利用植物氧化酶和代谢工程进行的化学酶促合成方法，能够快速获得稀有的赤霉素类物质

《Journal of the American Chemical Society》：Chemoenzymatic Synthesis with Plant Oxidases and Metabolic Engineering Enable Rapid Access to Rare Gibberellins

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

赤霉素是一类结构复杂的二萜类植物激素，在农业中有广泛的应用。然而，在自然界中已发现的136种赤霉素同系物中，很少有容易获取的，这阻碍了对其生物功能的进一步研究。在生物合成过程中，植物中的氧化酶产生了多种多样的赤霉素氧化模式。与微生物氧化酶相比，植物氧化酶用于化学酶法合成非常具有挑战性。在这里，我们开发了一个基于植物氧化酶的化学酶法和代谢工程平台，能够生产并全面表征八种稀有赤霉素以及16种具有不同氧化模式的ent-kaurene衍生物。丝状真菌稻曲霉（Aspergillus oryzae）被改造为能够高产量地生产常见的赤霉素及其代谢中间体，从而获得了20种二萜类底物。这些底物使用模式植物本氏烟草（Nicotiana benthamiana）的叶片圆盘进行筛选，从中产生了十种不同的植物氧化酶。在200种底物-酶对中，共鉴定出65种化合物。我们将五种反应放大到毫克级别，以生产氧化的二萜类化合物。最后，通过将一种植物氧化酶基因引入稻曲霉，我们还通过代谢工程一步获得了15β-羟基化的赤霉素。总之，我们的工作实现了稀有赤霉素和其他高度氧化二萜类化合物的灵活和可持续合成。更重要的是，我们的工作展示了如何利用植物氧化酶进行化学酶法和全生物合成，这将有助于未来更好地利用这些之前被忽视的酶的催化潜力。

**引言**
赤霉素是强效的植物激素，调节和控制所有维管植物的生长和发育。特别是在花朵和种子的发育、成熟及其萌发过程中，它们在农业和植物科学中具有重要的应用价值。(1,2) 然而，大多数研究集中在这类植物激素的主要代表上，尤其是GA3（通常称为赤霉素酸）、GA4(2)、GA7(3)和GA1(4)（图1），这些成分已经被详细研究并得到广泛应用。(3) 相比之下，目前已知的136种赤霉素中有很大一部分在自然界中的含量很低。(1,4) 由于这个原因，一些次要赤霉素同系物甚至没有完整的核磁共振（NMR）数据。(5?7) 这种稀缺性阻碍了对其生物学特性的深入研究。稀有赤霉素可能在信号传导中发挥特殊作用。例如，直到2015年才发现次要赤霉素GA12(5)实际上是一种长距离运输形式，而不是主要同系物之一。(8,9)

**图1**
图1. 赤霉素是一类由植物、真菌和细菌产生的136种二萜类化合物，作为植物激素发挥作用。虽然少数主要赤霉素已被充分研究，但由于其极低的可获取性，大多数稀有赤霉素尚未得到研究。

为了更全面地研究稀有赤霉素，开发新的方法来获取这些结构复杂的二萜类化合物至关重要。虽然已经采用了全化学合成方法来生产赤霉素，但该方法涉及许多步骤且资源消耗巨大。(10) 例如，Mander对GA4(2)的化学合成需要从高级前体开始进行15个步骤。(11) 一个更有吸引力的选择是采用生物技术生产。赤霉素不仅由植物产生，还由真菌(12)和细菌(13)产生。(13) 植物、真菌和细菌中的赤霉素生物合成途径已经被很好地理解。(1,14) 福氏镰刀菌（Fusarium fujikuroi，即Gibberella fujikuroi）以高产量生产主要赤霉素GA3(1)，但它不是次要赤霉素的良好来源。最近，大肠杆菌和酵母也被改造为能够生产主要赤霉素。(15,16) 以大肠杆菌为宿主时，改造后的途径从有价值的二萜类化合物香叶醇（steviol）开始，而不是简单的碳源如葡萄糖。(15) 以酵母为宿主时，虽然进行了大量改造以提高前体和产物的形成，但未能产生稀有化合物。(16) 赤霉素也可以在体外使用纯化的生物合成酶、辅因子和底物来生产，(17) 但这种方法效率低下，需要大量努力来提供纯化的蛋白质和辅因子。所有这些例子都用于生产少数主要赤霉素，但迄今为止尚未实现目标稀有同系物的（生物）合成。

在这里，我们描述了一个基于植物氧化酶的化学酶法和代谢工程系统来获取稀有赤霉素。首先，我们在丝状真菌宿主稻曲霉NSAR1中创建了一个有效的赤霉素全生物合成平台，获得了包括常见赤霉素、稀有代谢中间体和副产物或旁路产物在内的18种二萜类化合物。然后，我们使用模式植物本氏烟草的叶片圆盘建立了一个筛选系统，测试这18种底物以及两种市售化合物对十种植物氧化酶的作用。我们证明了该系统可以放大到化学酶法合成的规模，生产出毫克的氧化二萜类化合物。总的来说，我们的工作实现了八种稀有赤霉素(5–12)以及16种ent-kaurene衍生物(表S1)的生产和全面表征；更重要的是，它展示了一种有效策略，说明如何利用植物氧化酶进行高效的化学酶法和全生物合成。

**结果**
**在稻曲霉中建立赤霉素生产平台**
我们的首要目标是建立一个能够生产主要赤霉素（如GA3(1)、GA4(2)和GA1(4)及其相关中间体的稻曲霉系统，这可以作为化学酶法修饰的起点，以获取稀有赤霉素(图2)。二萜类化合物ent-kaurene(13)来源于香叶基香叶基二磷酸（GGPP）(14)，它是赤霉素的关键前体，其生物合成途径在植物（例如，产生抗炎化合物oridonin的途径）、(19,20) 细菌（例如，产生抗菌化合物platensimycin的途径）(21) 和真菌(22) 中已被了解。为了确保13的有效生产，我们在稻曲霉NSAR1中表达了三个基因，使用了Lazarus及其同事描述的ptyGS·argB载体(表S2)。(23) 首先，我们从燕麦（Avena strigosa)中克隆了一个编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（tHMGR）的截短版本，将其置于组成型烯醇酶启动子（Peno）下游，以确保萜类前体异戊二烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）的高水平供应。(24) 稻曲霉已经能够以良好的产量合成法尼基二磷酸（FPP）(15)，但GGPP(14)的合成不是组成型的。(25) 因此，我们将F. fujikuroi中的GGPP合成酶基因ggs2克隆到强组成型醇脱氢酶启动子（Padh）下游。在二萜类化合物pleuromutilin的生物合成中也采用了类似的策略。(26) 最后，我们将F. fujikuroi中的双功能ent-copalyl二磷酸合成酶/ent-kaurene合成酶cps/ks克隆到强组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（PgpdA）下游，创建了ptyGS·argB·AstHMGR·ggs2·cps/ks载体。将该载体整合到稻曲霉NSAR1的基因组中后，如预期那样产生了ent-kaurene(13)；ent-copalyl二磷酸（16）也生成了化合物17和18（图2）。比较相应的真菌和细菌萜类环化酶基因发现，所有基因都具有活性，但F. fujikuroi中的cps/ks活性最强，这通过下游代谢产物的生成得到了验证（图S1）。

**图2**
图2. 在稻曲霉NSAR1中开发了赤霉素全生物合成平台。除非另有说明，所示产量均为分离产量，指的是所有含有不同基因组合的转化体中的最大产物水平。所有显示的化合物（FPP (15) 到ent-kaurenoic acid (19) 和 GA7 (3) 除外）都通过NMR和HRMS进行了分离和全面表征（表S1）。GA7 (3) 和 ent-kaurenoic acid (19) 与参考化合物进行了比对。只有黑色标记的化合物随后用氧化酶进行了筛选。稀有赤霉素用红色下划线标出。GGS2：香叶基香叶基二磷酸合成酶2；CPS/KS：双功能ent-copalyl二磷酸合成酶/ent-kaurene合成酶；KO：ent-kaurene氧化酶；DES：去饱和酶；FPP：法尼基二磷酸；GGPP：香叶基香叶基二磷酸。

接下来，我们将ent-kaurene氧化酶（KO）添加到合成途径中。将F. fujikuroi的ko基因克隆到ptyGS·adeA中，创建了ptyGS·adeA·ko（表S2）。将稻曲霉与这个载体和之前的载体共转化后，如预期产生了ent-kaurenoic acid (19)，并且显著减少了之前的旁路代谢产物。然而，观察到了两种新的旁路产物20和21（图2）。这两种产物都通过NMR光谱进行了分离和全面表征。通过将F. fujikuroi中的P450-1克隆到PgpdA下游，创建了ptyGS·adeA·ko·P450-1，实现了P450-1的添加。然后将稻曲霉NSAR1与ptyGS·argB·AstHMGR·ggs2·cps/ks和ptyGS·adeA·ko·P450-1共转化后，合成了第一种赤霉素中间体GA14（6）（分离产量25 mg/L）。P450-1催化一系列氧化和重排反应。(28) 该途径首先通过C-7的羟基化生成7β-羟基-ent-kaurenoic acid (22)，随后发生氧化环收缩和3β-羟基化生成GA14 (6)。然而，这些后续反应不受P450-1的良好控制，还观察到了已知的副产物6β,7β-二羟基-ent-kaurenoic acid (23)（45 mg/L）、GA12 (5)（6 mg/L）、fujenoic acid (24)（20 mg/L）、fujenoic triacid (25)（2 mg/L）以及两种旁路产物26和27，并从该转化体中分离出来。通过将F. fujikuroi中的P450-2克隆到Peno下游，创建了ptyGS·adeA·ko·P450-1·P450-2，生成了GA4 (2)（浓度46 mg/L），同时产生了少量的GA9 (7)（2 mg/L）、GA13 (8)（4 mg/L）和GA36 (9)（2 mg/L）。此外，我们还分离出了少量不寻常的GA14的1,10-二脱氢-20-nor衍生物28（1 mg/L）；这种化合物在自然界中尚未发现，但之前曾被用作赤霉素合成的中间体。(29,30)

第三个载体用于克隆合成GA3(1)所需的最后两个基因（表S2）。将F. fujikuroi中的des基因（编码非血红素铁依赖性1,2-去饱和酶）克隆到ptyGS·sC载体中，得到ptyGS·sC·des。将此载体与前两个载体结合后，获得了GA7 (3)（浓度17 mg/L）。最后，将F. fujikuroi中的P450-3克隆到PgpdA下游，得到ptyGS·sC·des·P450-3，从而获得了途径的最终产物GA3 (1)（浓度27 mg/L）（图S2）。如果不表达des，则合成GA1 (4)（浓度24 mg/L）。总共从稻曲霉菌株中分离出了18种二萜类化合物，数量足够进行全面表征并用作化学酶法的底物。此外，还通过半合成获得了两种化合物香叶醇（29）和异香叶醇（30）（图3），从而得到了20种二萜类化合物作为潜在的化学酶法氧化底物。

**图3**
图3. 在模式植物本氏烟草的叶片圆盘中筛选植物二萜类氧化酶的底物范围。(A) 工作流程示意图。(B) 包含本氏烟草叶片圆盘的24孔板照片。(C) 选择十种已知作用于赤霉素及相关二萜类化合物的植物氧化酶（见表S3）。箭头指示报道的氧化位置。(D) 十种植物氧化酶对20种二萜类底物的叶片圆盘筛选结果。单元格中的数字表示LC–MS观察到的产物数量。颜色表示底物的总转化率（基于所有产物峰的总和）。叶片圆盘筛选的详细结果见图S4–S10、表S4、S5和支持文件1和2。

**使用叶片圆盘平台筛选植物二萜类氧化酶**
有了20种赤霉素及相关二萜类化合物，我们接下来想筛选植物氧化酶，以找到可能导致稀有赤霉素的酶-底物对。这一策略的关键挑战在于，大多数已知作用于二萜类骨架的氧化酶来源于高等生物，特别是植物。(31,32) 植物中最重要的二萜类氧化酶类别是细胞色素P450单加氧酶（CYPs），(31) 它们具有膜锚定结构，这在常见的体外或基于大肠杆菌的筛选系统中是一个严重障碍。(33?35) 直接在稻曲霉中测试基因候选者是可能的，但真菌的转化是一个相对缓慢且通量较低的过程。因此，我们设想了一种基于模式植物N. benthamiana快速瞬时表达能力的植物表达系统（36），结合LCMS分析方法，可以提供一种快速可靠的方式来筛选针对底物库的植物氧化酶（图3A,B）。使用叶片圆盘而不是整片叶子或整个植物还有助于最小化底物消耗。作为概念验证，我们选择了一组十种已知或被认为能够氧化其底物中不同碳原子的二萜氧化酶（图3C）。（20,37?45）这组酶包括六种CYP和四种非血红素铁氧戊二酸依赖性双加氧酶（ODDs）。其中六种酶天然作用于赤霉素，三种作用于其他ent-kaurenes，一种作用于其他二萜（图3C，表S3）。结合20种二萜底物，这组酶构成了200种酶-底物对。我们预期我们的筛选方法将发现以前未描述的酶反应对，并能够获得稀有赤霉素。技术上，目标氧化酶基因在N. benthamiana叶片中进行了瞬时表达（36）。6天后，从转化后的叶片上切下直径为14毫米的单独叶片圆盘，将其单独放置在含有60微克每种测试底物的HEPES缓冲液（500微升）的24孔板孔中（图S3）。对于在pH 7.5的HEPES缓冲液中溶解度低的底物，将缓冲液pH值提高到9.2以提高溶解度，并使用2-3%的甲醇或二甲基亚砜作为共溶剂。将板子在植物培养箱中孵育40小时，然后通过UPLC-MS进行分析。在测试的200种酶-底物对中，有46种组合产生了酶促产物（23%），这些产物在空载体转化的对照叶片圆盘中未观察到（图3D，表S4和S5，图S4–S10，支持文件1和2）。在46种有产物的组合中，有24种产生了一种产物，而在其他情况下观察到了多达七种不同的产物峰（图3D，S9，表S4，支持文件1和2）。只有两种测试的酶，RoCYP76AH22和IrCYP706V6，对任何测试的底物都没有表现出活性。总体而言，这表明我们的叶片圆盘系统提供了一种生产活性植物氧化酶的可靠方法。相反，20种测试化合物中有五种没有被任何酶接受；这些是三种具有断裂环结构的化合物17、18和24，以及完全加工的赤霉素GA3（1）和GA1（4）。从46种有产物的酶-底物对中，共鉴定出91个峰，这些峰与65种独特的代谢物相关（表S4，支持文件1和2）。值得注意的是，91个产物峰中有55个（60%）的质量变化对应于一个或两个氧原子的添加（+16或+32 Da）（表S4，支持文件1和2）。对于30个产物峰（33%），我们观察到+18和+34 Da的质量差异（表S4，支持文件1和2），这表明在叶片圆盘系统中也可能发生非氧化还原过程或与背景酶的进一步反应。

通过分析规模的测定表明，7β-羟基-ent-kaurenoic acid（22）被AtCYP714A1氧化。为了进行制备生物转化，我们从三株表达AtCYP714A1的N. benthamiana植物中收集了大约140个叶片圆盘，并将其与溶解在缓冲液中的7β-羟基-ent-kaurenoic acid（22）（28毫克）一起孵育（图4A）。在相同的条件下孵育6-7天后，但增加了搅拌，取出叶片圆盘，并通过制备HPLC分离反应产物。获得了三种产物：31（1.1毫克）、32（1.6毫克）和26（0.7毫克），以及未反应的底物（10.3毫克）（图4B，S11）。所有产物都通过NMR光谱和HRMS进行了全面表征（表S1）。受这些结果的启发，我们使用6β,7β-二羟基-ent-kaurenoic acid（23）和AtCYP714A1或AtCYP714A2进行了化学酶反应，分别获得了1.9毫克的33和2.2毫克的34。

然后我们用AtCYP714A2叶片圆盘处理GA12（5）（8毫克），结果生成了1.2毫克的二羟基化产物10，该产物通过NMR光谱进行了全面表征。这种稀有赤霉素GA123（10）之前基于GC–MS碎片数据在草莓中被描述过（5），但从未以足够的量分离出来进行完整的光谱表征或生物学评估。使用相同的方法，我们还使用双加氧酶MdDOX-Co和GA14（6）作为底物进行了制备叶片圆盘实验。从25毫克的GA14（6）中，重新分离出了7.6毫克的未反应底物，并获得了1.5毫克的12α-羟基化产物11。其结构通过2D NMR光谱被确认为GA74（11）。GA74之前已在植物中鉴定过，但仅通过MS碎片数据（46?48），之前从未以制备量分离出来。GA74的相应二甲酯11a的NOE光谱证实了最初对12-羟基的临时分配（46,48），特别是基于NOESY相关性H12–H17a（图4C）。最后，我们还测试了GA14（6）与AtCYP714A2的转化；分离出了少量的产物（<0.5毫克），根据1H NMR数据暂时将其鉴定为GA18（图S12，表S6）。这些结果清楚地表明，叶片圆盘系统能够实现植物膜结合酶的化学酶反应的制备规模生产。

最后，我们研究了是否可以利用我们的酶筛选信息来扩展A. oryzae的赤霉素生产平台，以实现单一过程中稀有赤霉素的合理生产。为此，我们选择了IrCYP706V7，因为我们在叶片圆盘系统中观察到了非常好的转化产率。首先，我们通过将相应基因引入一个产生ent-kaurenoic acid但不包含进一步转化为赤霉素所需的P450-1和P450-2的菌株中，确认了IrCYP706V7在A. oryzae中的活性。还包含了一个编码细胞色素P450还原酶AtCPR1（49）的基因作为氧化还原伙伴。实际上，这导致形成了15β-羟基-ent-kaurenoic acid（35）作为主要产物，其浓度为63毫克/升（图S13）。接下来，为了获得稀有的15β-羟基化赤霉素，我们生成了一个含有IrCYP706V7、P450-1和P450-2的A. oryzae菌株（图5A）。与仅含有P450-1和P450-2但没有IrCYP706V7的菌株相比，出现了几个新的峰，但水平相对较低（图5B）。获得了与没有IrCYP706V7时相同的主要产物，如GA4（2）。只观察到一个新的明显峰，被鉴定为7β,15β-二羟基-ent-kaurenoic acid（36）。P450-1催化一个多步骤反应级联，首先涉及7β-羟基化，然后是B环的收缩、3β-羟基化和C-7氧化（28）。我们系统中7β,15β-二羟基-ent-kaurenoic acid（36）的积累表明，15β-羟基的存在阻碍了P450-1反应级联在初始7β-羟基化后的进一步进展（图5A）。特别是由于与天然优势中间体7β-羟基-ent-kaurenoic acid（22）的竞争，15β-羟基化赤霉素的生成效率较低。尽管如此，添加IrCYP706V7后出现的多个新峰表明P450-1和P450-2原则上能够接受15β-羟基化中间体。实际上，我们成功分离并完全表征了其中一种产物，15β-羟基-GA12（12）（表S1）。还鉴定出了五种其他微量存在的15β-羟基化赤霉素：15β-羟基-GA14（37）、GA45（38）、GA63（39）、GA64（40）和GA65（41），这是根据它们的GC–MS碎片模式与文献数据比较得出的（图S14，表S5）。在GA65（41）的情况下，我们分离出了足够的材料以获得1H光谱，显示了一个醛质子（图S15），支持这一分配。除了7β,15β-二羟基-ent-kaurenoic acid（36）外，还分离并表征了四种额外的15β-羟基化ent-kaurene衍生物42、43、44和45（表S1）。

作为解决15β-羟基化中间体与非羟基化中间体之间竞争困境的潜在方案，我们还测试了一种生物转化策略。为此，我们将分离出的15β-羟基-ent-kaurenoic acid（35）添加到含有P450-1和P450-2基因但不含生成ent-kaurenoic acid（19）所需上游途径的A. oryzae菌株中（图5A）。令人欣慰的是，含有IrCYP706V7的菌株中的新峰以及在添加15β-羟基-ent-kaurenoic acid（35）后具有完整赤霉素途径的菌株中也出现了这些新峰，但强度更大（图5B）。在这些条件下，化合物35被完全消耗。这些结果表明，这种生物转化方法可以在A. oryzae中借助代谢工程获得15β-羟基化赤霉素。

讨论：单个植物物种通常包含数百种不同的CYP（50）。这些氧化酶已经进化成为生成结构多样的复杂天然产物（包括二萜）的关键因素（31）。然而，到目前为止，它们用于酶筛选和化学酶合成的可行性受到了严重限制。植物CYP最具挑战性的方面是它们是膜结合的（51），这阻碍了它们在简单原核宿主（如大肠杆菌）或无细胞系统中的生产（34）。因此，以前成功筛选并应用于天然产物化学酶合成的氧化酶（52?55）的工作必须限于微生物CYP和其他类别的氧化酶（56），从而忽略了植物氧化酶的巨大生物催化潜力。为了解决植物CYP潜在有用性但缺乏合适筛选系统的这一未解决的问题，我们在这里提出了一种基于N. benthamiana叶片圆盘的系统，在该系统中目标氧化酶直接在体内产生。值得注意的是，在测试的十种二萜氧化酶中，有八种对20种测试底物中的一种或多种表现出活性。两种对测试底物没有活性的氧化酶是RoCYP76AH22和IrCYP706V6。虽然之前已经证明RoCYP76AH22广泛作用于属于abietane、labdane和pimarane类的二萜骨架，但该酶对ent-kaurenes没有活性（43,57）。因此，我们的数据表明RoCYP76AH22先前报道的广泛底物谱并不包括ent-kaurene二萜。另一方面，据报道IrCYP706V6可以羟基化ent-kaurene（20），因此该酶对测试底物组的完全无活性让我们感到惊讶。为了验证这不是由于我们的表达系统故障造成的，我们进行了一个控制实验来原位生产ent-kaurene；实际上，这个实验证实了在N. benthamiana中产生的IrCYP706V6原则上是有活性的（图S16），只是不接受更高氧化状态的ent-kaurene衍生物。总体而言，数据表明我们的叶片盘筛选平台是一种非常可靠的方法，可以生成活性植物氧化酶，且实验工作量很小。在测试的20种底物中，有15种至少被其中一种酶转化，这表明底物在叶片盘中的吸收和转化效率总体上是高的。未被转化的三种底物（化合物17、18和24）具有破坏性的环系统，这可能是它们未被转化的原因。另外两种未被转化的化合物是赤霉素GA3（1）和GA1（4），它们已经是我们的测试体系中功能化程度最高的底物。由于使用了培养皿中的叶片盘格式，这些实验所需的底物量相对较少：每种待测酶只需要0.2毫克的底物即可进行三次重复实验。我们还证明了该系统可以轻松扩展到8-50毫克的底物规模（图4B）。

与传统的单一宿主方法相比，我们的叶片盘筛选平台具有三个主要优势（图6）：首先，作为植物宿主，N. benthamiana在评估植物氧化酶活性方面比微生物宿主更为可靠。实际上，尽管IrCYP706V7在A. oryzae中表现出很好的活性（图5，S13），但其他氧化酶的情况并非如此；对于AtCYP714A2，我们在A. oryzae中观察到的活性远低于N. benthamiana（图S17），而对于MdDOX-Co，在真菌宿主体内则完全没有活性（图S18）。其次，在N. benthamiana中进行筛选的速度明显快于在A. oryzae中。即使使用了外源载体，真菌转化过程本质上也比在N. benthamiana中的瞬时表达慢（图S19）。第三，使用分离的底物进行筛选可以提供一个非常清晰的背景，有助于准确识别酶的活性。这与在原始宿主菌株中直接筛选的情况形成鲜明对比，在原始宿主菌株中，共存的途径中间体和旁路产物会导致峰的重叠以及竞争性途径，从而掩盖了内在的酶活性（图S20）。尽管如此，正如我们对IrCYP706V7的结果所示，叶片盘筛选结果是一个很好的起点，可以据此决定哪些酶值得重新整合到微生物宿主体中。因此，我们的叶片盘筛选方法并不是替代单一宿主体内全生物合成的方法，而是一种从更大范围中选择最合适的氧化酶的补充策略（图6）。

图6：与传统单一宿主策略相比，这里介绍的叶片盘筛选平台的战略优势。

我们成功应用了叶片盘系统，通过化学酶法合成了七种二萜类化合物，其中包括两种稀有的赤霉素，产量在0.7到2.2毫克之间（图4B）。考虑到大多数赤霉素（少数主要例外）都是极其稀有的天然产物，我们在系统中获得的产量与现有方法相当，在许多方面甚至更优（图S21，表S7）。例如，微生物发酵虽然对于常见的赤霉素具有更高的时空产量，但尚未能够获得稀有赤霉素（图S21A）。与从植物中分离相比，我们的叶片盘化学酶法反应的特定产量大约高出100-1,000,000倍（图S21B）。全合成和半合成的总产量可以相媲美，但后者基于多个劳动密集型和资源密集型的步骤，而不仅仅是单一的清洁生物转化（图S21C）。我们的系统对于获取非常稀有的赤霉素和二萜类化合物的相关性还体现在，我们通过化学酶法合成的七种二萜类化合物中有五种以前从未获得过足够的量进行完整的核磁共振（NMR）表征。尽管如此，未来仍需进一步改进以提高该系统的效率和产量，使其更通用，并适用于不太稀有的天然产物。一个问题是底物的转化率总体较低；对于所有测试的反应，至少有21-37%的底物未被消耗，可以重新分离出来。一个可能的生化原因是我们使用了非天然底物，这些底物可能转化得更慢。另一种解释可能是切下的叶片盘会随时间失去活力，这可能导致CYP活性所需的NADPH供应不足或活性蛋白因蛋白降解而损失。分离产物的数量较少也可能部分归因于最终色谱处理过程中的损失。由于我们的叶片盘含有植物背景酶，来自这种体内系统的不必要的旁路反应也可能降低产物产量，但在我们的实验中，我们没有观察到由不希望的背景反应（如糖基化）引起的显著峰。在筛选过程中我们注意到的另一个限制是底物在水溶液体系中的溶解度要求。可以容忍少量（2-3%）的甲醇或二甲基亚砜作为共溶剂，但浓度更高则不行。尽管存在这些限制，我们仍然认为我们的叶片盘筛选平台将有助于使植物和其他真核生物中的氧化酶更易于用于生物催化应用，从而扩大可用于化学酶法合成的酶的范围（图6）。

到目前为止，最常用的异源生产二萜类化合物的宿主生物之一是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（16,42,43,59,60）。然而，在S. cerevisiae中获得的氧化二萜类化合物的产量通常低于10毫克/升，这通常是由于许多植物CYP在酵母中的活性较低。虽然植物应该为CYP活性提供更好的环境，但在N. benthamiana等植物中高水平生产二萜类化合物仍然具有挑战性（61,62），尽管通过将二萜类生物合成酶从质体转移到细胞质中，利用甲瓦龙酸途径的更高碳通量已经取得了重大改进（63）。尽管仍然相对罕见，但有几个例子表明，像A. oryzae这样的丝状真菌可以是生产二萜类化合物的更优替代宿主（26,64-68），我们的数据也支持了这一点。在我们的工作中，使用来自植物的截短HMGR有助于通过甲瓦龙酸途径实现高碳通量。此外，观察到真菌CYPs P450-1和P450-2以及植物CYP IrCYP706V7具有很好的活性，而许多其他宿主生物在为CYPs提供足够的电子或正确处理膜结合酶方面存在困难（69）。尽管如此，我们观察到一些旁路产物，表明仍有很大的改进潜力；我们预计，通过靶向基因删除等方法识别并失活参与旁路产物形成的酶，可以进一步提高A. oryzae中的二萜类化合物产量。尽管如此，我们的A. oryzae菌株在没有进行大量菌株工程改造的情况下，其GA3、GA4和GA7的产量已经超过了之前在酵母中获得的水平（16）。更重要的是，这种方法使我们能够获得多种商业上不可获得的稀有赤霉素。我们认为，这种对稀有赤霉素的更好获取将促进进一步的研究，以更好地了解它们的生物学意义并评估其在农业应用中的潜力（70）。

在这项工作中，我们使用化学酶法合成和植物氧化酶以及代谢工程，在丝状真菌A. oryzae中生产了八种稀有赤霉素和16种氧化的ent-kaurene衍生物。这些一步或两步过程在产生这类代谢物方面显著优于全化学合成（71）。通过提高稀有赤霉素的可用性，现在可以进一步研究这些复杂二萜类化合物在植物激素信号传导中的生物学作用，并寻找新的农业应用。更一般地说，我们的工作展示了如何利用植物中的氧化酶而不仅仅是微生物中的氧化酶来进行酶筛选和化学酶法合成。因此，这将有助于未来利用植物氧化酶的多样性进行生物催化。