《Journal of Insect Physiology》：InsectMotion – A Python-based tool for quantification of neuropeptide-induced organ contractions in arthropods
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马泰·梅德拉（Matej Medla）|范达·克洛克勒罗娃（Vanda Kl?cklerová）|艾玛·布乔娃（Emma Buchová）|丹尼尔·奇兹马尔（Daniel ?i?már）|拉迪斯拉夫·罗勒（Ladislav Roller）|杜尚·日特尼亚恩（Du?an ?itňa
马泰·梅德拉（Matej Medla）|范达·克洛克勒罗娃（Vanda Kl?cklerová）|艾玛·布乔娃（Emma Buchová）|丹尼尔·奇兹马尔（Daniel ?i?már）|拉迪斯拉夫·罗勒（Ladislav Roller）|杜尚·日特尼亚恩（Du?an ?itňan）
斯洛伐克科学院动物学研究所，布拉迪斯拉发，斯洛伐克
摘要
InsectMotion是一款基于Python的工具，用于分析节肢动物运动或肌肉收缩的视频记录。它提供了一种简单、快速且自动化的半定量运动评估方法，通过测量“像素活动”来实现，像素活动定义为像素强度或颜色的变化。与许多现有方法不同，它不需要专门的设备、化学试剂或昂贵的软件。该应用程序可以区分感兴趣区域（ROI）内的活跃像素和非活跃像素，并量化它们在定义时间段内的变化。InsectMotion提供了两种分析模式：图形分析和像素活动分析，这两种模式都适用于各种实验设置。图形分析可以生成像素活动的时间分辨图、数值输出和峰值分析。通过免疫组化技术，我们在家蚕（Bombyx mori）的消化和生殖器官的神经支配中检测到了类似降钙素的利尿激素（Bom-CT-DH）和肌抑制肽（Bom-MIPs）。体外实验结合InsectMotion技术量化了这些组织中由神经肽引起的收缩。
该工具还应用于Ixodes ricinus的初步运动分析，表明其在鳞翅目模型之外的应用潜力。我们的数据表明，InsectMotion是神经生物学和生理学研究中一种可靠且易于使用的工具。
引言
节肢动物是地球上数量最多、种类最丰富的生物群体，在生态系统中扮演着重要角色，从共生物种到寄生物种都有。了解它们的生理学对于制定保护策略或减轻病原体传播疾病至关重要。大多数研究集中在诸如摄食、生长、蜕皮、繁殖和行为等生物功能上（Campli等人，2024年；Gilbert，2011年；?imo等人，2014年）。这些研究通常涉及生理或行为测定，以监测和记录各种器官或实验动物的活动。然而，对这些记录的实验后分析可能非常耗时，且往往仅限于定性观察或一般描述。
在昆虫和其他节肢动物中，大多数生理过程都与特定的行为相关，这些行为由信号分子（如激素和神经肽）调节。这些生物活性分子控制着摄食、排泄、蜕皮和繁殖过程中的器官收缩和/或运动（LaJeunesse等人，2010年；Daubnerová等人，2021年；?itňan等人，2007年）。已经鉴定出几种与内脏肌肉活动相关的昆虫神经肽，包括类似降钙素的利尿激素31（CT-DH31）、肌抑制肽（MIPs）和FMRF酰胺相关肽，这表明这些神经肽在节肢动物生理学中具有保守的作用（Matsumoto等人，2019年；Coast等人，2001年；Zandawala，2012年；TeBrugge等人，2008年；?i?már等人，2019年；Kim等人，2006b年）。
可靠的记录和对行为运动或器官收缩的定量评估对于检测在特定发育阶段由于神经肽局部释放或激素水平变化而发生的微妙生理变化至关重要。节肢动物的肌肉活动最常用的量化方法是肌电图（EMG），自20世纪中叶以来，EMG已在昆虫神经生理学中得到广泛应用（Pringle，1939年；Pringle，1949年；Roeder，1951年）。EMG能够提供高度量化的电信号输出，广泛用于检测各种模型物种的肌肉活动（Yoshida等人，2023年；Hermanson和Altenbach，1981年；Vo-Doan等人，2022年；Pflüger和Duch，2011年）。然而，EMG无法直接可视化肌肉收缩，需要侵入性电极，并且通常需要专门的设备。除了EMG之外，还有其他常用的设备和技术在节肢动物生理学研究中得到应用。力传感器常用于测量肌肉输出，而高速视频分析则可以在不进行侵入性操作的情况下提供动态运动的见解（Owaki等人，2023年）。光学跟踪系统也允许非侵入性地观察运动模式，提供补充数据，增强我们对节肢动物行为和生理学的理解（Mathis等人，2018年；Bailoo等人，2010年）。因此，需要更简单、更易获取的工具来使用计算方法量化运动和行为。
为了填补这一方法学空白，我们创建了InsectMotion，这是一个基于视频的简单易用的实验后工具，专门用于定量昆虫和其他节肢动物在时间和空间上的肌肉收缩和细微器官运动。该工具通过将视频转换为灰度图像并检测随时间变化的像素强度（像素活动）来量化这些运动。活跃的像素代表收缩或运动，而静态背景像素的强度随时间不变。InsectMotion适用于两种互补的基于感兴趣区域（ROI）的分析方法：（i）图形分析可以量化选定ROI内随时间的收缩强度；（ii）像素活动分析可以可视化运动模式。扩展版本InsectMotion_ext包括改进的像素活动分析，其中活跃像素用红色标记，从而突出显示大规模运动。这两个版本都是开源的，可通过GitHub免费获取。我们之前的研究表明，类似降钙素的利尿激素31（Bom-CT-DH31）和肌抑制肽（Bom-MIPs）调节家蚕（B. mori）雄性生殖道的收缩（?i?már等人，2019年）。我们使用原位杂交（ISH）和免疫组化技术确认了这些神经肽存在于支配幼虫和成虫后肠以及雄性生殖系统的神经元中。为了扩展我们的功能分析，我们测试了I. ricinus中的类似降钙素的利尿激素34（Ixr-CT-DH34）（Roller等人，未发表数据），该激素最初在相关的蜱虫I. scapularis中被描述（Christie，2008年），其与Bom-CT-DH31具有高度同源性。Bom-MIP-1被用作代表性的肌抑制肽（Roller等人，2008年）。利用InsectMotion，我们展示了Ixr-CT-DH34在所有研究的B. mori组织中的强烈刺激作用以及Bom-MIP-1的强烈抑制作用。此外，我们还能检测并记录培养皿中成年蜱虫的运动。我们的数据表明，InsectMotion适用于研究不同节肢动物系统的运动和生理过程，并强调了基于视频的像素分析作为EMG的敏感、用户友好的补充工具的潜力。
章节片段
实验动物
B. mori（L.）的N4品系和I. ricinus蜱虫都在斯洛伐克科学院动物学研究所的繁殖设施中饲养。实验按照斯洛伐克科学院生物医学研究中心和斯洛伐克共和国国家兽医和食品管理局批准的动物使用协议进行（设施编号SK U CH01016，许可编号3954/19–221和292/16-221k）。
B. mori（L.）的N4品系是
结果
我们使用ISH确定中枢神经系统（CNS）中Bom-CT-DH31的表达情况，随后使用针对CT-DH31、CCH1、RFamide和MIP-1的抗体进行双重免疫组化染色（见表2），以识别所有CT-DH31神经元并绘制它们在后肠和雄性生殖腺上的轴突投射图（图1A,B；2A,B）。
讨论
我们开发了一种新的基于Python的工具InsectMotion，为量化昆虫和其他节肢动物各器官和组织的收缩及运动行为提供了一个多功能平台。该工具在体外（使用B. mori组织进行收缩测定）和体内（通过追踪I. ricinus雄性蜱虫的行走行为）中均得到了成功验证。这些测试共同证明了其在不同生物学应用中的广泛适用性。通过整合基于ROI的图形分析
CRediT作者贡献声明
马泰·梅德拉（Matej Medla）：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据管理、概念化。范达·克洛克勒罗娃（Vanda Kl?cklerová）：撰写——审阅与编辑、可视化。艾玛·布乔娃（Emma Buchová）：方法学。丹尼尔·奇兹马尔（Daniel ?i?már）：可视化、数据管理。拉迪斯拉夫·罗勒（Ladislav Roller）：撰写——审阅与编辑、可视化、资源获取、资金筹集、正式分析。杜尚·日特尼亚恩（Du?an ?itňan）：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金筹集、正式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了斯洛伐克资助机构的支持：APVV-21-0431、APVV-23-0168、VEGA-2/0070/23、VEGA-2/0037/23和TUBITAK-2024-01。马泰·梅德拉（Matej Medla）是?tefan Schwartz支持基金2025/OV2/018的获得者。
