFv ka (M–1s–1) kd (s–1) KD (M)
C12AP 1.757 ± 0.56 4 × 10^7 2.307 ± 0.206 (1.373 ± 0.290) × 10^–7
D110–57 2.466 ± 1.55 2 × 10^7 2.140 ± 0.121 (1.277 ± 1.051) × 10^–7

对D110–57与NT-proBNP结合的动力学分析得出KD值为127.7 ± 105.1 nM。在相同条件下，亲本C12AP scFv的KD值为137.3 ± 29.0 nM。尽管D110–57的ka值较高而kd值较低，但t检验分析显示这些差异没有统计学意义。总体而言，这些结果表明，金表面上的固定化并未显著改变D110–57相对于C12AP的结合能力。重要的是，D110–57 scFv在表面固定化后保持了特异性，因为其对C型利钠肽（CNP）和A型利钠肽（ANP）的结合反应最小。在特异性测定中，无法在测试的浓度范围内可靠地估计CNP和ANP的最大结合反应（Rmax），进一步表明其与NT-proBNP的相互作用可以忽略不计。总体而言，这些结果表明D110–57变体在固定化后仍保持亲和力和特异性，支持其作为NT-proBNP生物传感器开发识别元件的适用性。

C12AP和优化后的D110–57变体在MST中的KD值均低于SPRi的结果。这种差异可能反映了两种技术的不同测量环境。MST在溶液中测量结合，其中scFv分子与NT-proBNP自由相互作用，而SPRi在模拟生物传感器条件的金表面上固定后评估结合。在SPRi配置中，scFv通过位于AP融合下游的C末端His标签固定在金表面上，并且具有自组装能力的工程VH–VL连接子。尽管这种固定策略支持定向附着并保持表面上的结合活性，但几个表面相关因素可能会影响SPRi测量的结合行为，从而导致相对于MST观察到的较高表观KD值。表面限制可能限制了构象自由度并影响固定后的结合界面可及性。此外，由于该构建包含C末端AP融合，这个相对较大的结构域可能会影响表面相关的信号转导和局部结合行为。此外，固定的识别元件是一种相对较大的蛋白质（大约80 kDa），而NT-proBNP则是一种小得多的分析物；这种尺寸关系可能导致目标结合时的响应变化较小，并可能影响基于表面测量的表观亲和力。通过SPRi获得的表观KD值也比我们实验室之前使用OpenSPR测得的值高出约1.6倍。(7) 这种差异可能不仅反映了平台依赖性效应，还反映了两项研究中使用的不同固定策略。具体来说，在之前的OpenSPR研究中，C12AP是通过EDC/NHS偶联固定的，而在当前的SPRi研究中，它是直接自组装到金表面的。这种表面附着方式的差异可能会影响探针的方向、堆积密度以及结合界面的可及性，从而影响表观动力学参数和亲和力。总的来说，这些界面和空间因素可能导致了SPRi观察到的表观亲和力比MST弱。总体而言，这些结果表明，工程化的scFv构建体在固定在金表面上后仍然具有功能性，并支持其集成到基于金的生物传感器平台中的适用性。

结论

采用了一种结构引导的半理性亲和力成熟策略来优化用于生物传感器应用的NT-proBNP结合scFv。通过分子对接确定的靶向突变表明，D110–57变体是在MST分析中相对于亲本C12AP scFv表现出统计学上显著提高结合亲和力的唯一克隆。尽管突变是针对预测的结合残基进行的，但还观察到了额外的非位点突变，这与半理性定向进化是一致的。结构模拟表明，这种增强可能是由于VH框架的突变间接通过上位效应调节了CDR的结合，同时保持了原始的结合模式。分子动力学分析展示了复合物的结构稳定性，并揭示了涉及Asp110的相互作用切换，表明其作为维持配体结合的关键残基的适应性协调行为。重要的是，结果还表明，修改后的连接子scFv仍能在金表面上自组装并在模拟生物传感器条件下发挥作用以检测NT-proBNP。总体而言，这些发现证明了半理性设计和筛选工作流程在识别功能性scFv变体方面的有效性，而D110–57代表了一个有适度改进的候选者，适合进一步开发基于金的NT-proBNP生物传感器。

材料与方法

3D模型生成和蛋白质-蛋白质对接模拟

目标蛋白NT-proBNP以及scFv抗体（C12AP和D110–57变体）的三维结构是使用Web服务器AlphaFold 3及其默认参数从它们的氨基酸序列生成的。(19) 结构预测后，使用Web服务器ClusPro 2.0进行了蛋白质-蛋白质对接模拟，以模拟NT-proBNP与scFv变体之间的结合相互作用。(20) 模拟是通过指定scFv的CDRs并系统地随机搜索潜在的结合构象来指导的。从生成的模型簇中，基于ClusPro评分函数选择得分最高的模型，并使用分子图形程序PyMOL进行可视化。(21) 在分析结合界面的分子力之前，使用Notepad++手动准备了原始模型文件，将NT-proBNP标记为链“A”，将scFv标记为链“B”。然后将修改后的文件上传到PDBePISA服务器(22)，以获取接触表面上发生的键类型和相互作用，包括氢键、盐桥和疏水相互作用。

NT-proBNP的半理性突变

特定的C12AP scFv是从之前的工作中获得的(7)，并修改了连接子序列以实现其在金表面上的自组装。(10) 它被用作亲和力成熟的模板，称为C12AP。用于位点突变的退化引物为：D110─F: 5′-GGCTACTGGNNKGATGGTGAC-3′, R: 5′-CCAGTAGCCGTTAACGTCACG-3′; Y174─F: 5′-TTCACCGGTNNKAACCTGGTT-3′, R: 5′-ACCGGTGAAATCGCTGCTG-3′。PCR（50 ng C12AP, i-StarMAX II, 0.5 μM引物）在94 °C下运行3分钟；16个循环，每个循环包括94 °C 30秒、63.0 °C（D110）或61.3 °C（Y174）退火、72 °C 8分钟；然后是72 °C 8分钟。产物经过纯化(Wizard SV)，模板用DpnI消化(37 °C 30分钟；80 °C 5分钟)，连接(T4 DNA连接酶，22 °C 10分钟)，并转化到大肠杆菌DH5α（热休克）。在含有50 μg/μL卡那霉素的LB琼脂上选择转化体。携带C12AP (D110/Y174)变体的质粒被提取(PrimeWay)并使用T7启动子和终止子引物进行测序(Bionics)。

大肠杆菌BL21 (DE3)中的scFv变体表达

从scFv结构中没有终止子的克隆中提取的质粒通过热休克方法转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。在含有50 μg/mL卡那霉素和0.1% (w/v)葡萄糖的LB肉汤中，37 °C下培养16–18小时，制备含有预期pSANG14–3F/scFv质粒的起始菌落。将1% (v/v)的起始菌落转移到含有50 μg/mL卡那霉素和增加葡萄糖(1% w/v)的新鲜LB肉汤中，37 °C下培养约3小时或直到600 nm处的吸光度达到0.5–0.7。然后通过在4 °C下以7600g离心30分钟收集细胞沉淀，并将其重新悬浮在含有50 μg/mL卡那霉素和0.2 mM IPTG的相同体积的LB肉汤中。在16 °C、180 rpm下表达18小时。随后在4 °C下以7600g离心30分钟，收集过表达的细胞以进一步提取蛋白质。

使用ELISA进行NT-proBNP的亲和力筛选

从小规模表达的克隆D110–1、D110–2、D110–6、D110–12、D110–17、D110–24、D110–40、D110–47、D110–55、D110–57、D110–63、D110–66、D110–72、D110–74、Y174–8、Y174–10、Y174–18、Y174–23、Y174–24、Y174–26和Y174–31的细胞沉淀中收获细胞。通过超声处理裂解细胞，并通过离心获得可溶性组分。使用人血清白蛋白(HSA; Merck)作为阴性对照，通过ELISA评估粗可溶性蛋白质与NT-proBNP的结合。NT-proBNP是按照先前描述的方法在内部生产和纯化的。(23)

微孔板（96孔）用NT-proBNP或HSA以10 μg/mL的浓度在100 mM碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液(pH 9.6; 100 μL/孔)中涂覆三份，并在4 °C下孵育15–18小时。去除未结合的蛋白质，用PBS冲洗孔洞，然后用3% (w/v)脱脂牛奶在PBS中于37 °C下封闭1小时。用0.05% PBST冲洗孔洞三次。加入50 μL/孔的粗scFv样品并在37 °C下孵育2小时，然后用0.05% PBST冲洗三次。加入1:1000的anti-His标签一级抗体(1:1000 in PBS; 100 μL/孔)在37 °C下孵育1小时，再用0.05% PBST冲洗孔洞三次，接着加入1:1000的山羊抗小鼠IgG-HRP二级抗体(1:1000 in PBS)在37 °C下孵育1小时。最后用0.05% PBST冲洗一次，加入100 μL TMB底物，在室温下避光显色15–30分钟。通过100 μL 1 N HCl停止反应，并在450 nm处测量吸光度。

对于每个变体，结合比率通过ELISA吸光度值计算为R = A450 (NT-proBNP)/A450 (HSA)，并归一化到C12AP对照的比率（设为1.0）。为了评估诱导依赖性，使用相同的ELISA协议检测了非IPTG诱导培养的显示比C12AP更高的比率的变体的粗裂解物。

蛋白质纯化

选定的克隆培养50 mL。细胞沉淀后，重新悬浮在7 mL裂解缓冲液中，并进行超声处理(30%振幅；10秒开启/10秒关闭，持续6分钟)。在13,000 × g、4 °C下离心30分钟收集上清液。用40% w/v硫酸铵沉淀蛋白质，并收集(13,000 × g, 4 °C, 15分钟)，然后重新悬浮在8 mL结合缓冲液(20 mM Tris–HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 35 mM imidazole)中，并通过Ni亲和层析纯化。蛋白质与Ni-NTA珠子(Thermo 25214)在旋转器上(4 °C, 60分钟)孵育，加载到柱子上，用结合缓冲液(10 mL)洗涤，并逐步用60、85和110 mM imidazole洗脱。使用T7启动子和终止子引物从含有scFv的质粒中提取C12AP (D110/Y174)变体并测序(Bionics)。

大肠杆菌BL21 (DE3)中的scFv变体表达

从scFv结构中没有终止子的克隆中提取的质粒通过热休克方法转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。在含有50 μg/mL卡那霉素和0.1% (w/v)葡萄糖的LB肉汤中，37 °C下，220 rpm培养16–18小时，制备含有pSANG14–3F/scFv质粒的起始菌落作为起始物。将1% (v/v)的起始菌落转移到含有50 μg/mL卡那霉素的新鲜LB肉汤中，并增加葡萄糖(1% w/v)，37 °C下培养约3小时或直到600 nm处的吸光度达到0.5–0.7。然后通过7600g离心30分钟收集细胞沉淀，并将其重新悬浮在含有50 μg/mL卡那霉素和0.2 mM IPTG的相同体积的LB肉汤中。在16 °C、180 rpm下表达18小时。随后在7600g、4 °C下离心30分钟，收集过表达的细胞以进一步提取蛋白质。

使用ELISA进行NT-proBNP的亲和力筛选

收获小规模表达的克隆D110–1、D110–2、D110–6、D110–12、D110–17、D110–24、D110–39、D110–40、D110–47、D110–55、D110–57、D110–63、D110–66、D110–72、D110–74、Y174–8、Y174–10、Y174–18、Y174–23、Y174–24、Y174–26和Y174–31的细胞沉淀。通过超声处理裂解细胞，并通过离心获得可溶性组分。使用ELISA评估粗可溶性蛋白质与NT-proBNP的结合，以人血清白蛋白(HSA; Merck)作为阴性对照。NT-proBNP是按照先前描述的方法在内部生产和纯化的。(23)

微孔板(96孔)用NT-proBNP或HSA以10 μg/mL的浓度在100 mM碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液(pH 9.6; 100 μL/孔)中涂覆三份，并在4 °C下孵育15–18小时。去除未结合的蛋白质，用PBS冲洗孔洞，然后用3% (w/v)脱脂牛奶在PBS中于37 °C下封闭1小时。用0.05% PBST冲洗孔洞三次。加入50 μL/孔的粗scFv样品并在37 °C下孵育2小时，然后用0.05% PBST冲洗三次。加入1:1000的anti-His标签一级抗体(1:1000 in PBS; 100 μL/孔)在37 °C下孵育1小时，再用0.05% PBST冲洗孔洞三次，接着加入1:1000的山羊抗小鼠IgG-HRP二级抗体(1:1000 in PBS)在37 °C下孵育1小时。最后用0.05% PBST冲洗一次，加入100 μL TMB底物并在室温下避光显色15–30分钟。用100 μL 1 N HCl停止反应，并在450 nm处测量吸光度。

对于每个变体，结合比率通过ELISA吸光度值计算为R = A450 (NT-proBNP)/A450 (HSA)，并归一化到C12AP对照的比率（设为1.0）。为了评估诱导依赖性，使用相同的ELISA协议检测了非IPTG诱导培养的显示比率大于C12AP的变体的粗裂解物。

蛋白质纯化

选定的克隆培养50 mL。细胞沉淀后，重新悬浮在7 mL裂解缓冲液中，并进行超声处理(30%振幅；10秒开启/10秒关闭，持续6分钟)。在13,000 × g、4 °C下离心30分钟收集上清液。用40% w/v硫酸铵沉淀蛋白质，并收集(13,000 × g, 4 °C, 15分钟)，然后重新悬浮在8 mL结合缓冲液(20 mM Tris–HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 35 mM imidazole)中，并通过Ni亲和层析纯化。蛋白质与Ni-NTA珠子(Thermo 25214)在旋转器上(4 °C, 60分钟)孵育，加载到柱子上，用结合缓冲液(10 mL)洗涤，并用60、85和110 mM imidazole逐步洗脱。最终scFv组分用3 kDa截留装置交换到PBS中，并通过BCA(Thermo 23227)定量。使用HisProbe-HRP(Thermo 15,165)通过Western blot验证纯化的scFv。使用Kruskal–Wallis检验比较选定克隆的表达产量与C12AP的产量，然后使用Dunn的多重比较检验。统计显著性定义为p < 0.05。

使用微尺度热泳法确定scFv变体对NT-proBNP的KD

通过微尺度热泳法(Monolith X, NanoTemper)量化scFv变体与重组NT-proBNP之间的结合亲和力。His标签的scFvs (D110–1、?12、?17、?39、?40、?47、?55、?57; Y174–18、?26)和C12AP(对照)在0.05% PBST中制备成80 nM浓度，与100 nM RED-tris-NTA第二代在0.05% PBST中以1:1混合，并在室温下避光标记30分钟。NT-proBNP(6 μM在0.05% PBST + 0.2% Pluronic)依次稀释到16个浓度。标记的scFv(10 μL)和NT-proBNP(10 μL)混合，孵育10分钟，然后加载到毛细管中，得到20 nM的scFv。测量使用40% LED和中等MST功率。KD值和置信区间是从三次独立实验的数据中得出的(对于D110–55和Y174–26是两次实验)。使用Kruskal–Wallis检验比较平均KD ± SD与C12AP，p < 0.05被认为具有显著性。

分子动力学模拟

使用ClusPro 2.0的蛋白质-蛋白质复合物的初始结构进行分子动力学(MD)模拟。研究了两个系统：突变体D110–57 scFv和野生型C12AP scFv，两者都与NT-proBNP形成复合物。MD模拟使用GROMACS 2025.1软件和GROMOS54A7力场进行。(24) 在每个蛋白质复合物溶解在显式的SPC水分子立方盒中后，加入Na+和Cl–离子以中和系统。系统在NVT(粒子数、体积和温度恒定)和NPT(粒子数、压力和温度恒定)条件下平衡10 ns，然后在能量最小化后以2 fs的时间步长运行10 ns。之后，进行100 ns的生产MD模拟。进行了三次独立模拟。使用均方根偏差(RMSD)、氢键和盐桥分析来评估结构稳定性和分子间相互作用。为了评估C12AP和D110–57 scFv变体与NT-proBNP之间的复合物稳定性和重要分子间相互作用，定义了氢键的供体-受体距离截止值为3.5 ?和角度截止值为30°。使用GraphPad Prism和QtGrace创建和显示图形。

表面等离子体共振成像(SPRi)

将裸露的金SPRi载玻片冲洗后，用95 nM的D110–57、C12和PBS作为参考点点样。每个scFv的五个点在室温下干燥1小时，然后将载玻片安装到Horiba SPRi流体模块中。通过流动含有0.1% HSA的PBS缓冲液来确定两个固定scFv和参考点的面积。在缓冲液基线稳定后，依次注入逐渐增加浓度的NT-proBNP分析物，浓度从0到900 nM。每个浓度以171 μL/min的速度流过固定scFv。在结合阶段之后，流动缓冲液进行至少10分钟的解离时间，或直到建立后续注射的基线。

在完成NT-proBNP结合分析后，获得了新的稳定基线。注射对照蛋白质CNP和ANP的溶液，浓度与NT-proBNP使用的浓度相匹配。保持相同的流速和接触时间，观察传感器图以量化与固定scFv的任何非特异性相互作用。Horiba SPRi软件生成的原始传感器图数据被导出并在TraceDrawer中重新分析，进行基线校正和缓冲液空白扣除。使用1:1结合模型拟合校正后的传感器图，以获得结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。只有符合报告的Chi2值为0和U值低于6.5的拟合才被纳入分析。使用Kruskal–Wallis检验比较ka、kd和KD的平均值和标准差，p < 0.05被认为具有显著性。

使用微尺度热泳法确定scFv变体对NT-proBNP的KD

使用微尺度热泳法(Monolith X, NanoTemper)量化scFv变体与重组NT-proBNP之间的结合亲和力。His标签的scFvs (D110–1、?12、?17、?39、?40、?47、?55、?57; Y174–18、?26)和C12AP(对照)在0.05% PBST中制备成80 nM浓度，与100 nM RED-tris-NTA第二代在0.05% PBST中以1:1混合，并在室温下避光标记30分钟。NT-proBNP(6 μM在0.05% PBST + 0.2% Pluronic)依次稀释到16个浓度。标记的scFv(10 μL)和NT-proBNP(10 μL)混合，孵育10分钟，然后加载到毛细管中，得到20 nM的scFv。测量使用40% LED和中等MST功率。KD值和置信区间是从三次独立实验的数据中得出的(对于D110–55和Y174–26是两次实验)。使用Kruskal–Wallis检验比较平均KD ± SD，p < 0.05被认为具有显著性。

分子动力学模拟

使用ClusPro 2.0的蛋白质-蛋白质复合物的初始结构进行分子动力学(MD)模拟。研究了两个系统：突变体D110–57 scFv和野生型C12AP scFv，两者都与NT-proBNP形成复合物。MD模拟使用GROMACS 2025.1软件和GROMOS54A7力场进行。(24) 在每个蛋白质复合物溶解在显式的SPC水分子立方盒中后，加入Na+和Cl–离子以中和系统。系统在NVT(粒子数、体积和温度恒定)和NPT(粒子数、压力和温度恒定)条件下平衡10 ns，然后在能量最小化后以2 fs的时间步长运行10 ns。之后，进行100 ns的生产MD模拟。进行了三次独立模拟。使用均方根偏差(RMSD)、氢键和盐桥分析来评估结构稳定性和分子间相互作用。为了评估C12AP和D110–57 scFv变体与NT-proBNP之间的复合物稳定性，定义了氢键的供体-受体距离截止值为3.5 ?和角度截止值为30°。使用GraphPad Prism和QtGrace创建和显示图形。

表面等离子体共振成像(SPRi)

将裸露的金SPRi载玻片冲洗后，用95 nM的D110–57、C12和PBS作为参考点点样。每个scFv的五个点在室温下干燥1小时，然后将载玻片安装到Horiba SPRi流体模块中。通过流动含有0.1% HSA的PBS缓冲液来确定两个固定scFv和参考点的面积。在缓冲液基线稳定后，依次注入逐渐增加浓度的NT-proBNP分析物，浓度从0到900 nM。每个浓度以171 μL/min的速度流过固定scFv。在结合阶段之后，流动缓冲液进行解离时间至少10分钟，或直到建立后续注射的基线。

在完成NT-proBNP结合分析后，获得了新的稳定基线。注射对照蛋白质CNP和ANP的溶液，浓度与NT-proBNP使用的浓度相匹配。保持相同的流速和接触时间，观察传感器图以量化与固定scFv的任何非特异性相互作用。Horiba SPRi软件生成的原始传感器图数据被导出并在TraceDrawer中重新分析，进行基线校正和缓冲液空白扣除。使用1:1结合模型拟合校正后的传感器图，以获得结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)。只有符合报告的Chi2值为0和U值低于6.5的拟合才被纳入分析。从三个拟合曲线计算ka、kd和KD的平均值和标准差，并使用t检验进行组间统计比较。数据以平均值±标准差的形式呈现。统计分析在GraphPad Prism软件中通过单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，随后采用Dunnett多重比较（post hoc）检验。差异在p < 0.05时被认为具有显著性。显著性水平分别用p < 0.05（*）、p < 0.01（**）、p < 0.001（***）和p < 0.0001（****）表示。